一、X期鸡胚简易体外培养方法的探索（论文文献综述）
张宏鹏[1]（2016）在《新型慢病毒包装方法及转基因鸡生物反应器研究》文中指出近十几年来,转基因鸡的制备在人们的不懈努力下,取得了长足的进步。这一领域之所以能被人们广为关注,不仅仅因为鸡是一种理想的模式动物,更为重要的是转基因鸡可以改造成为高效生产人源药用蛋白的生物反应器。禽输卵管生物反应器比传统工业反应器和哺乳动物细胞生物反应器更加高效而廉价已经成为业界的共识。这也使转基因鸡的研究成为科研领域的一大热点和生物制药行业发展的新方向。由于鸡胚胎发育的特殊性,在转基因鸡生物反应器的制备中必需使用有别于哺乳类动物生物反应器的特殊手段。目前看来,使用慢病毒载体制备转基因鸡是最可靠的实验方法。但是由于传统慢病毒包装方法的巨大缺陷,以及鸡胚注射和后续筛选中存在的诸多问题,使得成功制备转基因鸡生物反应器的案例仍然较少被报道。在本实验的第一部分中,我们使用了以聚乙烯亚胺（PEI）为转染介质,以聚乙二醇6000（PEG6000）为离心浓缩介质的慢病毒生产方法,并对浓缩后的慢病毒进行滴度测定。此外也对可能影响慢病毒滴度的几个关键因素如转染初始细胞数、N/P、转染质粒DNA量、佐剂的选择等的作用进行了分析。实验结果说明在使用15cm培养皿生产慢病毒的条件下,转染质粒DNA总量10.5μg,N/P=20,PEI浓储液pH7.0-9.0,转染时293T细胞数0.5-2×107时,可以获得较好的慢病毒滴度。PEI作为一种新的转染试剂,可以替代磷酸钙和脂质体用于高滴度慢病毒的生产。在第二和第三部分中,我们通过对现有鸡胚开窗注射方法诸多细节的不断优化,以及后续的一系列检测手段,最终成功获得生殖腺嵌合型转基因鸡。实验结果说明,通过封口方式、封口膜种类、胚胎穿刺位置、开窗操作时间、开窗后的液封处理、防止污染的措施等方面的改进,我们将开窗注射孵化率提高到了 55%。在出雏个体中,转基因嵌合型个体所占比例提高到了 41.8%。在对所获得的31只嵌合体鸡进一步筛选后,我们最终获得了 4公4母共8只生殖腺嵌合型转基因鸡。综上所述,本实验研究表明,PEI作为一种新的转染试剂,可以替代磷酸钙和脂质体用于高滴度慢病毒的生产。与二者相比,PEI具有更低的操作门槛和更高的性价比,从而具有很高的使用价值,在未来一定具有广阔的使用前景。同时本实验也详细介绍了一套完整的制备转基因鸡输卵管生物反应器的方法,希望对广大科研人员有所帮助。
李艳[2]（2013）在《脂质体转染制备转基因鹌鹑的研究》文中研究说明转基因禽类具有广泛应用前景，比如可以作为医用动物模型和生物反应器。目前，制备转基因家禽的方法有电转染法、反转录病毒法和脂质体转染法。经过分析各方法优缺点，拟采用脂质体转染胚盘细胞的方法探讨制备转基因鹌鹑的可行性，初步构建转基因鹌鹑的模型，为寻求制备转基因鹌鹑的最佳方法提供实验依据和基础。具体实验结果如下：（1）通过胚盘下腔注射的方法将经脂质体包裹的外源质粒pEGFP-C2转染胚盘细胞，质粒与脂质体lipofection-2000的最适包装比为1:2.5（μg:μL），在此浓度下，进行凝胶阻滞电泳质粒不会从脂质体中溢出。经过对胚盘进行甲醛固定操作，观察到注射的溴酚蓝存在于胚盘下腔中。（2）将处理后种蛋入孵到第6天，取出胚胎，经基因组PCR验证，检测到胚胎组织中存在pEGFP-C2质粒。说明本实验的注射方法可以将外源DNA注射入X期鹌鹑胚盘下腔中，并成功转染胚盘细胞。（3）对转基因后代的验证结果表明1只7日龄G0代鹌鹑的内脏组织中检测到肌胃和腺胃中有外源基因表达，测序结果与原序列比对正确；1只成年G0代转基因母鹌鹑的部分内脏组织中表达了绿色荧光蛋白；2只G0代转基因鹌鹑的外表可观察到绿色荧光蛋白的表达；3只G0代转基因鹌鹑分别与野生型鹌鹑杂交其后代遗传外源基因的阳性率分别为33.96%，20.59%，10%，3只G0代转基因鹌鹑之间进行杂交其后代遗传外源基因的阳性率分别为10.87%，42.86%。综上所述，通过脂质体转染方法将外源DNA导入鹌鹑的胚盘下腔，可成功制备转基因鹌鹑个体；通过杂交分析，得到转基因G1代，说明转入的目的基因可以遗传给后代。
赵丽玲[3]（2013）在《慢病毒载体精子介导法生产转基因鸡研究》文中提出本研究探索并建立基于慢病毒载体精子介导法高效制备生产转基因鸡的技术体系。构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体和慢病毒表达载体,并对293T细胞进行转染分析对比。用慢病毒感染原代培养细胞鸡生殖细胞和鸡胚小肠上皮细胞,并用实时荧光定量PCR对感染慢病毒的细胞进行目的基因检测。用性成熟公鸡生殖器官组织做切片后,运用微创手术方法,将以绿色荧光蛋白为报告基因的慢病毒载体连续导入性成熟公鸡睾丸,进行精液检查,观察到精子中绿色荧光的表达后,进行人工授精、种蛋孵化,以期在鸡胚和小鸡中检测到目的基因。研究结果：成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体PcDNA3.1-GFP和慢病毒表达载体并在293T细胞中表达。用慢病毒感染的细胞进行实时荧光定量PCR检测结果：293T细胞感染复数最高,达6.08×107TU/mL;鸡胚小肠上皮细胞5.36×105TU/mL;鸡胚生殖细胞0.84×102TU/mL。用性成熟公鸡生殖器官组织切片,观察公鸡睾丸实质由细精管组成呈网状,适合睾丸注射。应用微创手术法将慢病毒载体连续导入性成熟公鸡睾丸中,在精子中检测到了绿色荧光,将表达绿色荧光的精子体外授精,授精蛋进行孵化,并在第一代转基因鸡中检测到外源基因绿色荧光蛋白的表达。
