一、生后小鼠肾脏皮质发育过程中的细胞增殖（论文文献综述）
宋科昕[1]（2020）在《发生发育小鼠肾小球形态计量学研究》文中指出目的:肾小球（glomerulus）是肾脏发挥滤过功能的主要结构。肾小球数量及毛细血管襻的形态发生直接影响成年肾脏对血浆的有效滤过面积及肾小球病变进展。有文献报道,出生时肾单位数量（nephron endowment）与生后发生心血管系统的疾病直接相关。肾单位由生肾区（nephrogenic zone）中输尿管芽泡（ureteric bud tip,UBT）诱导形成,输尿管芽泡的数量反映了肾单位形成的数量。当输尿管芽泡分支终止,肾单位的发生即停止。目前关于结合肾小球形态及其所处环境的整体研究鲜有报道,更缺乏相关定量数据。本研究根据肾脏形态发生规律,借助内皮细胞生物学标记物CD34及输尿管芽泡的生物学标记物Claudin7的组织化学染色,探索发育不同时间点小鼠生肾区、毛细血管襻期肾小球（Capillary loop stage glomerulus,capG）和输尿管芽泡的形态参数变化规律,为肾小球功能评估提供形态计量学依据。研究方法:肾脏取自胚胎14.5、15.5、16.5、17.5、18.5天胎鼠,生后1、3、5、7、40天仔鼠,每个时间点取6只小鼠,制备石蜡切片和树脂切片,进行肾小球光电镜形态学观察,同时,采用Claudin7和CD34免疫组化染色结合无偏体视学原理,测量发育中小鼠生肾区和肾皮质的厚度、输尿管分支末端芽泡之间的距离、CD34阳性表达的毛细血管襻占肾小球的体积密度,以及肾小球占皮质的体积密度。结果:1.小鼠生肾区的厚度从胚龄14.5天（embryonic day 14.5,E14.5）的（60±7）μm,随肾脏发育逐渐变薄,于生后5天（postnatal day 5,P5）消失。肾皮质的厚度则呈显着递增趋势,在2天内由E15.5的（167±15）μm迅速发育增长到E17.5的（411±41）μm,此后厚度保持缓慢增长直至肾脏发育完成。2.E14.5、E16.5、E17.5、E18.5胎鼠中,输尿管芽泡间的距离呈递减趋势,从E14.5的（95±27）μm降低至E16.5的（80±22）μm,最后降至E18.5的（52±8）μm。3.本研究根据肾小球的形态学及足细胞排列形式,将毛细血管襻期肾小球（capG）分为早、中、晚三期,capG中期又分为中早期和中晚期。除capG早期由于肾小球形状复杂无法测量外,中早期cap G的体积密度为（35.95±6.45）%,中晚期capG的体积密度为（58.36±6.30）%,晚期capG的体积密度为（79.89±5.21）%。作为对照,来源于P40成年鼠的肾小球的体积密度为（93.61±1.96）%。此外,不同发育时间点的小鼠各相同时期cap G中CD34阳性表达占肾小球的体积密度保持相对恒定。而各时间点中肾小球占皮质的体积密度均无显着差异,约为（5.91±2.74）（4）。结论1.发育中输尿管芽泡间的距离由长变短,反映了其分支在胚胎晚期处于活跃阶段,同时提示诱导肾单位的数量在此阶段达到高峰,这也与生肾区厚度的变化相一致;2.肾小球发育过程中反映其有效滤过面积的毛细血管襻占肾小球的比例呈显着递增趋势,该研究结果为肾小球发育的评估提供了参数依据。
王雪[2]（2019）在《前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:前列腺组织主要由两种类型上皮细胞组成,基底和管腔上皮细胞,两者存在一定的相似性,同时又存在多种因素在两者特异的表型方面参与调控及维持。本论文旨在:（1）研究前列腺基底上皮细胞特征是如何维持的?该过程需要哪些调控因子参与?（2）研究管腔上皮细胞特征是如何维持的?前列腺管腔上皮组织的三大属性,细胞间连接、细胞极性和细胞分裂轴定位三者之间存在怎样的相互作用?方法:通过开展一系列体内体外实验考察上皮间质转化（EMT）转录调控因子在前列腺上皮组织中的表达模式及生物学功能,利用高通量单细胞RNA测序分析及体内实验检测Zeb1表达上皮细胞中富集哪些相关信号通路调节因子来维持基底上皮干细胞亚群的干性、EMT特征和基底细胞的正常发育。通过开展一系列体内体外实验考察细胞间连接蛋白E-cadherin在前列腺上皮组织中的表达模式和黏附连接缺陷小鼠的表型。通过转录组测序分析和生化实验研究管腔上皮细胞特征维持的主要因素细胞间黏附连接蛋白E-cadherin,Scribble细胞极性蛋白复合物及LGN分裂纺锤体定位复合物三者之间的相互关系。所有的统计学检验均为双侧检验。结果:（1）上皮间质转化核心转录因子Zeb1仅阳性表达在前列腺基底上皮细胞层,同时表达上皮和间质细胞相关基因,且Zeb1+基底细胞富集分布在前列腺干细胞存在的近尿道区域。（2）Zeb1+基底细胞在前列腺自发肿瘤模型小鼠和人前列腺样本中均有发现,且比例明显增多,甚至出现了Zeb1+管腔细胞。（3）相比Zeb1-基底细胞,Zeb1+基底上皮细胞具有更强的体外连续类器官形成能力和体内连续肾包膜移植能力,既可以自我更新又可以分化产生其他两种不同类型上皮细胞。（4）体内和体外Zeb1表达缺失造成基底上皮细胞数目急剧减少,基底上皮细胞正常发育过程受阻,但对管腔上皮细胞和内分泌细胞发育并未产生明显影响。（5）活化的Wnt信号通路维持了Zeb1+基底上皮细胞的干性及基底细胞层的表型。（6）成年小鼠前列腺上皮组织中E-cadherin蛋白主要表达在管腔上皮细胞之间,而在零散存在的基底上皮细胞中几乎不表达。（7）在前列腺组织发育、去势再生及成熟等不同时期,E-cadherin表达缺失导致各个组织分叶管腔上皮细胞增殖比例显着增加,促进前列腺肿瘤的发生发展,21个月龄的E-cadherin敲除小鼠基底膜破损,基底上皮细胞缺失,肿瘤细胞浸润至微环境。（8）E-cadherin敲除显着增加了管腔上皮细胞分裂纺锤体轴定位异常的比例,分裂中后期纺锤体轴发生较大角度的异常偏转。同时,E-cadherin敲除导致纺锤体轴定位核心蛋白LGN和NuMA,细胞极性蛋白PAR和SCRIBBLE三元复合物,分布弥散,特异膜定位处结合能力显着下降。（9）相比对照组,E-cadherin敲除组中与促进细胞增殖和迁移相关的信号通路存在富集且表达显着上调,与增强细胞间连接相关的基因表达显着下调,且E-cadherin敲除组与TCGA数据库中人前列腺癌样本分子表达谱具有一定的相似性。（10）分子机制方面,管腔上皮细胞黏附连接蛋白E-cadherin、极性蛋白SCRIB和分裂轴定位蛋白LGN三者之间存在内源性的相互作用,且敲低E-cadherin蛋白表达水平,显着减弱SCRIB和LGN两者之间的结合作用,敲低SCRIB蛋白表达水平,显着削弱E-cadherin和LGN两者之间的结合作用。E-cadherin和LGN蛋白两者与SCRIB蛋白的PDZ结构域特异性结合。结论:（1）前列腺基底上皮细胞层发现一小群EMT转录因子Zeb1+细胞,这群细胞既可以自我更新又可以分化产生其他不同类型上皮细胞,同时对基底上皮细胞的正常发育是必不可少的。（2）前列腺管腔上皮细胞间黏附连接、细胞极性、分裂纺锤体轴定位三者之间存在着紧密的相互作用,E-cadherin/SCRIB/LGN三元蛋白复合物的形成维持了管腔上皮细胞的特征,保证其发育分化过程正常进行和有效地预防前列腺肿瘤的发生发展。科学意义:Zeb1+上皮细胞的发现及其生物学功能的探究,为前列腺上皮组织正常发育和细胞可塑性研究奠定了一定的理论基础,为肿瘤来源细胞（肿瘤起始细胞,肿瘤干细胞）研究提供了新的线索。上皮细胞间黏附连接、细胞极性和分裂轴定位三者之间紧密的相互作用维持了正常的前列腺管腔上皮组织结构,对前列腺组织正常发育和肿瘤发生发展有了新的理论认识,对临床治疗和预后具有重要的指导意义。
萧闵[3]（2019）在《基于Cx43蛋白研究先天肾虚影响仔鼠骨发育的机制》文中进行了进一步梳理目的建立先天肾虚仔鼠模型,以Cx43为切入点,观察其骨发育情况,从先天肾精角度验证“肾主骨发育”,初步明确先天肾虚与胎源性骨发育迟缓相关性及Cx43与肾精相关性;采用左归丸含药血清培养原代成骨细胞,阐明Cx43蛋白对先天肾虚影响骨发育的调控机制。方法1)理论研究:阐明肾与骨关系以及先天肾虚影响胎源性骨发育的理论机制。2)体内实验:复制先天肾虚模型仔鼠,雌雄合笼制备30只孕鼠（选用SPF级30只SD雌鼠体重270±20g,15只SD雄鼠体重300±20g,合笼配对）,将孕鼠随机分为对照组、模型组、补肾组,每组10只。采用模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓整个孕期,至胎鼠出生,复制先天肾虚仔鼠模型。造模过程中,对照组孕鼠正常喂养给予生理盐水灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;模型组孕鼠模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓同时给予生理盐水灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;补肾组模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓同时给予左归丸灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;仔鼠出生后,为减小后天喂养影响,将每只孕鼠调整相同仔鼠量喂养至5周。取材膜内化骨的颅骨骨缝和软骨内化骨的骨骺生长板两种骨发育典型部位,对先天肾虚骨发育情况,及Cx43、Sox9、PTHrP的分布规律及表达情况进行相关检测。检测仔鼠3周内平均身长、5周内股骨平均长度、Micro CT检测股骨皮质骨及松质骨微结构参数、第5周股骨钙、磷、羟脯氨酸含量研究先天肾虚仔鼠骨发育的情况;取生后第1周仔鼠颅骨骨缝、第3周股骨生长板及第5周股骨皮质骨,石蜡包埋切片,分别采用HE、藩红固绿、马森染色,进行形态学观察;免疫荧光法、RT-PCR技术及WB技术检测Cx43、Sox9、PTHrP的分布规律及表达情况,各组组间进行比较,所得数据均用sx?表示,用SPSS 17.0软件处理,单因素方差分析组间比较,采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。3)体外实验,培养原代成骨细胞,观察细胞增殖、分化、成熟情况,及Cx43表达和其介导的GJIC功能情况。各组原代成骨细胞取材:雌雄合笼制备孕鼠,分为对照组和模型组;模型组给予模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓至仔鼠出生,对照组正常喂养至仔鼠出生;取模型组仔鼠出生当天颅盖骨培养原代成骨细胞,分为模型组细胞和补肾组细胞;对照组仔鼠出生当天颅盖骨培养原代成骨细胞为对照组细胞。