燕海峰[4]（2009）在《病毒载体介导家鸡多能细胞系的转基因技术研究》文中认为为建立家鸡的高效基因转移技术,本文从种蛋开窗技术的改进、用慢病毒表达载体将绿色荧光蛋白（GFP）基因转染种蛋内囊胚细胞和原生殖细胞、逆转录病毒载体转染睾丸细胞、人促红细胞生成素（hEPO）基因家鸡输卵管组织特异性表达载体的构建等方面进行了研究,结果如下:1改进了种蛋开窗工具、开窗方法以及封口方法,使该方法更简单实用,制作效率提高了2倍以上,便于在实践中推广应用,并已申报国家发明专利（申请号CN200710034253.0,公开号CN101020898）。为解决目前因外源基因的随机整合,需要大量实验样本才能使转基因家鸡研究获得成功等问题奠定了基础。2家鸡种蛋自身含有禽胚胎干细胞（BCs）或原生殖细胞（PGCs）。采用Gateway技术构建了含绿色荧光蛋白（GFP）基因的pLenti6/v5-DEST-GFP慢病毒表达载体,转染体外培养的BCs,获得了约70%的表达效率。转染体内囊胚,孵化13d时,PCR检测阳性率为64.7%。转染血液循环中的PGCs:孵化率为35.0%,在出壳后死亡的3只小鸡肝脏中,GFP基因检出率为100%,其中一只小鸡的眼部能检测到绿色荧光;存活的4只鸡中有3只在12月龄的血液样品中,经PCR检测扩增出了GFP基因片段。3睾丸生精上皮内含有二倍体的精原干细胞,将这些细胞在体外转染,然后移植入经不育处理的受体公鸡睾丸,使其恢复生精能力并产生转基因精子,是家鸡基因转移的一种新方法。本文构建了含GFP基因的pLG逆转录病毒载体,滴度达到5×107 IU/mL,转染了体外培养的睾丸细胞,转染后培养到5 d时,流式细胞仪检测GFP基因的表达率为37.0%,碘化丙锭（PI）染色检测出的细胞活力达99.7%,而且整合的前病毒CpG甲基化程度相当低。转染后的睾丸细胞移植到7只经不育处理的公鸡睾丸,其中2只在2-3个月恢复了生精能力,经PCR扩增证实其产生的精子中含有转基因。4外源基因仅在输卵管组织中特异表达是家鸡转基因技术所追求的目标。从鸡输卵管基因组DNA中扩增出1.3kb的OV（卵清蛋白）基因5’端调控区,作为家鸡输卵管组织特异性表达启动子。从phEBS-HB质粒扩增出了2.1kb的hEPO（人促红细胞生成素）基因全长DNA片断,作为目的基因。为方便EPO的检测,构建了含hEPO和GFP的共表达载体pOV-GFP-hEPO。通过测序和转染体外培养的家鸡输卵管上皮细胞,证实载体构建正确并能表达。
孙小美[5]（2008）在《鸡胚中RNAi方法的建立及其在鸡DMRT1基因功能研究中的初步应用》文中提出本研究围绕种蛋的开窗、干扰载体转染鸡胚以及干扰效果的检测三个方面在鸡胚模型中成功建立了RNAi技术,并使用该技术对鸡的性别决定候选基因之一DMRT1基因功能进行了初步研究。研究结果如下:1.利用5日龄鸡胚的成活率为指标,以正常孵化组（组1）为对照,比较机械开窗（组2）、盐酸腐蚀不去壳膜（组3）和去壳膜（组4）三种处理对鸡胚的影响,结果表明机械开窗组鸡胚的成活率最低,仅14.29%;盐酸腐蚀开窗后去壳膜组孵化率最高,达77.27%:机械开窗组与其他三组比较,所得的5日龄成活率较其他三组差,差异极显着(|U|＞U0.01);同时盐酸腐蚀开窗的方法与正常组成活率相比差异不显着;盐酸腐蚀开窗后去壳膜和不去壳膜组之间的差异不显着(|U|＜U0.05)。结果表明,盐酸腐蚀开窗的方法能有效地降低开窗处理对种蛋的影响,是一种安全、有效的方法开窗方法。2.通过比较电穿孔转染、脂质体介导、直接注射三种将空载干扰质粒转染鸡胚的方法,结果表明电穿孔转染法所得的成活率比其他两种方法的成活率低,差异极显着(|U|＞U0.01),其他两种方法所得的成活率之间的差异不显着(|U|＜U0.05);电穿孔法所获得的转染率明显高于其他两种方法(|U|＞U0.05),其他两种方法间的转染率差异不显着(|U|＜U0.05)。同时,我们发现通过卵黄囊血管注射法,干扰载体在鸡胚的头部、体节中部及尾部均有表达、我们推测载体可能会通过血液循环到达鸡胚其他组织器官;电穿孔方法处理时,载体的表达部位仅局限于两根电极所在的部位。本研究综合各种情况,采用电穿孔法将干扰载体转染鸡胚,但卵黄囊血管注射的方法将干扰载体转染鸡胚可以作为一个很好的转染方法用于以后的试验。3.将空载干扰质粒转染鸡胚后,在不同时间段取出检测绿色荧光蛋白的表达情况。本试验分别在转染后6h-120h（每次间隔6h）在活体成像系统中检测绿色荧光蛋白的表达情况。最终确定转染12h后绿色荧光蛋白就开始表达,至转染后120h时还有荧光蛋白表达,且转染48h后,质粒的表达率最高。4.以DMRT1基因为目标,验证上面建立的鸡胚中RNA干扰方法的效果。首先构建了针对DMRT1基因的RNA干扰载体,并采用上述的开窗方法及转染方法将构建的干扰载体转染孵化72h（3日龄）的鸡胚中,收集转染后48h（5日龄）、72h（6日龄）、96h（7日龄）及120h（8日龄）有荧光蛋白表达的活胚,经性别鉴定后,分别选取上述时间段雌、雄鸡胚各三枚（相应的正常组鸡胚）,提取全胚的RNA,并反转录为cDNA,用RT-PCR方法分析雄性鸡胚中DMRT1基因和AMH基因以及雌性鸡胚中DMRT1基因和CYP19A1基因的表达情况,结果表明:转染干扰质粒后,雄、雌鸡胚中DMRT1基因的表达水平均有下降,雄性鸡胚中AMH基因在6日龄以后的表达量与正常组相比有增加的趋势,同时各个日龄段雌性鸡胚中的CYP19A1基因的表达水平较正常组的高。本研究成功建立了鸡胚中RNA干扰方法,可以用于后续性别决定和性别分化相关基因功能的研究。同时,本研究建立的种蛋开窗方法将为鸡胚的卵内操作提供更多的便利。
徐国正,张文昌,庄益芬,张丽,李明,祁喜可[6]（2007）在《禽类胚胎体外培养的研究进展》文中指出
徐国正,张文昌,庄益芬,张丽,李明,祁喜可[7]（2007）在《禽类胚胎体外培养的研究进展》文中指出
徐国正[8]（2007）在《鸭体外受精和胚胎移植的研究》文中提出近几年来，禽类胚胎体外培养技术日臻完善，禽类胚胎在胚胎学、生物学、遗传学、药物毒理学、生命科学等的研究中日益发挥着重要作用，因此禽类胚胎体外培养技术具有很强的实践意义。关于鸭体外受精、胚胎移植研究成果至今未见报道。本实验从以下几个方面进行研究：1鸭胚胎代用蛋壳培养及异体胚盘移植采用两种方法对鸭胚胎进行体外培养：方法Ⅰ，将新鲜种蛋的胚胎转移至待用蛋壳Ⅰ内培养，72h后转移至待用蛋壳Ⅱ内培养至出雏。方法Ⅱ，将正常孵化72h后的胚胎转移至代用蛋壳Ⅱ后培养至出雏。方法Ⅰ组中有80.8％（42／52）的胚胎存活到第8d，最终出雏率为19.2％（10／52）；方法Ⅱ组中全部胚胎都存活到第6d，96.2％（50／52）的胚胎存活到第8d，最终获得了40.4％（21／52）的出雏率；在在第6d直到出雏期间，方法Ⅰ组和方法Ⅱ组同一日龄的胚胎存活率差异显着（0.01＜P＜0.05或P＜0.01）；方法Ⅰ组和对照组的胚胎存活率差异极显着（P＜0.01）；方法Ⅱ组和对照组同一日龄的胚胎存活率在第16d到出雏期间差异极显着（P＜0.01）。结果表明，方法Ⅰ和方法Ⅱ均能获得出雏，且方后者优于前者。异体胚盘移植时胚胎存活率很低，第7d的存活率为28％（21／75），第8d的存活率为12％（9／75），第9d则为1.33％（1／75），第10d全部死亡。2鸭胚腿骨组织及心脏血的碱性磷酸酶的活性将在代用蛋壳内培养至14d，16d，18d，20d，22d，24d，26d，28d的鸭胚，分别取其腿骨和心脏血测定碱性磷酸酶（ALP）的活性。并同时取正常条件下孵化的相应日龄的鸭胚腿骨和心脏血的ALP活性作为对照。腿骨中ALP活性随着胚胎日龄的增加呈上升趋势，各日龄试验组ALP活性均高于对照组的ALP活性，差异均极显着（P＜0.01）。鸭胚血浆中ALP活性同样随着胚胎日龄的增加呈上升趋势，各日龄试验组ALP活性均高于对照组的ALP活性，差异均极显着（P＜0.01）。结果表明，在代用蛋壳内培养的鸭胚，其发育后期由于钙的吸收不足而引起钙的代谢异常，ALP活性代偿性升高。3鸭卵母细胞体外受精及其体内培养在鸭产蛋后60～80min内，通过手术取出母鸭排出的卵母细胞。经过体外受精后，移植到受体母鸭体内，等待产蛋。试验中共转移了12枚体外受精卵，受体母鸭于移植第二天产下4枚蛋，其中有壳蛋2枚。硬壳蛋在正常条件下孵化，最终孵出一只雏鸭。试验结果说明了鸭成熟卵母细胞可在体外受精，移回体内能正常发育。试验结果证明了通过体外受精—体内发育—体外孵化出雏是完全可行的。
秦洁[9]（2006）在《鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究》文中指出胚胎原始生殖细胞（Embryonic Primordial Germ Cells,EPGCs）是生殖母细胞的前体细胞,是精子或卵子的祖先细胞,在多能干细胞研究领域中已成为一个新的干细胞资源,亦是近年来干细胞研究的又一个热点。基于目前国内外对鸡胚胎原始生殖细胞（EPGCs）正处于起步的研究现状,本研究对这一胚胎生殖系干细胞进行了系统的探索性研究。在鸡胚发育的第14期血液中、第19期和第28期的生殖腺中采用不同的分离提取方法分别获取EPGCs,并进行体外培养,以探讨分离培养EPGCs的适宜时期和方法;系统地探索了EPGCs的体外培养体系、传代方法和条件、不同冷冻体系对鸡EPGCs冷冻保存的效果以及外源性细胞因子mLIF、hSCF、bFGF和hIL-11对体外培养的鸡EPGCs增殖和分化的影响,以期筛选出鸡EPGCs合适的体外培养体系和冷冻保存条件;同时利用不同特异性化学物质定向诱导EPGCs向脂肪细胞、神经元样细胞分化,以及尝试对EPGCs单细胞进行体外培养克隆传代、检测其形态特征、表面标记及体外分化等特征特性,为建立EPGCs干细胞系以及体外研究胚胎发育、基因组学研究、药物筛选等提供有价值的参考依据。研究结果主要归纳为以下几个方面:1.采用Ficoll密度梯度离心法+酶解法、单独EDTA-酶解法两种方法,分别提取第14期血液（孵化53小时）、第19期（孵化72小时）和第28期（孵化132小时）生殖腺中的鸡EPGCs,比较在相同的体外培养条件下两种分离方法获取三个发育时期的鸡EPGCs数量、存活率和存活时间的差异。结果表明:单独EDTA-酶解法
谭碧君[10]（2006）在《囊胚细胞为媒体转基因鸡的技术研究》文中认为本研究应用阳离子脂质体转染法、显微注射技术，利用携带报告基因（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）的鸡囊胚细胞为供体初步建立了转基因鸡模型，为利用转基因鸡作为生物反应器建立了一个技术平台。取得研究成果如下： 1．鸡囊胚细胞体外培养时，添加10％的胎牛血清，细胞的贴壁率最高；M199、EMDM两种细胞培养液对细胞贴壁率的影响差异不显着；培养时间为24h时细胞的贴壁率最高；细胞贴壁率最高达60％左右。 2．鸡囊胚细胞体外转染时，贴壁细胞与悬浮细胞转染都可获得60％左右细胞的瞬时表达；脂质体量为4μg，质粒DNA量为3μg时，转染白来航鸡原代囊胚细胞的效率最高。 3．对受体种蛋进行显微注射时，种蛋赤道面开窗的孵化率最高，达26.74％；对开窗种蛋采用四种不同材料封口，其中用蛋壳膜加封口胶进行封口的种蛋孵化率最好，达27.08％；未开窗处理的种蛋与开窗处理的种蛋的孵化率有显着差异（p＜0.05）；开窗处理的种蛋由于破坏了原来的结构，导致孵化率显着降低。其中注射囊胚细胞的种蛋孵化率为28.43％。 4．对转基因鸡的胚胎及一周龄的小鸡进行荧光检测和PCR检测时，观察到弱的绿色荧光，PCR检测也出现了阳性结果。
二、X期鸡胚简易体外培养方法的探索（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、X期鸡胚简易体外培养方法的探索（论文提纲范文）
（1）新型慢病毒包装方法及转基因鸡生物反应器研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照表 |
| 文献综述部分 |
| 第一章 动物生物反应器 |
| 1 转基因动物生物反应器优势 |
| 2 转基因生物反应器平台的建立 |
| 2.1 乳腺生物反应器 |
| 2.2 血液和禽蛋动物生物反应器 |
| 2.3 尿液和精液动物生物反应器 |