制备左归丸含药血清:采用大鼠灌胃左归丸（1.89/Kg）2次/日,连续5天,末次给药1h后,麻醉大鼠提取左归丸含药血清,灭菌、备用。原代成骨细胞培养:三组均用胶原酶消化法获得成骨细胞进行原代成骨细胞培养,差速贴壁法纯化成骨细胞,待细胞铺满瓶底传代培养,对照组和模型组用小牛血清培养,补肾组给予左归丸含药血清培养21D。倒置显微镜连续观察细胞形态;绘制细胞生长曲线（MTT法）、检测分化情况（ALP活性）、检测成熟情况（茜素红染色法）;并分别于第7、14、21天检测成骨细胞Cx43蛋白及mRNA表达情况,第21天时免疫荧光染色检测Cx43蛋白表达和划痕染料标记示踪法检测GJIC功能检测,各组组间对比,所得数据均用sx?表示,用SPSS 17.0软件处理,单因素方差分析组间比较,采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1)妊娠期复合恐吓刺激孕鼠,引起孕鼠肾精亏虚无力滋养胎鼠,导致模型组孕鼠胎产数减少（P<0.01或P<0.05）,有显着性差异。2)先天肾虚仔鼠平均身长从出生当天到第3周,发现第8天开始至21天身长变短（P<0.05）,有明显性差异;第1、3、5周股骨长度变短（P<0.05）,组间有明显性差异。3)第1周颅骨骨缝形态学观察,与对照组比较,模型组颅骨骨缝略增宽,骨缝内圆形、卵圆形成骨细胞及其前体细胞数量减少;顶骨骨板变薄,板障空间减少。4)第3周股骨远端生长板形态学观察,模型组股骨生长板增殖层变薄,软骨细胞无序排列,细胞稀疏,补肾组生长板各层软骨细胞与对照组形态排列上无明显差异。先天肾虚仔鼠,先天肾精不足,影响膜内化骨典型部位股骨生长板发育迟缓。5)第5周股骨检测骨矿盐密度,结果发现与骨矿盐密度水平下降相应,模型组骨Ca、P含量减少,各组有明显差异（P<0.01或P<0.05）。股骨干皮质骨胶原纤维马森染色观察股骨基质中Ⅰ型胶原纤维形态,各组在形态学上无明显差异。Micro CT扫描检测通过检测,模型组皮质骨厚度、外径周长、皮质骨面积均下降（P<0.01或P<0.05）;扫描远端松质骨微结构发现,模型组在骨小梁厚度、数量、骨体积分数、骨密度上虽有减少表现,但组间比较并无显着性差异（P>0.05）。6)Cx43颅骨骨缝表达结果石蜡包埋切片后行免疫组化检测发现Cx43蛋白在各组织中均染色为棕色,在颅骨骨缝组织中呈高水平表达,主要集中在骨缝边缘区域的成骨细胞及其前体细胞胞浆（成骨细胞、成骨样细胞）,与对照组比较,模型组表达降低（P<0.05）,有显着性差异,与模型组比较,补肾组表达升高（P<0.05）,有显着性差异;WB检测颅骨骨缝Cx43蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细平均灰度值相比较有明显性差异（P<0.01）,有显着性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗（P<0.05）,有明显性差异;RT-PCR检测颅骨骨缝Cx43 mRNA含量表达:与对照组比较,模型C x43 mRNA含量显着性降低（P<0.05）;与模型组比较,补肾组Cx43 mR NA含量显着性升高（P<0.05）;对照组与补肾组比较二者无统计学上差异。7)Cx43股骨表达结果石蜡包埋切片后行免疫组化检测:股骨生长板主要在储备层、其次增殖层表达于软骨细胞的胞浆内,各组间无显着性差异（P>0.05）;股骨干皮质骨表达于骨小梁边缘成骨细胞及骨基质中的骨细胞胞浆上,各组间无显着性差异（P>0.05）;WB检测股骨生长板、股骨皮质骨Cx43蛋白含量:股骨生长板各组条带的粗细和灰度均无明显差异（P>0.05）,股骨皮质骨,各组条带的粗细和灰度均无明显差异（P>0.05）;RT-PCR检测股骨生长板、股骨皮质骨Cx43 mRNA含量:各组股骨生长板、股骨皮质骨Cx43 mRNA含量组间比较:三组股骨干皮质骨Cx43 m RNA均有表达。与对照组比较,模型Cx43 mRNA含量降低,但不显着性降低（P>0.05）,无统计学意义;与模型组比较,补肾组Cx43 mRNA含量升高但不显着性（P>0.05）,无统计学意义。8)Sox9股骨生长板表达结果WB检测股骨生长板Sox9蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细平均灰度值相比较有明显性差异（P<0.05）,有显着性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗（P<0.05）,有明显性差异;RT-PCR检测股骨生长板Sox9 mRNA表达:与对照组比较,模型Sox9 mRNA含量显着性降低（P<0.01）;与模型组比较,补肾组Sox9 mRNA含量显着性升高（P<0.01）;对照组与补肾组比较二者无统计学上差异。9)PTHrP股骨表达结果WB检测股骨生长板PTHrP蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细,平均灰度值相比较有明显性差异（P<0.05）,有显着性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗（P<0.05）,有明显性差异。WB检测股骨皮质骨PTHrP蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细平均灰度值相比较有明显性差异（P<0.05）,有显着性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗（P<0.05）,有明显性差异。RT-PCR检查股骨生长板PTHrP mRNA表达:与对照组比较,模型组仔鼠股骨生长板PTHrP mRNA含量降低,统计学有显着性差异（P<0.05）;与模型组比较,补肾组股骨生长板PTHrP mRNA含量明显升高,统计学有显着性差异（P<0.05）;补肾组与对照组PTHrP mRNA含量无明显性差异（P>0.05）。RT-PCR检查股骨皮质骨PTHrP mRNA表达:与对照组比较,模型组仔鼠股骨干皮质骨PTHrPmRNA含量降低,统计学有显着性差异（P<0.05）;与模型组比较,补肾组股骨干皮质骨PTHrP mRNA含量明显升高,统计学有显着性差异P<0.05);补肾组与对照组PTHrP mRNA含量无明显性差异（P>0.05）。10)PTHrP颅骨骨缝表达结果WB检测颅骨骨缝PTHrP蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细平均灰度值相比较有明显性差异（P<0.05）,有显着性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗（P<0.05）,有明显性差异。RT-PCR检测颅骨骨缝PTHrP mRNA含量表达:与对照组比较,模型组仔鼠颅骨骨缝PTHrP mRNA含量降低,统计学有显着性差异（P<0.05）;与模型组比较,补肾组颅骨骨缝PTHrP mRNA含量明显升高,统计学有显着性差异（P<0.05）;补肾组与对照组PTHrP mRNA含量无明显性差异（P>0.05）。11)颅骨骨缝培养原代成骨细胞MMT法检测成骨细胞增殖和细胞活力,模型组上升趋势缓慢,但各组间比较无显着性差异（P>0.05）。ALP活性检测成骨细胞分化情况,与对照组比较,模型组ALP活性显着性降低（P<0.05）;与模型组比较,补肾组ALP活性显着性升高（P<0.05）,有明显统计学差异。茜红素染色评估成骨细胞成熟情况,与对照组比较,模型组钙化结节面积显着性降低（P<0.05）;与模型组比较,补肾组钙化结节面积显着性升高（P<0.05）,有明显统计学差异。12)成骨细胞Cx43蛋白结果Cx43蛋白荧光反应沉积物主要呈线性点片状沿细胞膜表面排列,模型组Cx43蛋白分布减少（P<0.05）;Cx43 mRNA表达随着细胞分化的进行,Cx43表达量逐渐增高,第7天模型组略低于对照组和补肾组,但无统计学意义（P>0.05）;第14、21天明显低于另两组,P<0.05。Cx43蛋白表达结果与mRNA表达相对应,对照组与模型组对比,差异显着（P<0.05）。13)成骨细胞GJIC功能检测结果各组细胞GJIC功能正常,各组都有荧光黄染料在细胞间的扩散距离;染料扩散面积荧光定量分析显示,与对照组比较,模型组染料扩散面积荧光定量降低,有显着性差异（P<0.01）;与模型组比较,补肾组明显增加（P<0.05）。结论本课题从母代肾精亏虚导致子代先天肾虚影响其骨发育的角度进行了理论阐发,首次提出“先天肾虚与胎源性骨病相关”的学术观点;改进了“恐伤孕鼠肾精”以复制先天肾虚仔鼠动物模型方法,发现先天肾虚仔鼠出现骨骼发育迟缓现象;首次以Cx43为切入点,研究先天肾虚影响仔鼠骨发育的机制。本实验立足“恐伤肾”理论,采用妊娠期模拟地震平台复合光电刺激法导致孕鼠肾精亏虚,无力滋养胎儿,成功复制先天肾虚仔鼠模型,观察仔鼠整体骨发育情况,发现模型仔鼠35天内,身长及股骨长均迟缓,故先天肾精与胎源性骨发育迟缓相关;检测颅骨骨缝发育,发现模型组仔鼠颅骨顶骨骨板变薄,颅骨骨缝发育迟缓,Cx43蛋白及mRNA表达均下降,认为Cx43表达下调是影响先天肾虚仔鼠颅骨骨缝发育机制之一;检测股骨发育,股骨远端骨骺生长板增值层变薄,Cx43表达无明显变化,但是局部PTHrP表达及Sox9表达下调,故先天肾虚仔鼠股骨发育迟缓与局部PTHrP表达及Sox9表达相关;培养原代成骨细胞,发现先天肾虚影响成骨细胞分化、成熟,Cx43表达下降,其介导GJIC下降,故Cx43介导GJIC调控成骨细胞分化成熟是影响颅骨骨缝膜内成骨的可能分子机制之一;补肾组为左归丸能治疗妊娠期肾精亏虚,结果显示身长发育增快,故认为左归丸预防子代儿童期骨发育迟缓,其部分作用机制是调节Cx43介导GJIC阻断仔鼠骨发育迟缓。结论归纳如下:1)妊娠期复合法恐吓刺激孕鼠,影响先天肾虚仔鼠骨发育,故先天肾精与胎源性骨发育迟缓相关。2)Cx43表达下调是影响先天肾虚仔鼠颅骨骨缝发育机制之一。3)Cx43介导GJIC调控成骨细胞分化成熟是影响颅骨骨缝膜内成骨的可能分子机制之一。4)肾精与Cx43介导GJIC功能一致,影响膜内化骨调控骨生长发育,因此,Cx43是肾精的物质基础之一。5)左归丸能治疗妊娠期肾精亏虚,预防其子代儿童期骨发育迟缓。6)Cx43介导GJIC功能是左归丸补肾填精的作用机制之一。7)先天肾虚仔鼠股骨发育迟缓与局部PTHrP表达及Sox9表达相关。