| 2.4 蚕茧生物反应器 |
| 2.5 其它 |
| 3 各种动物生物反应器获得的成就 |
| 4 结论 |
| 第二章 转基因鸡生物反应器 |
| 1 转基因鸡生物反应器的发展 |
| 2 转基因鸡生物反应器的价值 |
| 2.1 鸡蛋中的主要蛋白成分 |
| 2.2 蛋白的糖基化修饰 |
| 2.3 转基因鸡生物反应器的其他优势 |
| 3 建立一个转基因鸡反应器需要的步骤 |
| 3.1 生产转基因鸡的方法 |
| 3.2 逆转录病毒载体法 |
| 3.3 转基因鸡中重组蛋白的表达 |
| 4 结论 |
| 第三章 慢病毒转基因技术 |
| 1 慢病毒的组成 |
| 2 慢病毒载体构建的发展 |
| 2.1 第一代慢病毒载体的设计 |
| 2.2 慢病毒载体技术的进一步优化 |
| 3 慢病毒的包装生产 |
| 3.1 构建能长期稳定表达慢病毒载体所用的细胞系 |
| 3.2 质粒瞬时转染法生产慢病毒载体 |
| 3.3 有助于病毒生产的添加物 |
| 4 病毒载体体内特异性打靶 |
| 5 结论 |
| 实验研究部分 |
| 第四章 生产慢病毒新方法的研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验材料与试剂 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 质粒DNA的转化 |
| 2.2 质粒的小量制备提取 |
| 2.3 质粒的酶切鉴定 |
| 2.4 质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.5 慢病毒核心载体质粒的构建 |
| 2.6 无内毒素质粒小量制备提取 |
| 2.7 293T细胞的培养 |
| 2.8 使用脂质体作为转染试剂生产慢病毒 |
| 2.9 使用PEI作为转染试剂细胞生产慢病毒 |
| 2.10 慢病毒的浓缩 |
| 2.11 慢病毒物理颗粒滴度的测定 |
| 2.12 慢病毒效价滴度的测定 |
| 2.13 测定N/P和转染DNA总量的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.14 测定293T细胞培养基中FBS,氯喹,GlutaMax的存在对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.15 测定转染时细胞数目的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.16 测定转染16h后是否换液对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.17 测定PEI工作液pH值的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.18 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 慢病毒质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 脂质体法与PEI法生产慢病毒所获滴度的比较 |
| 3.3 N/P值和转染DNA总量对获得慢病毒滴度的影响 |
| 3.4 培养基中FBS,氯喹,GlutaMax对慢病毒滴度的影响 |
| 3.5 转染时细胞数目的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 3.6 转染16h后是否换液对获得慢病毒滴度的影响 |
| 3.7 PEI工作液pH值的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 4 讨论与结论 |
| 第五章 慢病毒载体法生产转基因鸡的研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验材料与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 种蛋的开窗注射与孵化 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论与结论 |
| 第六章 外源基因嵌合型转基因鸡个体的筛选 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验材料与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鸡尿囊绒毛膜提基因组DNA的提取 |
| 2.2 鸡血液基因组DNA的提取 |
| 2.3 鸡胚转基因个体的PCR检测 |
| 2.4 嵌合型转基因鸡阳性个体ELISA检测 |
| 2.5 嵌合型转基因鸡阳性个体所产鸡蛋中外源重组蛋白Western Blot检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 对嵌合体小鸡进行PCR初步筛选 |
| 3.2 转基因鸡阳性率统计 |
| 3.3 转基因鸡的进一步筛选 |
| 4 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）脂质体转染制备转基因鹌鹑的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽类的胚胎发育 |
| 1.1 禽类的受精卵结构 |
| 1.2 禽类胚胎发育 |
| 1.3 鸡胚体外培养体系的发展 |
| 2 禽类胚胎期的转基因操作方法 |
| 2.1 电转染法 |
| 2.2 反转录病毒介导的转染法 |
| 2.3 脂质体介导的转染方式 |
| 3 转基因动物检测方法 |
| 3.1 感官水平识别 |
| 3.2 分子水平的检测 |
| 3.3 功能水平的检测 |
| 4 转基因动物研究的应用 |