吴志祥[4]（2018）在《mTOR在破骨细胞以及肾间质细胞中的作用》文中指出mTOR信号通路是人体中最为关键的几个通路之一,能接受包括生长因子、能量、营养、压力等多种信息,通过调节RNA转录和蛋白质翻译来调控细胞的生长、分化、增殖、自噬以及细胞骨架结构等。Tsc1是mTOR信号通路上游分子之一,是关键负调控因子,该基因的突变或缺失都可以持续不断激活mTOR。我们构建了LysM-Cre;Tsc1f/f小鼠和Ctsk-Cre;Tsc1f/f小鼠,分别在单核细胞或破骨细胞中通过敲除Tsc1基因激活mTOR,研究了mTOR信号通路在小鼠骨骼中的作用。结果表明两种条件性敲除的小鼠中都出现了骨量增加的现象,该现象可以被mTORC1抑制剂雷帕霉素所抑制,并且发现该现象的形成和成骨细胞的骨生成功能没有直接关系。进一步研究发现单核细胞中条件性敲除Tsc1基因后骨量增加主要是因为破骨细胞的融合出现缺陷,融合的缺陷使得成熟的破骨细胞数量下降,对骨骼的吸收能力减弱,导致骨量增加。破骨细胞系中条件性敲除Tsc1基因后骨量增加主要是因为破骨细胞功能丧失,导致对骨骼的吸收能力不足。骨吸收功能缺陷的原因可能和肌动蛋白及细胞骨架的破坏有关。结节性硬化症是由基因TSC1或者TSC2的突变造成的。调查结节性硬化症患者症状时发现患者的骨骼具有硬化的症状,且患者骨吸收能力减弱,与小鼠模型中的研究结论相符合。结节性硬化症患者的肾脏上也有表型,主要症状有:肾血管平滑肌脂肪瘤、肾囊肿等。我们发现在小鼠的多潜能间质细胞-成骨细胞一系的细胞中,特异性敲除Tsc1基因也能导致小鼠肾脏形成囊肿。用Rosa-tdTomato小鼠,我们发现Prx1和Dermo1标记了肾小球和肾小管细胞。实验结果显示,在Prx1系的细胞中敲除Tsc1基因后能导致中度的肾囊肿;在Osx系的细胞中敲除Tsc1基因后在肾小管中形成数量较多的囊泡。但是在Dermo1系的细胞中敲除Tsc1基因却没有在肾脏上发现有明显表型。研究表明,在Prx1-Cre;Tsc1f/f和Osx-Cre;Tsc1f/f小鼠中,肾脏上囊泡的形成主要由于细胞的增殖和细胞的凋亡,且该现象可被雷帕霉素所抑制。综上所述,实验结果表明有部分的肾小球和肾小管细胞表达了中胚层的标记,这些细胞可能就是结节性硬化症患者患肾囊肿的原因。
王彩霞[5]（2017）在《mTOR信号通路在急性肾损伤和精子发生中的作用与机制研究》文中研究指明雷帕霉素机制性靶蛋白（The mechanistic target of rapamycin,mTOR）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其在体内能形成两种不同的复合物,分别是mTOR complex 1（mTORC1）和mTORC2。尽管大量研究报道了mTOR信号通路在细胞生长、增殖、分化、存活、代谢等多个方面发挥重要作用,但mTOR在体内各种组织细胞中的生理功能远未阐明。本文运用Cre-loxP系统建立组织细胞特异性条件基因敲除小鼠研究mTOR信号通路在肾脏和睾丸中的生理功能及其作用机制。研究分为以下两部分。第一部分是研究敲除肾近端小管细胞中mTORC1和mTORC2的抑制性组分 DEP domain containing mTOR-interacting protein（DEPTOR）对肾生理和急性肾损伤的作用和机制。肾近端小管是肾脏重吸收的重要场所,也是急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）的主要损伤部位。AKI是临床主要肾病,其诱因包括缺血/再灌注,败血症和肾毒素如顺铂,主要表现为肾功能的快速丧失,导致代谢废物的累积以及电解质和体液的不平衡。2009年发现的DEPTOR分子结合mTORC1和mTORC2并抑制其活性,它在肾近端小管生理和AKI中的作用未见报道。本研究中我们首先通过免疫组化（IHC）和western blotting分析了 DEPTOR在近端小管及其顺铂诱导的AKI中的表达变化,然后通过PEPCK-Cre构建了近端小管中特异性敲除DEPTOR的小鼠模型,研究体内DEPTOR对近端小管生理功能以及AKI的作用。IHC和western blotting结果显示DEPTOR在近端小管中表达较低,但在顺铂诱导的AKI晚期表达显着增加。近端小管特异敲除DEPTOR的小鼠无任何明显的发育与生理功能方面的异常表型,但是在顺铂诱导的AKI中表现出组织损伤降低、肾功能较好、细胞凋亡减少,表明敲除DEPTOR保护顺铂诱导的AKI。但是,免疫荧光（IF）、IHC和western blotting显示近端小管敲除DEPTOR不能显着激活mTORC1和mTORC2,尤其在AKI中。我们发现敲除DEPTOR在生理条件和顺铂处理下均抑制p-p38 MAPK表达。研究报道p38 MAPK在AKI中被激活并通过促进TNF-α产生和炎症加重肾损伤。在敲除小鼠和人近端小管细胞系HK-2以及HEK293细胞中的研究均证明敲除DEPTOR抑制p38 MAPK活化和下游TNF-α产生。总之,我们的结果表明DEPTOR敲除可通过mTOR非依赖的p38 MAPK和TNF-α途径保护顺铂诱导的AKI。第二部分通过敲除睾丸精原细胞中mTORC1上游抑制分子TSC1,研究mTORC1在睾丸发育和精子发生中的作用及其分子机制。睾丸精子发生是个连续的、周期性的、复杂的细胞分化和形态变化的过程,由精原细胞开始,分化为精母细胞,再经过减数分裂,并且伴随着一定的形态变化最终形成精子。精原细胞的增殖和分化是精子发生的根本,但mTORC1在其中的作用仍不完全清楚。本研究中我们首先通过IHC和IF分析了小鼠睾丸出生后发育过程中mTORC1在睾丸及其精原细胞中的活性变化,然后通过Stra8-Cre构建了精原细胞中特异性敲除Tsc1的小鼠模型,研究体内mTORC1活化对精原细胞分化以及睾丸精子发生的作用。结果显示精原细胞在出生后发育中显示阶段依赖的mTORC1活性,并在未分化精原细胞中活性非常低,而分化精原细胞中高活性。精原细胞条件性敲除Tsc1小鼠表现出睾丸重量减少、组织缺陷,精子发生滞后,生殖细胞过度凋亡,精子数量减少和生殖能力下降。重要的是,mTORC1激活促进精原细胞分化,抑制其自我更新,从而诱导生殖细胞的过早消耗,损害精子发生。总之,我们的研究表明TSC/mTORC1在维持精原细胞数量和功能以及精子发生中发挥关键作用。
潘正启[6]（2017）在《孕期乙醇暴露致子代大鼠长骨发育不良的宫内RAS编程机制》文中指出骨质疏松症（osteoporosis,OP）是年龄相关性的常见疾病,以骨量下降、骨的微细结构破坏为特征,主要表现为骨脆性增加,骨折风险增大,即使遭受轻微的外力也容易发生骨折。最近十几年,学者们基于大量有关孕期不良环境、胎儿出生体重和成年慢性疾病之间的相关性研究结果,提出了人类疾病起源的概念—“健康与疾病的发育起源”（Developmental Origins of Health and Disease,DOHaD）。流行病学研究结果表明,宫内生长迟缓（intrauterine growth retardation,IUGR）个体成年后峰值骨量降低,成年后罹患骨质疏松症的风险显着增加,由此推测,骨质疏松症具有宫内起源,可能源于宫内及出生后早期的骨发育不良。既往研究表明,成骨定向分化参与了骨发育过程中骨化中心的形成及骨量的维持。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）作为机体重要的内分泌调节系统,参与了骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的成骨定向分化,在骨发育过程中起着重要作用。骨质疏松症存在骨局部RAS活性和AT1R表达增加,同时伴有BMSCs成骨分化功能抑制等现象。但是宫内时期RAS激活与成骨分化、骨化中心生成之间的关系,至今尚未见研究报道。饮酒是日常常见生活行为,部分怀孕妇女在妊娠期间仍饮酒。研究表明,孕期乙醇暴露（Prenatal ethanol exposure,PEE）可引起胎儿发育异常及子代一系列发育相关疾病,如成年后神经精神性疾病和代谢综合征。这类疾病临床表现广泛,统称为胎儿酒精综合征（FAS）,IUGR是其主要特征。本实验室及其他课题组的研究均表明母源性糖皮质激素（glucocorticoid,GC）过暴露是孕期多种不良环境所致IUGR发生的共性现象。有研究提示,GC诱导的OP患者骨局部RAS被激活,成骨分化能力降低。然而,PEE是否会导致子代宫内长骨发育迟缓?这一效应能否持续至出生后?其发生机制是否与母源性高GC所致的RAS慢性激活有关?这些问题均未见报道。为此,本课题拟进行如下工作:1、利用本实验室稳定建立的PEE致子代IUGR模型,证实PEE子代宫内及出生后早期长骨发育不良的现象。2、进一步观察PEE所致子代大鼠长骨局部RAS在不同时间点的变化,探讨PEE致子代大鼠长骨发育不良的宫内编程机制。3、在原、代BMSCs成骨分化模型上,探讨RAS慢性激活介导的高皮质酮对BMSCS成骨分化抑制作用。4、在BMSCs成骨分化模型上,探讨乙醇对BMSCs成骨分化的直接影响。本课题的实施有助于我们更全面的认识PEE子代OP易感现象及其宫内编程机制,更好的理解胎源性OP,也对进一步探索OP的早期预防和治疗方法起到了指导作用。第一部分孕期乙醇暴露致子代长骨发育不良目的:最近十几年,学者们基于大量有关孕期不良环境、胎儿出生体重和成年慢性疾病之间的相关性研究结果,提出了人类疾病起源的概念—“健康与疾病的发育起源”（DOHaD）理论。人群流行病学调查结果表明,出生体重与成年后峰值骨量成正相关,低出生体重人群成年后患骨质疏松症的几率明显增加。本实验室在稳定建立的大鼠IUGR模型中发现,孕期乙醇暴露子代体重、体长较对照组明显降低。为此,我们利用前期稳定建立的IUGR模型,证实孕期乙醇暴露雌性大鼠出生后早期存在长骨发育不良的现象。方法:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和PEE组。从妊娠第9天（gestational day 9,GD9）开始,PEE组给予乙醇（4g/kg·d）暴露灌胃,对照组给予等体积生理盐水,直至孕鼠自然生产。分别于新生（GD20）、出生后（postweek,PW）2周（PW2）及出生后6周（PW6）子代大鼠,测量其体重、体长,分离其股骨,测量股骨长度。HE染色观察骨化中心及生长板长度,Micro CT定量分析股骨干骺端松质骨骨量,骨生物力学测试仪检测股骨脆性。结果:1、与对照组相比,PEE组子代大鼠出生体长缩短,出生体重降低,PW2、PW6体重显着降低,股骨长度显着缩短。