| 4.1 动物品种改良和抗病育种 |
| 4.2 医用动物模型 |
| 4.3 利用转基因动物作为生物反应器 |
| 5 本实验研究的目的意义 |
| 第二章 质粒的制备、脂质体与质粒的比例确定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pEGFP-C2质粒载体的PCR鉴定 |
| 2.2 质粒的线性化 |
| 2.3 pEGFP-C2质粒-脂质体凝胶阻滞实验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 脂质体转染的原理及优越性 |
| 3.2 影响脂质体介导的基因转染效率 |
| 3.3 质粒与质粒的线性化 |
| 第三章 种蛋胚盘细胞转染实验及孵化 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 胚盘注射外源DNA结果 |
| 2.2 胚盘注射外源DNA的PCR检查结果 |
| 2.3 冰冻切片荧光检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胚盘注射转染方式 |
| 3.2 胚盘注射效果的验证 |
| 3.3 种蛋注射前的开口方式选择 |
| 第四章 转基因后代的生产与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR检测外源基因在未出壳G0代鹌鹑组织中的表达 |
| 2.2 PCR检测外源基因在7日龄G0代鹌鹑组织中的表达 |
| 2.3 PCR检测外源基因在成年G0代鹌鹑组织中的表达 |
| 2.4 G0代鹌鹑内脏组织切片荧光观察 |
| 2.5 杂交分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转染效率的影响因素 |
| 3.2 胚盘下腔的注射及开窗对鹌鹑胚发育的影响 |
| 3.3 转基因G0代的生产和转基因G0代的杂交 |
| 全文结论与创新点 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 主要试剂的配制方法 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（3）慢病毒载体精子介导法生产转基因鸡研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 制备转基因鸡的技术方法 |
| 1.1.1 基因显微注射法 |
| 1.1.2 鸡卵原始胚细胞的弹道转染 |
| 1.1.3 反转录病毒载体法 |
| 1.1.4 胚胎干细胞原生殖细胞操作法 |
| 1.1.5 精子载体法 |
| 1.2 慢病毒载体 |
| 1.2.1 慢病毒载体制备转基因动物的进展 |
| 1.2.2 慢病毒载体精子介导法生产转基因动物的研究进展 |
| 1.3 报告基因GFP |
| 1.4 本研究的目的、意义和主要内容 |
| 1.5 本研究的技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鸡 |
| 2.1.2 实验仪器设备 |
| 2.1.3 主要药品、试剂及酶 |
| 2.1.4 常用溶液及试剂的配制 |
| 2.1.5 引物设计及分析软件 |
| 2.1.6 病毒、细胞系及质粒载体 |
| 2.1.7 原代细胞培养试剂及配置 |
| 2.1.8 组织切片器材及试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 对照质粒真核表达载体PcDNA3.1-GFP的构建 |
| 2.2.3 质粒转化提取 |
| 2.2.4 293T细胞的培养 |
| 2.2.5 以GFP为报告基因的慢病毒的生产 |
| 2.2.6 慢病毒滴度检测 |
| 2.2.7 真核表达载体PcDNA3.1-GFP转染293T细胞 |
| 2.2.8 鸡胚生殖细胞的分离、培养及感染慢病毒实验 |
| 2.2.9 鸡胚小肠上皮细胞原代培养及感染慢病毒实验 |
| 2.2.10 慢病毒感染细胞目的基因检测 |
| 2.2.11 公鸡生殖器官组织切片 |
| 2.2.12 微创法慢病毒载体连续导入性成熟公鸡睾丸 |
| 2.2.13 手术后定期采精观察检测及人工授精 |
| 2.2.14 授精蛋孵化及第一代转基因鸡检测 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 重组真核表达载体pcDNA3.1-GFP的鉴定 |
| 3.1.1 PCR技术扩增pGFP质粒中的GFP基因片段 |
| 3.1.2 重组质粒pcDNA3.1-GFP酶切鉴定 |
| 3.1.3 重组质粒pcDNA3.1-GFP在293T细胞表达 |
| 3.2 慢病毒包装结果 |
| 3.2.1 慢病毒感染和真核表达载体转染293T细胞表型的变化 |
| 3.2.2 慢病毒在不同细胞中的表达结果 |
| 3.3 鸡胚生殖细胞原代培养及慢病毒转染结果 |
| 3.3.1 不同时期鸡胚生殖细胞在不同消化体系中的分离效果分析 |
| 3.3.2 鸡胚生殖细胞形态特征 |
| 3.3.3 慢病毒感染鸡胚生殖细胞结果 |
| 3.4 鸡胚小肠上皮细胞原代培养及慢病毒转染结果 |
| 3.4.1 鸡胚小肠上皮细胞原代培养生长形态观察 |
| 3.4.2 鸡胚小肠上皮细胞生长曲线 |
| 3.4.3 慢病毒转染鸡胚小肠上皮细胞结果 |
| 3.5 公鸡生殖器官组织切片结果 |
| 3.6 微创手术睾丸内导入慢病毒载体结果 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 4.1 影响真核表达载体pcDNA3.1-GFP构建的因素 |
| 4.2 感受态细胞对转化以及内毒素对转染的影响 |
| 4.3 293T细胞培养的相关因素 |