2、HE及von Kossa染色发现:与对照组相比,PEE组子代大鼠GD20时股骨全长及骨化中心长度显着缩短,PW2及PW6时生长板的长度变短。3、Micro CT定量分析显示PEE组子代大鼠PW2及PW6干骺端松质骨骨小梁稀疏、变薄,骨小梁连接度降低,骨密度降低,孔隙度增加。4、骨生物力学测试显示,PW2及PW6时,PEE组子代大鼠股骨载荷和绕度均较对照组显着降低。结论:利用本实验室稳定建立的宫内发育迟缓（IUGR）模型,本研究首次提出并证实PEE所致的子代在出生时及出生后早期（PW2及PW6）存在长骨发育不良的现象,主要表现为:股骨长度缩短,初级骨化中心及生长板变短,松质骨骨量减少,骨弹性降低,脆性增加。第二部分母源性糖皮质激素过暴露激活RAS介导PEE所致子代大鼠长骨发育不良目的:大量研究提示,糖皮质激素相关性骨质疏松症患者存在骨局部肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）激活,血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme,ACE）及其受体（angiotensin receptors,AT1R）表达增加,同时伴有成骨分化功能抑制等现象。本实验室前期研究提示,PEE所致IUGR子代胎鼠暴露于母源性高GC的不良宫内环境中。本研究拟在PEE致子代IUGR模型上,从母源性GC过暴露致成骨RAS慢性激活抑制骨化中心形成及骨发育的角度,提出并确证孕期乙醇暴露所致的雌性子代出生后早期长骨发育不良的宫内RAS编程机制。方法:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和PEE组。从GD9开始,PEE组给予乙醇（4g/kg·d）暴露灌胃,对照组给予等体积生理盐水,直至孕鼠自然生产。分别在不同时间点（GD20、PW2、PW6）取子代大鼠股骨松质骨区,用Trizol法提取骨组织RNA,分别检测成骨相关基因及GC活化系统的相关基因的mRNA表达。用直接测序法检测子代大鼠松质骨区ACE基因启动子区DNA甲基化改变。结果:1.在宫内及出生后早期,PEE组子代大鼠骨组织成骨分化相关基因表达抑制。2.在宫内及出生后早期,PEE组子代大鼠骨组织局部RAS激活,具体表现为:ACEmRNA表达增高,AT1R、AT2R表达抑制,AT1R/AT2R比值升高。3.PEE组子代大鼠骨组织GC活化系统被激活,主要表现为:GR及C/EBPamRNA表达水平升高。4、PEE组子代大鼠骨局部ACE基因启动子区处于DNA低甲基化水平。结论:本研究利用孕期乙醇暴露大鼠IUGR模型上,首次发现孕期乙醇暴露雌性子代大鼠在宫内及出生后早期长骨发育迟缓可能与骨局部母源性高GC所致的RAS持续慢性激活（ACE持续高表达,ATRs表达抑制）有关。第三部分高糖皮质激素通过GR/C/EBPα/Dnmts激活RAS抑制BMSCs成骨分化目的:前两部分动物在体实验证实孕期乙醇暴露所致IUGR子代大鼠出生后早期骨发育不良,可能与宫内时期母源性GC过暴露激活RAS导致成骨分化抑制,引起长骨发育不良,这一宫内发育不良现象可以编程至出生后。然而,这一潜在的机制并无直接证据。本实验利用前期稳定建立的BMSCs成骨分化模型,在细胞水平利用GR抑制剂及ACE抑制剂从正反两方面确证高GC-RAS激活-BMSCS成骨分化抑制之间的关系。方法:在本实验室稳定建立的BMSCs成骨分化模型上,我们用不同浓度皮质酮（0、50、250、1250ng/ml）处理细胞,观察其矿化结节染色,用Trizol提取细胞RNA,检测成骨相关基因及RAS组分相关基因的表达。在BMSCs成骨分化模型上,利用GR抑制剂（米非司酮10mM）及ACE抑制剂（依那普利10mM）处理细胞,再加入高浓度皮质酮（1250mM）处理细胞,检测成骨相关基因表达及RAS组分基因表达。同时用直接测序法检测ACE启动子区DNA甲基化改变。结果:1.高浓度皮质酮处理BMSCs,成骨标志基因BSP、BGLAP、Runx2及ALP的mRNA表达显着降低。2.高浓度皮质酮处理BMSCs,GR/C/EBPα增高,RAS被激活（ACEmmRNA表达增高,AT1R、AT2R表达抑制）,ACE DNA总甲基化率降低,DNA甲基转移酶Dnmtl表达显着增高。3.应用GR抑制剂处理BMSCs阻断高GC的作用后,被高GC抑制的BMSCs成骨能力部分逆转,ACE低甲基化及高表达也部分被逆转。4.应用ACEI拮抗部分ACE的作用后,被高GC抑制的BMSCs成骨能力部分逆转。结论:本实验利用BMSCs成骨分化模型,首次证明高浓度皮质酮通过GC活化系统（GR/C/EBPα表达增加）,降低ACE总甲基化率并促进其表达,激活BMSCs RAS,抑制其成骨分化。第四部分乙醇对BMSCs成骨分化的影响及可能机制目的:利用BMSCs成骨分化模型,证实乙醇对BMSCs成骨分化可能存在直接作用,并探讨其可能的分子机制。方法:提取Wistar大鼠原代BMSCs,传代至第3代后,建立BMSCS成骨分化模型诱导其向成骨细胞分化,在定向诱导分化过程中,给予乙醇（0、0.8、4、20、100mM）处理,用MTT法检测细胞增殖,在分化5天后用TRizol收获细胞,检测相关标志基因表达的变化。结果:1、不同浓度乙醇对BMSCs增殖无显着性毒性作用。2、高浓度乙醇（100mM）处理BMSCs,GR/C/EBPα表达增加,成骨分化基因表达抑制。3、高浓度乙醇（1OOmM）处理BMSCs,Egr-1表达增加,11β-HSD2表达抑制。结论:乙醇可能通过激活cAMP/PKA/Egr-1通路而抑制11β-HSD2的表达,减弱细胞局部对GC的屏障作用,而加剧GC对细胞的作用,本部分研究为阐明乙醇可能在孕期乙醇暴露所致长骨发育不良中有直接作用,提供一定的理论依据。
张婕[7]（2018）在《计算机辅助的小鼠肾血管形态发生的三维可视化及定量研究》文中研究指明前言目前对于多种成年哺乳动物（如人类、兔、大鼠、小鼠等）的肾血循环已经有了较详细的描述。然而,对于肾血管的形态发生,特别是肾血管树的分支模式和肾微血管的形态形成,迄今为止还没有一个系统性的描述。以成年小鼠为例,肾动脉经肾门入肾后分为数支沿乳头上行,至皮髓交界处分支横行,形成弓状动脉。弓状动脉在走行过程中不断发出小叶间动脉,后者走行在皮质迷路中又发出许多入球微动脉进入肾小体,随后汇合成出球微动脉。浅表和中层皮质肾单位的出球微动脉离开肾小球后,形成管周毛细血管网,分布在肾小管周围。近髓肾单位的出球微动脉与髓襻伴行进入髓质,形成若干直小血管,是髓质的唯一血供。弓状动脉、小叶间动脉和入球微动脉在本研究中被称之为血管树,主要起营养、支持和运输的作用。皮质的血管球、管周毛细血管网,和髓质中分布的直小血管和丛间区毛细血管网称之为肾脏的微循环。血管球和管周毛细血管网分别参与了肾小体的滤过和肾小管的重吸收,将超滤液中大部分的水和溶质带回体循环;直小血管通过与髓襻的逆流交换,参与维持髓质的渗透梯度,从而确保尿液流经髓质尤其是内髓时被浓缩。上述皮质和髓质区域内的肾血管与相应肾单位之间毗邻关系的建立,是肾脏生理功能实现的结构基础,是在肾脏功能的长期进化过程中按照严格的时空规律发生发育而形成的。和其他器官类似,肾血管的形成包括两种基本生理过程:血管发生（vasculogenesis）和血管新生（angiogenesis）。血管发生是血管内皮祖细胞原位分化形成初级血管丛;血管新生是在已存在血管的基础上,血管内皮细胞通过出芽、套叠、搭桥方式形成新血管的过程。这两种方式形成的血管连接到一起,形成成熟肾脏中庞大而复杂的血管网络。然而,关于肾脏血管的发生和发育,目前仍存在许多未知之处。通过器官移植实验,研究人员首先证明了肾外血管参与了肾脏血管的形成。在胚胎发育早期肾血管还未形成时,一些种属（如大鼠、小鼠和兔）的后肾间充质中存在血管内皮祖细胞,参与血管球和管周毛细血管网的形成。实验进一步发现,除了肾基质中所固有的,还有一部分祖细胞随着肾动脉由肾外进入。因此,肾动脉及其分支形成被认为是血管新生,而血管球和管周毛细血管网的形成依赖于血管发生。基因敲除和转基因动物模型实验表明,一些参与其他器官血管生成的基因和因子,如血管内皮生长因子、血管生成素-1、肾素-血管紧张素等,同样参与了肾血管的发生发育。由于肾脏存在两种不同的形态和功能区域,即肾皮质和髓质,其区域内血管的形态发生模式可能受不同信号因子的调控。例如,足细胞和发育中的肾小管上皮细胞会分泌大量的血管生长因子,促进血管的分支、内皮细胞的增殖和分化等。此外,髓质中的间充质细胞可能也参与了直小血管的形成。最近已有研究发现输尿管芽上皮细胞通过Wnt7b信号通路参与髓质血管网的形成。目前普遍接受的观点是,肾血管的形成与肾单位的上皮发生存在一定联系。肾发生是一个动态过程,始于输尿管芽和后肾间充质之间的相互诱导。后肾间充质诱导输尿管芽不断生长和分支。同时,后肾间充质细胞聚集在输尿管芽泡的周围,先后发育形成肾囊泡、逗号小体、S小体、毛细血管襻期肾单位,最终形成成熟的肾单位。胚胎11.5天,背主动脉的分支（相当于成年的肾动脉）伴随输尿管芽进入肾脏,同时后肾组织中的血管内皮祖细胞出现启动血管发生。在肾脏的发生发育过程中,特别是出生后不久,动脉的分支次数到达成年水平。此阶段血管生成因子的异常表达,例如肾素-血管紧张素基因缺失、血管内皮生长因子突变等,常会造成动脉树的形成缺如,肾小球数目减少,肾脏结构改变和肾功能的退化,导致成年后高血压和渐进性肾功能不全的发病率增加。Brenner在1988年证实了出生时肾小球的数目低下会增加成年时期高血压和慢性肾病的发病率。由于管周毛细血管网与肾小管之间的紧密伴行,高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等引起的慢性肾病常伴随渐进性的血管损伤,如血管内膜增厚,管周毛细血管网稀疏,足细胞缺失导致的肾小球硬化等。因此,系统性的研究肾血管的形态发生,不仅有助于了解先天和后天获得性肾病的发病机理,而且有助于评估肾发生和肾疾病的发展进程,为针对血管靶向治疗以延缓肾疾病的发展提供新的理论依据。本研究在计算机辅助下,三维重建发生发育多个时间点的小鼠肾血管,分析其走行及毗邻关系的演变;在连续组织切片的基础上,血管内皮标识蛋白CD34免疫组化染色观察微血管的形态形成,结合无偏体视学方法分析微血管体积密度在发生发育过程中的改变,为发生发育肾生理及病理机制的研究提供形态学依据。实验方法1、肾脏连续切片的制备:取胚胎（E）14.5天至生后（P）多个时间点的胎鼠、仔鼠或成鼠各3只。取全肾（胎鼠）或肾组织块（生后较大龄鼠肾）,制备5μm连续的石蜡切片以及2.5μm连续的树脂切片。