| 4.4 细胞及脂质体对慢病毒包装的影响 |
| 4.5 影响慢病毒载体包装和表达效率的因素 |
| 4.6 影响原代鸡胚生殖细胞培养的因素 |
| 4.6.1 不同时期鸡胚生殖细胞在不同消化体系下分离效果的比较 |
| 4.6.2 支持细胞作为生殖细胞饲养层的依据 |
| 4.6.3 体外培养生殖细胞时间短的原因 |
| 4.7 影响原代培养鸡胚小肠上皮细胞的因素 |
| 4.7.1 消化酶及消化时间 |
| 4.7.2 鸡胚小肠上皮细胞生长的主要影响因素 |
| 4.8 慢病毒感染原代培养细胞影响因素 |
| 4.9 公鸡生殖器官组织切片的影响因素及意义 |
| 4.10 微创手术公鸡睾丸内导入慢病毒载体手术的影响因素 |
| 4.11 影响真核表达载体PCDNA3.1-GFP表达效率的因素 |
| 4.12 全文讨论分析 |
| 第五章 结论 |
| 考参文献 |
| ABSTRACT |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）病毒载体介导家鸡多能细胞系的转基因技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 动物转基因技术研究现状 |
| 1.1 动物转基因技术的方法 |
| 1.2 动物转基因的表达与调控 |
| 1.3 家鸡转基因研究现状 |
| 1.3.1 家鸡转基因的表达载体 |
| 1.3.2 家鸡多能细胞 |
| 1.3.3 输卵管组织特异性表达的调控元件 |
| 1.3.4 激素和卵清蛋白基因的调控作用 |
| 1.3.5 家鸡转基因技术的应用前景 |
| 1.3.6 家鸡转基因技术存在的问题 |
| 2 研究目标与技术路线 |
| 第二章 改进种蛋开窗方法提高家鸡转基因技术 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 种蛋开窗后不注射胚的孵化率 |
| 2.2 种蛋开窗后注射胚的孵化率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 开窗是导致种蛋孵化率下降的主要因素 |
| 3.2 种蛋开窗方法的改进 |
| 4 小结 |
| 第三章 以慢病毒为载体转染囊胚细胞和原生殖细胞的转基因家鸡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 利用 Gateway技术构建绿色荧光蛋白基因慢病毒表达载体 |
| 1.2.2 慢病毒载体转染体外培养的囊胚细胞 |
| 1.2.3 慢病毒载体转染种蛋内囊胚细胞和原生殖细胞 |
| 1.2.4 转基因产物的PCR和荧光检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 慢病毒载体的PCR检测及载体滴度的测定 |
| 2.2 在体外培养囊胚细胞中表达的绿色荧光蛋白基因 |
| 2.3 慢病毒载体转染未孵化种蛋囊胚所产生的转基因鸡胚 |
| 2.4 慢病毒载体转染发育鸡胚中原生殖细胞产生的转基因家鸡 |
| 3 讨论 |
| 3.1 慢病毒载体及其 Gateway构建技术 |
| 3.2 囊胚细胞转染和原生殖细胞转染两种家鸡转基因方法的比较 |
| 4 小结 |
| 第四章 逆转录病毒载体转染睾丸细胞的转基因家鸡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 通过射线辐照使公鸡的睾丸不育 |
| 1.2.2 逆转录病毒载体的构建 |
| 1.2.3 逆转录病毒对体外培养睾丸细胞的感染及检测 |
| 1.2.4 转染的睾丸细胞移植入不育公鸡的睾丸 |
| 2 结果 |
| 2.1 绿色荧光蛋白基因在体外培养睾丸细胞中的表达 |
| 2.2 转染睾丸细胞中逆转录病毒启动子区域的CpG甲基化分析 |
| 2.3 移植转染睾丸细胞后产生转基因精子的公鸡 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 人促红细胞生成素基因家鸡输卵管组织特异性表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 家鸡输卵管组织特异性启动子的克隆 |
| 1.2.2 人促红细胞生成素基因的克隆 |
| 1.2.3 人促红细胞生成素基因输卵管特异性表达载体的构建 |
| 1.2.4 构建的表达载体转染家鸡原代输卵管上皮细胞 |
| 2 结果 |
| 2.1 克隆基因的PCR扩增、酶切与测序鉴定 |
| 2.2 hEPO基因家鸡输卵管组织特异性表达载体的酶切鉴定 |
| 2.3 三种表达载体在鸡原代输卵管上皮细胞中的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 OV基因5’端调控序列及hEPO基因的调控元件 |
| 3.2 GFP、hEPO基因的共表达及其检测方法 |
| 4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 1 研究结果 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 符号表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）鸡胚中RNAi方法的建立及其在鸡DMRT1基因功能研究中的初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 种蛋开窗处理的研究进展 |
| 1.2.1 开窗部位 |
| 1.2.2 开窗方法 |
| 1.3 将干扰载体导入鸡胚的方法 |
| 1.3.1 电穿孔转染法 |
| 1.3.2 脂质体介导法 |
| 1.3.3 病毒载体法 |
| 1.4 干扰效果的检测 |
| 1.5 用于验证干扰效果的基因的研究进展 |
| 1.5.1 DMRT1基因 |
| 1.5.2 芳香化酶基因(Cytochrome P450 19A1,CYP19A1) |
| 1.5.3 抗中肾旁管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH) |
| 2 研究的目的及意义 |
| 3 鸡胚中RNAI方法的建立 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 主要试剂及配制 |
| 3.3 主要仪器与设备 |
| 3.4 主要分子生物学软件 |
| 3.5 主要数据库 |
| 3.6 主要研究方法 |
| 3.6.1 空载干扰质粒的小量提取(碱裂解法) |
| 3.6.2 空载干扰质粒的大量制备 |
| 3.6.3 种蛋的孵化 |
| 3.6.4 种蛋的开窗处理及分组 |
| 3.6.5 将空载干扰质粒载体转染鸡胚 |
| 3.6.6 封口 |
| 3.6.7 检测 |
| 3.6.8 统计分析 |
| 3.7 结果与分析 |
| 3.7.1 种蛋的不同开窗方法效果比较 |
| 3.7.2 空载干扰质粒载体转染鸡胚 |
| 3.8 讨论 |
| 3.8.1 赤道面开窗方法的研究 |
| 3.8.2 不同开窗处理方法对鸡胚的影响 |
| 3.8.3 开窗导致种蛋孵化率下降原因分析 |
| 3.8.4 鸡胚转染 |
| 3.8.5 检测 |
| 3.9 小结 |
| 4 利用DMRT1基因检测RNAI方法在鸡胚中的干扰效果 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 主要试剂及配制 |
| 4.3 主要分子生物学软件 |
| 4.4 试验方法 |
| 4.4.1 干扰载体的构建 |
| 4.4.2 干扰载体转染鸡胚 |
| 4.4.3 活体成像系统下检测鸡胚的转染情况 |
| 4.4.4 鸡胚的性别鉴定 |
| 4.4.5 鸡胚总RNA的提取 |
| 4.4.6 Real-time定量PCR分析基因表达 |
| 4.4.7 统计分析 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 干扰载体的构建与鉴定 |
| 4.5.2 双重PCR鉴定鸡的性别 |
| 4.5.3 总RNA的提取及质量检测 |
| 4.5.4 cDNA质量的检测 |
| 4.5.5 基因引物质量的检测 |
| 4.5.6 荧光定量RT-PCR结果 |
| 4.6 讨论 |
| 4.6.1 shRNA的设计及重组质粒的构建 |
| 4.6.2 基因组DNA质量对性别鉴定的影响 |
| 4.6.3 鸡胚RNA样的保存及RNA的提取、检测 |
| 4.6.4 样本的采集 |
| 4.6.5 雄性鸡胚中DMRT1和AMH基因的表达关系 |
| 4.6.6 雌性鸡胚中DMRT1和CYP19A1基因的表达关系 |
| 4.7 小结 |
| 5 结论 |
| 5.1 本研究的主要结果 |
| 5.2 本研究的不足和进一步研究的内容 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）禽类胚胎体外培养的研究进展（论文提纲范文）
| 1 禽类胚胎体外培养的研究概况 |
| 2 体外培养系统 |
| 2.1 非蛋壳培养体系 |
| 2.2 代用蛋壳体系 |
| 2.3 三期培养体系 |
（8）鸭体外受精和胚胎移植的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 禽类生殖生理的特点 |
| 1.1 输卵管和蛋的形成 |
| 1.2 受精的特点 |
| 1.3 受精卵的特点 |
| 1.4 早期胚胎发育特点 |
| 2 禽类胚胎体外培养研究概况 |
| 2.1 非蛋壳培养体系 |
| 2.2 代用蛋壳体系 |
| 2.3 三期培养体系 |
| 3 禽类胚胎骨组织以及血浆中ALP的测定 |
| 4 禽类体外受精 |
| 5 禽类胚胎移植 |
| 6 本研究的目的和内容 |
| 第二章 鸭胚胎代用蛋壳培养及异体胚盘移植研究 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 种蛋 |
| 1.2 代用蛋壳 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 器械、药品和试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验一 鸭胚胎代用蛋壳培养 |
| 2.1.1 方法I |
| 2.1.2 方法II |
| 2.1.3 对照组 |
| 2.2 试验二 异体胚盘移植 |
| 2.3 试验观察 |
| 2.4 数据处理 |
| 结果 |
| 3.1 鸭胚胎代用蛋壳培养结果 |
| 3.2 异体胚盘的移植结果 |
| 讨论 |
| 第三章 鸭胚骨组织及心脏血的碱性磷酸酶的活性研究 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、器械和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鸭胚移植 |
| 2.2 腿骨的采取 |
| 2.3 心脏血的采集 |
| 2.4 碱性磷酸酶(ALP)的测定 |
| 2.4.1 ALP标准曲线的制作 |
| 2.5 ALP比活性的计算 |
| 2.6 腿骨样品的蛋白浓度测定 |
| 3 数据的统计学分析 |
| 结果与分析 |
| 1 ALP标准曲线 |
| 2 胚胎发育期间腿骨组织中ALP活性的比较 |
| 3 胚胎发育期间血浆中的ALP活性比较 |
| 4 胚胎腿骨组织中ALP比活性 |
| 讨论 |
| 第四章 鸭体外受精的研究 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要仪器与材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 试验动物 |