2、连续显微图像的摄取及配准:采用TDI线性扫描系统获取高分辨率的连续显微图像,并采用自主研发的软件将连续显微图像进行配准。3、发生发育多时间点小鼠肾血管的数字追踪及三维可视化:将配准后的显微图像输入计算机Linux平台的数字追踪程序,对目的血管进行数字追踪。数字追踪产生的三维坐标集输入可视化软件中以展示肾血管空间走行,分析其毗邻关系,并进行长度、直径等形态参数的测量。4、血管内皮细胞标记物CD34的免疫组织化学:按照随机原则,自连续切片中抽取包含皮质和髓质不同水平面的目的切片至少3张,并进行血管内皮细胞标记蛋白CD34的免疫组织化学染色。5、发生发育肾皮质和髓质中微血管体积密度的测量:Nikon90i电子显微镜20倍镜下拍照,Photoshop CS6软件中全视野叠加体视学网格测试系统,分别计数落在CD34阳性血管和参照系上的测点数,计算血管球和管周毛细血管网的体积密度。实验结果1、发生发育小鼠肾血管的走行及毗邻关系E14.5可见由背主动脉分支而来的肾动脉随输尿管芽进入肾脏,并且分支形成6支主干走行在皮髓交界（相当于成鼠弓状动脉）。弓状动脉在走行时,每隔一段距离向皮质发出若干侧支（相当于成鼠小叶间动脉）。大部分侧支走行过程中作为主干再分支12次,发出细小分支（相当于成鼠入球微动脉）连接发育早期的肾单位。根据发生的先后,肾单位依次排分布在皮质的不同深度,即发育越早,肾单位在皮质的位置越深。近髓肾单位的出球微动脉与同一肾单位的髓襻升支粗段伴行,下行进入髓质。同时,弓状静脉或小叶间静脉发出的直小血管上升支与髓襻降支粗段伴行。直小血管上升支和下降支存在紧密的伴行关系,但未观察到有血管襻相连。与E14.5相比,E17.5血管树分支的次数和肾单位的数量明显增加。此阶段肾乳头形成,并随着肾脏的发育,其长度逐渐增加。P5不再有新的小叶间动脉自弓状动脉发出,前者分支次数与成年相同,为14次。与成年相比,P5肾血管的空间走行仍存在一定差异,主要表现在此时动静脉的弓状走行仍不明显,小叶间动脉也没有明显的垂直于被膜走行。数字追踪软件对肾动脉管径测量结果显示:E14.5弓状动脉、小叶间动脉和入球微动脉的直径分别为2030μm、1020μm、510μm。E17.5弓状动脉、小叶间动脉和入球微动脉的直径分别为2045μm、1530μm、10μm左右。P5弓状动脉、小叶间动脉和入球微动脉的直径分别为4065μm、1545μm、1015μm。肾血管发育过程中,与发育早期肾单位相连的入球微动脉管径细小。2、CD34在发生发育小鼠肾血管中的表达CD34是血管内皮细胞的标记蛋白。E14.5,CD34阳性表达分布在幼稚的肾小管周围血管和血管球内皮表面细胞膜上。被膜下的生肾区可见CD34阳性的内皮细胞散在分布,大量发育早期无CD34表达的肾单位（囊泡期、逗号小体期）。血管性的肾小球首先出现在S小体期,此时CD34阳性的血管在第一裂隙形成简单的血管襻,并且与入球和出球微动脉相连。髓质中充满大量网状的间充质细胞,垂直于输尿管芽干,且无CD34阳性表达。髓质中的微血管围绕输尿管芽干生长。随着肾脏的发生发育,生肾区的厚度逐渐减少,被膜下的CD34阳性的血管逐渐增加,皮质内血管球的数量和体积增大,管周毛细血管网以及髓质各区域中微血管的密度增加。P7外髓内带可见血管丛,但其结构尚未形成。3、发生发育小鼠微血管体密度的测量血管球的体积密度在整个发育过程中变化不大,E14.5为4.61±0.47%,E16.5增加到5.88±0.33%,P7达到最大值6.07±0.2%,P40稳定在4.19±0.47%。皮质和髓质管周毛细血管网的体积密度在发生发育过程中分别增加了3.3和2.6倍,E14.5为2.34±0.13%和7.03±0.09%,P40增加到7.71±0.44%和18.27±1.17%。髓质由于结构的特殊性,在发育不同时期采用了不同的参照系,其测量数值也因区域而不同,但总的趋势都是随着鼠龄的增长而增加。P1至P3,外髓、内髓中微血管的体积密度分别稳定在10%和12%左右。外髓外带、外髓内带和内髓中微血管的体积密度分别增加了1.2,1.4和1.6倍,由P5的11.61±1.16%,16.55±2.93%和16.32±1.17%,分别增加到P40的14.27±1.07%,22.5±1.25%和25.54±2.77%。实验结论1、肾血管形态发生存在分支（Branching）及出芽（Sprouting）两种交替出现的模式:肾动脉主干（弓状动脉）在走行中以分支形式（直径均等）生长及增加,在皮髓交界走行中以出芽形式（直径细小）形成小叶间动脉,后者又分支为多支,再以出芽方式形成入球微动脉。血管的出芽具有方向性,提示肾不同区域内存在不同的血管生长诱导信号。2、小鼠肾血管随着生后5天肾单位的停止发生而不再有新的小叶间动脉和入球微动脉生成,但是其血管的发育（例如直径、长度、血管走行方式等）随着肾脏的发育继续进行。尤其是随着近髓肾单位的发育,髓质中直小血管与髓襻伴行增多,血管束密度也随之增加,提示与髓质渗透梯度形成相关的肾尿液浓缩机制的形成主要取决于生后肾髓质发育的完善。3、皮质中血管球的体积密度变化不大,提示肾滤过功能在发生发育过程中一方面适应肾小管的发育及重吸收功能的形成,另一方面适应机体代谢总水平的需求。
陈金绪,颜池[8]（2014）在《小鼠肾发育中的细胞凋亡研究》文中提出目的探讨小鼠肾脏发育过程中的细胞凋亡规律及相关形态学特征。方法在树脂切片上,应用光镜技术和原位末端标记法（TUNEL）分别观察不同胚龄及生后不同日龄小鼠肾脏细胞凋亡。结果胚龄12 d的小鼠肾脏输尿管芽中即存在细胞凋亡现象,皮质凋亡细胞多出现在生肾区S小体之间和肾小体内,皮质中的肾小体凋亡高峰期在胚龄1418 d。而肾小管、髓放线及髓质凋亡细胞出现在肾小管上皮内,三者的凋亡高峰期均出现在生后7 d左右。观察发现皮质和髓质凋亡细胞被邻近细胞吞噬,或部分脱落到肾小管腔内。结论小鼠肾脏发育过程中存在细胞凋亡,凋亡现象在后肾形成时即存在;皮质中细胞凋亡与生肾区的出现和肾小体发育完善有关,髓质中的细胞凋亡则与髓质中肾小管和集合管的改建、完善有关。
徐卓[9]（2014）在《成纤维细胞生长因子家族在肾脏疾病中的作用和机制研究》文中研究指明急性肾损伤（Acute Kidney Injury, AKI）是一系列因素引起肾功能迅速恶化的临床综合征。虽然近年来人们在临床实践和实验研究中对AKI进行了大量的研究,但目前对于AKI患者仍以透析及对症支持治疗为主。成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factors, FGFs）广泛参与包括细胞增殖、分化、迁移、胚胎发育、血管生成调节以及损伤修复等在内的多种生物学过程。然而其在AKI中的作用特别是对损伤后肾小管上皮细胞存活的作用还有待研究。本部分研究首先通过缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion Injury, IR/I）以及腹腔注射顺铂建立AKI小鼠模型,研究损伤后肾组织中FGFs的表达变化以及细胞内下游信号通路的激活情况。实验发现：IR/I肾损伤后肾组织内FGF2、 FGF7、FGF10、FGF12、FGF13、FGF18以及FGF22表达上调；而顺铂注射后肾组织中仅FGF2和FGF 18表达增加。上述两种AKI模型肾组织中Erkl,2磷酸化水平均增加。为进一步研究FGFs-FGFR信号在AKI中的作用,我们通过Cre-LoxP系统建立肾小管上皮细胞FGFR2基因敲除的小鼠模型。肾小管上皮细胞FGFR2基因敲除小鼠在出生后16w内未出现明显肾功能异常,但该基因敲除能够加重IR/I或顺铂诱导的肾功能损伤、增加肾小管上皮细胞凋亡以及抑制Erk1,2信号的激活。在体外培养的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）系中,重组FGF2蛋白可以激活Erkl,2信号以及抑制顺铂诱导的细胞凋亡。MEK1/2抑制剂PD98059可以阻断FGF2引起的Erkl,2磷酸化并且减弱FGF2对细胞凋亡的保护作用。因此,本部分研究证明在IR/I和顺铂诱导的急性肾损伤中,FGF2-FGFR2信号的激活可以通过抑制肾小管上皮细胞凋亡从而发挥肾脏保护作用,并且这个作用部分依赖于Erk1,2信号途径的激活。慢性肾脏病（Chronic Kidney Diseases, CKD）在我国有高达10%的发病率且呈逐年增加的趋势。肾小管间质纤维化的程度是决定CKD进展的关键性病理因素。肾间质中的肌成纤维细胞作为纤维化过程中最主要效应细胞,其数目决定肾脏纤维化的程度和疾病的进展。成纤维生长因子7 （Fibroblast Growth Factor 7, FGF7）是一类旁分泌型FGF家族蛋白,在肾脏发育过程中起着关键作用,然而其在肾脏纤维化中作用特别是对间质成纤维细胞作用还有待研究。本部分研究首先通过尾静脉注射FGF7全长表达质粒建立FGF7高表达小鼠模型以及建立缺血再灌注后肾脏纤维化模型,研究FGF7对肾脏间质纤维化的影响；利用Cre-LoxP细胞建立成纤维细胞FGFR2基因缺失的小鼠模型,进一步研究FGF7-FGFR2信号对肾脏纤维化的作用以及间质损伤后成纤维细胞增殖、活化以及对细胞外基质合成的影响；最后在培养的大鼠成纤维细胞系（NRK-49F）细胞中研究体外FGF7高表达对成纤维细胞增殖的影响。实验发现：体内FGF7高表达可以加重IR／I后肾间质纤维化的程度；成纤维细胞FGFR2基因缺失可以显着抑制肾间质胶原的沉积、细胞外基质成分—纤维连接蛋白（Fibronectin, FN）的合成以及肾间质成纤维细胞增殖和活化；并且FGFR2基因敲除抑制纤维化模型中肾组织内Erk1,2的活化；最后,在NRK-49F细胞中,转染FGF7质粒可以促进FN的合成以及诱导细胞发生增殖。因此,本部分研究证明在肾脏纤维化过程中,FGF7信号高表达可以通过促进成纤维细胞的增殖和活化而加剧肾间质纤维的程度；成纤维细胞FGFR2基因敲除可以显着抑制肾间质成纤维细胞增殖和活化及减轻肾纤维化的程度。肾脏纤维化以肾小球硬化和间质纤维化为主要特征,是各种原因所致ESRD的共同病理学特征。间质巨噬细胞浸润以及表型转化是影响慢性肾脏病转归和肾间质纤维化的关键因素。成纤维细胞生长因子23（FGF23）在CKD患者循环中浓度显着增高,然而其在肾脏病变进展中具体病理生理意义仍不清楚。本研究首先通过尾静脉注射FGF23全长表达质粒使体内FGF23高表达,然后建立阿霉素（ADR）肾病模型,研究FGF23高表达对ADR诱导的早期足细胞损伤和后期。肾间质纤维化以及肾小球硬化的影响,并观察体内FGF23高表达对肾脏内巨噬细胞极性的影响；在体外培养的小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）中研究FGF23高表达对巨噬细胞表型改变的作用以及具体分子机制；最后,在单侧输尿管梗阻（UUO）模型中验证FGF23高表达对肾脏间质纤维化的作用。实验发现,FGF23高表达加重ADR肾病模型中小鼠肾间质胶原沉积以及肾小球硬化程度；FGF23高表达可以促进纤维化的肾组织内巨噬细胞趋化因子TNF-α、MCP-1以及Rantes mRNA表达增加以及M2型巨噬细胞聚集；在体外培养的RAW264.7细胞中,FGF23高表达促使巨噬细胞表型向M2转化；最后在UUO模型中,FGF23高表达同样能够加剧肾间质纤维化的程度。因此,本部分研究证明在ADR肾病模型中,循环FGF23信号高表达可以诱导肾组织内M2型巨噬细胞聚集以及加剧肾脏纤维化程度。