| 2.2 精液采集及精液稀释 |
| 2.3 卵母细胞的获取 |
| 2.4 成熟卵母细胞的体外受精 |
| 2.5 经体外受精处理的卵母细胞的体内移植 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽类原始生殖细胞的生物学特性 |
| 2 原始生殖细胞的起源与迁移规律 |
| 3 PGCs 的体外培养体系 |
| 4 PGCs的冷冻保存 |
| 5 细胞因子对PGCs 的增殖分化效应 |
| 6 干细胞外分化的多潜能性 |
| 7 PGCs 的生物学特性检测 |
| 8 禽类原始生殖细胞在胚胎生物工程中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（10）囊胚细胞为媒体转基因鸡的技术研究（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 转基因禽类方法的研究进展 |
| 1.1.1 逆转录病毒感染法 |
| 1.1.2 原始生殖细胞转染法 |
| 1.1.3 精子介导法 |
| 1.1.4 胚盘显微注射法 |
| 1.2 利用嵌合体技术进行家禽转基因 |
| 1.2.1 原生殖细胞为供体的嵌合体制作 |
| 1.2.2 囊胚细胞为供体的嵌合体鸡制作 |
| 1.2.3 提高生殖嵌合体的方法 |
| 1.3 脂质体概述 |
| 1.3.1 脂质体的组成 |
| 1.3.2 脂质体介导转染的机制 |
| 1.3.3 脂质体转染法的应用 |
| 1.3.4 脂质体转染的新进展 |
| 1.4 报告基因-GFP基因 |
| 1.5 制备转基因鸡的意义 |
| 1.5.1 加快QTL选择进程 |
| 1.5.2 提高肉蛋的产量与质量 |
| 1.5.3 进行抗病育种 |
| 1.5.4 生产药用蛋白 |
| 1.6 家鸡作为生物反应器的优势和缺点 |
| 1.6.1 优势 |
| 1.6.2 缺点 |
| 1.7 问题与展望 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鸡囊胚细胞的体外培养及培养条件的优化 |
| 2.2.1.1 鸡囊胚细胞的分离及体外培养 |
| 2.2.1.2 鸡囊胚细胞体外培养条件的优化 |
| 2.2.2 鸡囊胚细胞的体外转染 |
| 2.2.2.1 贴壁囊胚细胞的体外转染 |
| 2.2.2.2 悬浮囊胚细胞的体外转染 |
| 2.2.2.3 鸡囊胚细胞的体外转染的检测 |
| 2.2.2.4 脂质体量对转染效率的影响 |
| 2.2.2.5 DNA量对转染效率的影响 |
| 2.2.3 受体种蛋的处理 |
| 2.2.3.1 种蛋的开窗 |
| 2.2.3.2 种蛋的封口 |
| 2.2.4 受体种蛋的孵化 |
| 2.2.5 转基因鸡的检测 |
| 2.2.5.1 荧光显微镜检测 |
| 2.2.5.2 PCR检测分析 |
| 2.2.6 生物统计学方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸡囊胚细胞的体外培养 |
| 3.1.1 胎牛血清对鸡囊胚细胞贴壁生长的影响 |
| 3.1.2 培养液对鸡囊胚细胞贴壁生长的影响 |
| 3.1.3 培养时间对鸡囊胚细胞贴壁生长的影响 |
| 3.1.4 鸡囊胚细胞体外培养的检测 |
| 3.2 鸡囊胚细胞的体外转染 |
| 3.3 影响质粒DNA的转染因素 |
| 3.3.1 脂质体量对转染效率的影响 |
| 3.3.2 DNA量对转染效率的影响 |
| 3.4 受体种蛋的处理 |
| 3.4.1 种蛋的开窗 |
| 3.4.2 种蛋的封口 |
| 3.5 种蛋的孵化 |
| 3.6 转基因鸡的检测 |
| 3.6.1 荧光检测结果 |
| 3.6.2 PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡囊胚细胞的分离与体外培养 |
| 4.2 囊胚细胞的体外转染 |
| 4.3 显微注射 |
| 4.4 实验种蛋的孵化 |
| 4.5 检测 |
| 论文小结 |
| 参考文献 |
| 缩写词及英汉对照 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、X期鸡胚简易体外培养方法的探索（论文参考文献）
- [1]新型慢病毒包装方法及转基因鸡生物反应器研究[D]. 张宏鹏. 南京农业大学, 2016(04)
- [2]脂质体转染制备转基因鹌鹑的研究[D]. 李艳. 石河子大学, 2013(03)
- [3]慢病毒载体精子介导法生产转基因鸡研究[D]. 赵丽玲. 山西农业大学, 2013(03)
- [4]病毒载体介导家鸡多能细胞系的转基因技术研究[D]. 燕海峰. 湖南农业大学, 2009(10)
- [5]鸡胚中RNAi方法的建立及其在鸡DMRT1基因功能研究中的初步应用[D]. 孙小美. 华中农业大学, 2008(02)
- [6]禽类胚胎体外培养的研究进展[A]. 徐国正,张文昌,庄益芬,张丽,李明,祁喜可. 福建省科协第七届学术年会分会场——“坚持科技创新;建设海西现代畜牧业”研讨会论文集, 2007(总第147期)
- [7]禽类胚胎体外培养的研究进展[J]. 徐国正,张文昌,庄益芬,张丽,李明,祁喜可. 福建畜牧兽医, 2007(S1)
- [8]鸭体外受精和胚胎移植的研究[D]. 徐国正. 福建农林大学, 2007(05)
- [9]鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究[D]. 秦洁. 扬州大学, 2006(03)
- [10]囊胚细胞为媒体转基因鸡的技术研究[D]. 谭碧君. 湖南农业大学, 2006(12)