杜娟,宋小峰,郭敏[10]（2013）在《小鼠肾脏发育中光镜和电镜的体视学分析》文中提出目的对小鼠肾脏发育中各组成结构进行体视学测量和分析,以提供小鼠肾发育的基础数据。方法应用光镜和电子显微镜技术结合体视学分析方法对小鼠肾脏发育各阶段的肾脏大体、各部组成、皮质肾小体及集合管上皮主细胞进行了详细观察和体视学测量与分析。结果大体测量:肾脏长度和体积生后17 d、2128 d增加非常显着（P<0.01）。光镜测量:皮质体积胚龄18 d到生后1 d增加非常显着（P<0.01）;髓质体积生后114 d、2128 d增加显着（P<0.05）;内髓生后21 d出现,以后体积变化不明显;皮质肾小体体积从胚龄18 d到生后40 d大约增大30倍。电镜测量:集合管上皮主细胞侧基底细胞膜面密度生后3 w内迅速增长,截面积胚龄18 d到生后7 d增加显着。结论小鼠肾脏各部组成从胚龄18 d开始体积迅速增长,到生后28 d发育接近成年水平。
二、生后小鼠肾脏皮质发育过程中的细胞增殖（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、生后小鼠肾脏皮质发育过程中的细胞增殖（论文提纲范文）
（1）发生发育小鼠肾小球形态计量学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠发生发育肾组织石蜡连续切片和树脂超薄切片的制备 |
| 2.2.2 石蜡切片苏木精-伊红染色法(HE染色法) |
| 2.2.3 石蜡切片免疫组化染色 |
| 2.2.4 小鼠发生发育肾的二维测量 |
| 2.2.5 体视学测量 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 发生发育生肾区及肾小球的形态学变化 |
| 3.2 发生发育肾小球超微结构和形态学变化 |
| 3.3 发生发育中成对输尿管芽泡间的距离变化 |
| 3.4 发生发育生肾区及皮质厚度的变化 |
| 3.5 CD34阳性表达占发生发育肾小球的体积密度 |
| 3.6 不同发育时间点中肾小球占皮质的体积密度 |
| 4 讨论 |
| 4.1 发生发育生肾区及输尿管芽泡间距离变化的意义 |
| 4.2 发生发育肾皮质厚度变化的意义 |
| 4.3 发生发育肾小球的形态及毛细血管襻变化的意义 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 存在的科学问题 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 1.4 科学意义 |
| 第一部分 前列腺基底干细胞维持基底上皮细胞特征和正常发育 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 上皮组织概述 |
| 1.2 基底上皮细胞特征维持中的EMT机制及分裂模式 |
| 1.3 EMT特征维持的信号通路 |
| 第二章 实验材料与操作方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及人组织样本 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器耗材 |
| 2.2 实验操作方法 |
| 2.2.1 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.2 原代细胞获得及细胞流式分选 |
| 2.2.3 细胞甩片及免疫荧光染色 |
| 2.2.4 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.2.5 石蜡切片及其H&E染色 |
| 2.2.6 质粒抽提实验 |
| 2.2.7 病毒制备及目的细胞感染 |
| 2.2.8 类器官培养及功能检测 |
| 2.2.9 泌尿生殖窦间质细胞分离及培养 |
| 2.2.10 原代前列腺上皮细胞分离及肾包膜移植实验 |
| 2.2.11 谱系示踪实验 |
| 2.2.12 单细胞RNA测序和数据分析 |
| 2.2.13 实时定量聚合酶链式反应 |
| 2.2.14 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 发现EMT转录因子表达的前列腺上皮细胞 |
| 3.2 高通量单细胞RNA-seq发现Zeb1~+前列腺上皮细胞群 |
| 3.2.1 获得前列腺基底上皮单细胞 |
| 3.2.2 获得高质量单细胞RNA测序数据 |
| 3.2.3 单细胞RNA-seq数据分析得到Zeb1~+基底上皮细胞亚群 |
| 3.3 Zeb1~+上皮细胞与前列腺上皮组织之间的相关性研究 |
| 3.3.1 成功构建Zeb1 荧光报告小鼠 |
| 3.3.2 Zeb1 在前列腺上皮细胞中的分布及表达模式 |
| 3.4 Zeb1~+前列腺基底上皮细胞的生物学功能研究 |
| 3.4.1 体外Zeb1~+基底上皮细胞类器官形成实验 |
| 3.4.2 体内Zeb1~+基底上皮细胞肾包膜移植实验 |
| 3.4.3 体内谱系示踪Zeb1~+基底上皮细胞多向分化的命运 |
| 3.4.4 Zeb1 保证基底上皮细胞正常发育 |
| 3.5 Wnt信号通路正向调控Zeb1~+基底上皮细胞 |
| 3.5.1 单细胞RNA-seq数据显示Zeb1~+基底上皮细胞富集Wnt信号通路 |
| 3.5.2 qRT-PCR实验结果支持单细胞RNA-seq数据分析结果 |
| 3.5.3 APCmin模型小鼠中Zeb1~+基底上皮细胞比例显着增多 |
| 3.6 研究模型图及小结 |
| 第四章 实验结论、讨论及展望 |
| 4.1 实验结论 |
| 4.2 讨论和展望 |
| 4.3 科学意义 |
| 第二部分 细胞连接、细胞极性和细胞分裂轴定位共同维持前列腺管腔上皮细胞的组织特征 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 上皮细胞极性的建立及维持 |
| 1.1.1 上皮细胞极性组成-PAR complex |
| 1.1.2 上皮细胞极性组成-Scribble complex |
| 1.1.3 上皮细胞三种极性蛋白复合物之间的互作及应用 |
| 1.2 上皮细胞间连接的建立及功能 |
| 1.3 细胞分裂模式基础知识 |
| 1.3.1 细胞分裂模式相关分子调控机制 |
| 1.3.2 细胞分裂模式研究的应用 |
| 第二章 实验材料与操作方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物、细胞系、质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器耗材 |
| 2.2 实验操作方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 石蜡切片及其免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 细胞增殖 |
| 2.2.4 细胞实时示踪实验 |
| 2.2.5 内源性免疫共沉淀 |
| 2.2.6 GST-pull down实验 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 黏附连接蛋白集中表达及分布在成年小鼠前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.1.1 qRT-PCR结果显示黏附连接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.1.2 免疫荧光染色结果表明黏附连接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.2 黏附连接E-cadherin缺失促进前列腺管腔上皮细胞增殖能力及肿瘤发生发展 |
| 3.2.1 体外E-cadherin表达下调促进前列腺上皮细胞增殖能力 |
| 3.2.2 E-cadherin前列腺特异性敲除小鼠模型构建及表型探究 |
| 3.3 黏附连接蛋白E-cadherin表达缺失导致细胞分裂轴定位异常 |
| 3.3.1 体外黏附连接蛋白表达下调严重影响细胞分裂轴正确定位 |
| 3.3.2 体内黏附连接缺陷造成管腔上皮细胞分裂轴偏转随机化 |
| 3.3.3 体外黏附连接蛋白表达下调显着减弱蛋白LGN-NUMA的结合能力 |
| 3.3.4 体内黏附连接缺失导致LGN蛋白复合物细胞膜分布异常 |
| 3.4 黏附连接蛋白E-cadherin丢失导致细胞极性蛋白复合物弥散分布 |
| 3.4.1 体外敲低黏附连接蛋白表达水平显着削弱蛋白DLG-SCRIB的结合能力 |
| 3.4.2 体内黏附连接缺失造成细胞极性蛋白复合物分布异常 |
| 3.5 考察细胞连接、细胞极性和分裂轴定位三者间的互作及分子机制 |
| 3.5.1 RNA-seq分析结果支持细胞连接、极性和分裂轴定位之间存在紧密互作 |
| 3.5.2 增殖活跃的E-cadherin蛋白表达缺失的管腔上皮细胞更易发生肿瘤转化 |
| 3.5.3 E-cadherin/SCRIB/LGN三元复合物的形成维持前列腺管腔上皮组织结构 |
| 3.6 研究模型图及小结 |
| 第四章 实验结论、讨论及展望 |
| 4.1 实验结论 |
| 4.2 讨论和展望 |
| 4.3 科学意义 |
| 全文总结 |
| 1.1 研究总结 |
| 1.2 研究创新性 |
| 1.3 科学意义 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（3）基于Cx43蛋白研究先天肾虚影响仔鼠骨发育的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 肾与骨 |
| 1.1 肾形态及功能 |
| 1.2 骨形态及功能 |
| 2 “肾主骨”中医学研究 |
| 2.1 理论起源 |
| 2.2 运用发展 |
| 2.3 物质基础 |
| 3 “肾主骨”现代医学研究 |
| 3.1 发育学-肾骨同源 |
| 3.2 肾-骨盐平衡 |
| 3.3 肾脏-促红细胞生成素-骨 |
| 3.4 肾脏通过其他途径调节骨的生长发育 |
| 4 先天肾虚与胎孕遗传 |
| 4.1 母代肾虚导致子代先天肾虚 |
| 4.2 先天肾虚导致胎源性疾病发生 |
| 5 结语 |
| 第二部分 体内实验研究 |
| 实验1 先天肾虚仔鼠骨发育实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 造模及分组 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器、试剂及耗材 |
| 1.5 检测指标 |
| 2 结果 |
| 2.1 孕鼠一般情况及胎产数 |
| 2.2 每窝仔鼠数调整结果 |
| 2.3 仔鼠平均身长测量 |
| 2.4 仔鼠股骨平均长度测量 |
| 2.5 仔鼠股骨生长板藩红固绿染色结果 |
| 2.6 仔鼠颅骨骨缝HE染色结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 孕鼠肾精亏虚 |
| 3.2 先天肾虚仔鼠身长发育影响 |
| 3.3 先天肾虚对股骨骨骺生长板发育影响 |
| 3.4 先天肾虚对颅骨骨缝发育影响 |
| 实验2 Cx43 蛋白对先天肾虚仔鼠股骨发育影响的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及分组 |
| 1.2 造模方法 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器、试剂及耗材 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 仔鼠股骨钙、磷、羟脯氨酸含量测定 |
| 2.2 Micro CT动态检测仔鼠股骨干皮质骨、松质骨 |
| 2.3 股骨胶原纤维马森染色 |
| 2.4 股骨Cx43 蛋白免疫组化结果 |
| 2.5 股骨生长板Cx43、Sox9、PTHrP蛋白WB结果 |
| 2.6 股骨生长板Cx43、PTHrP、Sox9mRNA结果 |
| 2.7 股骨皮质骨Cx43、PTHrP蛋白WB结果 |
| 2.8 股骨皮质骨Cx43、PTHrP mRNA结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 先天肾虚对股骨发育影响 |
| 3.2 Cx43 表达对先天肾虚仔鼠股骨发育影响 |
| 3.3 PTHrP表达对先天肾虚仔鼠股骨发育影响 |
| 3.4 Sox9 表达对先天肾虚仔鼠股骨生长板影响 |
| 实验3 Cx43 蛋白对先天肾虚仔鼠颅骨发育影响的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及分组 |
| 1.2 造模方法 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器、试剂及耗材 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 颅骨骨缝Cx43 蛋白免疫组化结果 |
| 2.2 颅骨骨缝Cx43、PTHrP蛋白WB结果 |
| 2.3 颅骨骨缝Cx43、PTHrP基因RT-PCR结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 Cx43 蛋白对先天肾虚仔鼠颅骨骨缝发育影响 |
| 3.2 PTHrP表达对先天肾虚仔鼠颅骨骨缝发育影响 |
| 第三部分 体外细胞实验研究 先天肾虚仔鼠成骨细胞Cx43 表达及GJIC功能检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及取材 |
| 1.2 左归丸含药血清配制 |
| 1.3 试剂及仪器 |
| 1.4 原代成骨细胞培养 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态学观察 |
| 2.2 MTT法检测成骨细胞增殖结果 |
| 2.3 茜素红染色检测成骨细胞分化结果 |
| 2.4 ALP活性检测成骨细胞成熟结果 |
| 2.5 Cx43 蛋白免疫荧光表达 |
| 2.6 Cx43mRNA表达结果 |
| 2.7 Cx43 蛋白表达WB检测结果 |
| 2.8 GJIC功能检测结果 |
| 3 讨论 |
| 讨论 |
| 1 先天肾虚模型建立评估 |
| 2 先天肾虚与胎源性骨发育 |
| 3 肾精-Cx43-骨发育 |
| 4 左归丸改善先天肾虚骨发育的作用机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 综述 Cx43介导细胞缝隙连接对骨发育影响研究 |
| 参考文献 |
| 2 发表论文 |
| 致谢 |
（4）mTOR在破骨细胞以及肾间质细胞中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 在单核细胞和破骨细胞中激活mTOR信号通路对骨骼形态和结构的影响 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 mTOR信号通路 |
| 1.1.1 mTOR的结构和功能 |
| 1.1.2 mTOR和肿瘤的关系 |
| 1.1.3 mTOR和自噬的关系 |
| 1.1.4 mTOR和衰老的关系 |
| 1.1.5 TSC1、TSC2 的结构和功能 |
| 1.2 骨骼 |
| 1.2.1 骨骼的类型、结构和功能 |
| 1.2.2 骨骼的形成 |
| 1.2.3 骨骼生长和重塑 |
| 1.2.4 骨骼中的细胞 |
| 1.3 造血干细胞 |
| 1.3.1 造血干细胞及单核细胞 |
| 1.3.2 破骨细胞 |
| 第二章 实验材料和实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.1.5 配制的试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 鉴定基因敲除小鼠的基因型 |
| 2.2.3 鉴定Cre转基因小鼠的基因型 |
| 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 小鼠解剖、取材和器官离体保存 |
| 2.2.6 小鼠组织的石蜡包埋和组织切片 |
| 2.2.7 小鼠组织的树脂包埋和组织切片 |
| 2.2.8 组织切片的常规脱蜡和复水 |
| 2.2.9 苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin)染色 |
| 2.2.10 组织切片的Masson染色 |
| 2.2.11 组织切片的von Kossa染色 |
| 2.2.12 组织切片的免疫组化染色 |
| 2.2.13 小鼠骨髓MSCs分离培养 |
| 2.2.14 小鼠骨髓MSCs克隆形成实验 |
| 2.2.15 小鼠骨髓单核细胞的分离培养、诱导分化 |
| 2.2.16 小鼠破骨细胞的Trap染色 |
| 2.2.17小鼠破骨细胞骨吸收能力实验 |
| 2.2.18 提取细胞中的总蛋白 |
| 2.2.19 提取组织中的总蛋白 |
| 2.2.20 蛋白的定量、变性和保存 |
| 2.2.21 Western Blot实验 |
| 2.2.22 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.23 RNA逆转录 |
| 2.2.24 荧光定量PCR |
| 2.2.25 小鼠血清及尿液无机磷测定实验 |
| 2.2.26 小鼠血清及尿液钙离子测定实验 |
| 2.2.27 小鼠血清及尿液肌酐测定实验 |
| 2.2.28 小鼠血清及尿液DPD测定实验 |
| 2.2.29 实验数据分析和处理 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 在单核细胞特异性敲除Tsc1 后小鼠长骨表型分析 |
| 3.2 在破骨细胞系中特异性敲除Tsc1 后小鼠长骨表型分析 |
| 3.3 mTOR信号通路激活抑制破骨细胞的分化和融合 |
| 3.4 mTOR激活抑制了破骨细胞骨吸收能力 |
| 3.5 雷帕霉素可以部分挽救Tsc1 敲除所导致的骨骼异常 |
| 3.6 mTOR通过NF-κB通路调节分化破骨细胞 |
| 3.7 结节性硬化症患者骨骼异常和骨吸收能力下降有关 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 总结和展望 |
| 第二部分 在小鼠多潜能间质细胞中激活mTOR通路导致肾脏出现囊肿症状 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 肾脏 |
| 1.1.1 肾脏结构 |
| 1.1.2 肾单位及功能 |
| 1.1.3 常见肾脏疾病 |
| 1.1.4 多囊肾 |
| 1.2 多潜能间质细胞 |
| 1.2.1 多潜能间质细胞的来源、分化潜能 |
| 1.2.2 多潜能间质细胞的生物标记 |
| 1.2.3 多潜能间质细胞在肾脏疾病中治疗的意义 |
| 1.4 mTOR信号通路 |
| 1.4.1 mTOR通路与足细胞 |
| 1.4.2 mTOR通路与肾小管上皮细胞 |
| 1.4.3 mTOR通路与肾小管血管内皮细胞 |
| 1.4.4 mTOR通路与自噬调节 |
| 1.4.5 mTOR通路与肾脏衰老 |
| 1.4.6 在多囊肾中的mTOR信号通路 |
| 第二章 实验材料和实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.1.5 实验所需试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 鉴定基因敲除小鼠的基因型 |
| 2.2.3 鉴定Cre转基因小鼠的基因型 |
| 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 小鼠解剖、取材和器官离体保存 |
| 2.2.6 小鼠组织的石蜡包埋和组织切片 |
| 2.2.7 组织切片的常规脱蜡及组织复水 |
| 2.2.8 苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin)染色 |
| 2.2.9 冰冻包埋和组织切片 |
| 2.2.10 免疫组化染色(DAB法) |
| 2.2.11 免疫荧光染色 |
| 2.2.12 组织细胞凋亡实验 |
| 2.2.13 肾脏囊泡指数测量 |
| 2.2.14 实验数据分析和处理 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 谱系追踪实验证实Prx1 在小鼠肾脏中有表达 |
| 3.2 在Prx1~+多潜能间质细胞中敲除Tsc1 导致小鼠出现轻度肾脏囊肿 |
| 3.3 雷帕霉素能抑制Prx1-Cre;Tsc1~(f/f)小鼠肾脏囊肿形成 |
| 3.4 Prx1-Cre;Tsc1~(f/f)小鼠肾脏中细胞凋亡和增殖都上调 |
| 3.5 Osx-Cre;Tsc1~(f/f)小鼠表现为肾脏囊肿现象且能被雷帕霉素所抑制 |
| 3.6 Osx-Cre;Tsc1~(f/f)小鼠肾脏中细胞凋亡和增殖都上调 |
| 3.7 在Dermo1+细胞中敲除Tsc1 基因后没有发现肾脏病理表型 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写对照表 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
（5）mTOR信号通路在急性肾损伤和精子发生中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 mTOR信号通路 |
| 1.1.1 TSC1/2-mTORC1通路 |
| 1.1.2 DEPTOR |
| 1.2 急性肾损伤 |
| 1.2.1 急性肾损伤的发生与肾脏保护 |
| 1.2.2 顺铂诱导的急性肾损伤 |
| 1.3 睾丸与生殖 |
| 1.3.1 睾丸精子发生 |
| 1.3.2 精原细胞 |
| 第二章 DEPTOR在急性肾损伤中的作用与机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 在顺铂诱导的AKI中,肾近端小管中的DEPTOR表达增加 |
| 2.3.2 肾近端小管细胞特异性敲除DEPTOR小鼠模型的构建 |
| 2.3.3 正常生理条件下DEPTOR对肾近端小管是非必需的 |
| 2.3.4 肾近端小管细胞特异性敲除DEPTOR改善顺铂诱导的AKI |
| 2.3.5 肾近端小管细胞特异性敲除DEPTOR抑制顺铂诱导的细胞凋亡 |
| 2.3.6 在顺铂诱导的AKI中,DEPTOR不是通过调节mTOR发挥作用 |
| 2.3.7 体内DEPTOR敲除通过抑制p-p38保护顺铂诱导的AKI |
| 2.3.8 在细胞系中,DEPTOR促进p38磷酸化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论与展望 |
| 第三章 mTORC1在睾丸精原细胞中的作用与机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 精原细胞在出生后发育过程中显示不同的mTORC1活性 |
| 3.3.2 精原细胞特异性敲除Tsc1小鼠的构建和鉴定 |
| 3.3.3 精原细胞mTORC1活化导致睾丸发育异常 |
| 3.3.4 精原细胞mTORC1活化导致精子发生阻滞 |
| 3.3.5 精原细胞mTORC1活化导致细胞凋亡增加 |
| 3.3.6 精原细胞mTORC1活化促进细胞分化,抑制细胞自我更新 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 博士研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）孕期乙醇暴露致子代大鼠长骨发育不良的宫内RAS编程机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 ABSTRACT 引言 第一部分 |
| 孕期乙醇暴露致雌性子代长骨发育不良 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 4. |
| 小结 第二部分 |
| 母源性糖皮质激素过暴露激活RAS介导孕期乙醇暴露所致子代大鼠长骨发育不良 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 4. |
| 小结 第三部分 |
| 高糖皮质激素通过GR/C/EBPA/DNMTS激活ACE抑制BMSCS成骨分化 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 4. |
| 小结 第四部分 |
| 乙醉对BMSCS成骨分化的影响及可能机制 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 4. |
| 小结 参考文献 综述 参考文献 攻博期间科研成果目录 致谢 |
（7）计算机辅助的小鼠肾血管形态发生的三维可视化及定量研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分:计算机辅助下发生发育小鼠肾血管的三维重建及其毗邻关系演变的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 发生发育肾组织连续切片的制备 |
| 2.2.2 发生发育肾连续显微图像的获取 |
| 2.2.3 发生发育肾连续显微图像的配准 |
| 2.2.4 发生发育肾球前动脉的数字追踪及三维可视化 |
| 2.2.5 发生发育肾球前动脉直径及长度的测量 |
| 2.2.6 发生发育小鼠肾单位数量及直径的测量 |
| 3 结果 |
| 3.1 E14.5 小鼠肾血管的三维重建 |
| 3.2 出生前（E17.5）小鼠肾血管的三维空间走行 |
| 3.3 生后5天小鼠肾血管的三维可视化 |
| 3.4 成年小鼠肾血管的三维重建 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:发生发育小鼠肾微血管的定量研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 发生发育肾组织石蜡切片的制备 |
| 2.2.2 免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 体视学测量 |
| 3 结果 |
| 3.1 CD34在发育不同时间点小鼠肾脏中的表达 |
| 3.2 发生发育小鼠皮质内血管球和管周毛细血管网的体积密度 |
| 3.3 发生发育小鼠髓质内微血管的体积密度 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）小鼠肾发育中的细胞凋亡研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究动物 |
| 1.2 取材及光镜标本制作 |
| 1.3 TUNEL检测凋亡细胞 |
| 1.3.1 染色步骤: |
| 1.3.2 细胞凋亡指数测定: |
| 2 结果 |
| 2.1 石蜡切片光镜观察 |
| 2.2 小鼠各发育阶段细胞凋亡指数变化情况 |
| 2.3 TUNEL染色 |
| 3 讨论 |
（9）成纤维细胞生长因子家族在肾脏疾病中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 实验研究一 成纤维生长因子受体2在急性肾损伤中的作用和机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 实验研究二 成纤维细胞生长因子7在成纤维细胞活化和肾脏间质纤维化中的作用研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 实验研究三 成纤维细胞生长因子23在促进肾间质纤维化中的作用和机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述：成纤维细胞生长因子家族与肾脏 |
| 参考文献 |
| 附录一：缩略词表 |
| 附录二：攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）小鼠肾脏发育中光镜和电镜的体视学分析（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物培养 |
| 1.2 取材 |
| 1.3 光镜标本制备及测量 |
| 1.4 电镜标本制备及测量 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 大体测量结果 |
| 2.2 光镜测量结果 |
| 2.3 电镜测量结果 |
| 3 讨论 |
四、生后小鼠肾脏皮质发育过程中的细胞增殖（论文参考文献）
- [1]发生发育小鼠肾小球形态计量学研究[D]. 宋科昕. 中国医科大学, 2020(01)
- [2]前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究[D]. 王雪. 上海交通大学, 2019(06)
- [3]基于Cx43蛋白研究先天肾虚影响仔鼠骨发育的机制[D]. 萧闵. 湖北中医药大学, 2019(08)
- [4]mTOR在破骨细胞以及肾间质细胞中的作用[D]. 吴志祥. 上海交通大学, 2018(06)
- [5]mTOR信号通路在急性肾损伤和精子发生中的作用与机制研究[D]. 王彩霞. 南方医科大学, 2017(01)
- [6]孕期乙醇暴露致子代大鼠长骨发育不良的宫内RAS编程机制[D]. 潘正启. 武汉大学, 2017(06)
- [7]计算机辅助的小鼠肾血管形态发生的三维可视化及定量研究[D]. 张婕. 中国医科大学, 2018(12)
- [8]小鼠肾发育中的细胞凋亡研究[J]. 陈金绪,颜池. 广西医学, 2014(05)
- [9]成纤维细胞生长因子家族在肾脏疾病中的作用和机制研究[D]. 徐卓. 南京医科大学, 2014(08)
- [10]小鼠肾脏发育中光镜和电镜的体视学分析[J]. 杜娟,宋小峰,郭敏. 中国体视学与图像分析, 2013(04)