一、凋亡相关蛋白(eIF-5A)——双向电泳分离、编码基因克隆和表达、多抗制备（论文文献综述）
高明春[1]（2021）在《IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制》文中研究表明牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3）是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一,世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50%到90%之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞,发生组织损伤和免疫抑制,随后继发细菌感染导致严重的支气管肺炎。IL10（Interleukin10,IL10）是极少数具有强大的负调节功能的抗炎性细胞因子,上皮细胞、单核巨噬细胞等都是IL10发挥抑制性作用的靶细胞。许多病毒感染后依靠多种途径诱导宿主IL10表达来负调控宿主免疫应答,IL10负调控免疫应答的相关机制在HIV（Human immunodeficiency virus）、FMDV（Foot-and-Mouth disease virus）、LCMV（Lymphocytic choroid meningitis virus）、PCV2（Porcine circovirus type 2）、PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病毒的致病机制中发挥重要作用,BPIV3感染中IL10是否及如何调控免疫应答尚未清楚。本研究分离BPIV3流行毒株并分析其致病特征,证实BPIV3流行株能够感染牛与鼠的上皮细胞与单核巨噬细胞。建立小鼠呼吸道感染模型与鼠原代巨噬细胞感染模型。以小鼠与原代巨噬细胞的高通量转录组数据证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3（Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）下调宿主的抗感染免疫应答。随后开展了牛IL10、IL10R1、SOCS3的生物学活性与作用机制研究,证实牛IL10与IL10受体结合转导信号,激活JAK-STAT3通路来迅速高表达SOCS3,在小鼠与牛细胞上都具有类似的生物学活性。最终探索了BPIV3主要依赖My D88、p38 MAPK以及NF-κB信号通路来表达IL10,负调控宿主抗病毒应答并提高BPIV3复制能力的相关机制。本研究为阐明IL10/STAT3/SOCS3信号轴在BPIV3感染中的致病作用和抑制IL10通路防制牛呼吸道传染病奠定了理论基础。首先对2017年黑龙江省、河北省等地的群发犊牛肺炎1793份血清进行了BPIV3的抗体调查,结果表明近70%的犊牛呼吸道疾病可部分归因于BPIV3所参与的感染。随后自病牛鼻拭子中分离到了一株BPIV3,其具有感染MDBK、BHK21、BBEC、BL、BTB、BT、ML、PBMC、BMDM等牛与小鼠多种上皮细胞与单核巨噬细胞的能力。分离株经呼吸道感染小鼠肺脏并对其进行了致病性的分析,感染鼠肺脏发生病理变化,并且肺内病毒在12 d内不能够被完全清除,感染肺脏发生了多种炎性因子的表达,检测到重要的调节性抑炎性因子IL10在感染后的12 d之内,大多数检测时间点的转录均显着高于对照。通过高通量转录组测序、差异表达分析与基因富集及蛋白质相互作用网络分析,在小鼠与原代巨噬细胞感染BPIV3前后重要宿主免疫与调控分子的变化模式。BPIV3感染小鼠与感染巨噬细胞后,在感染早期显着上调了IL10与SOCS3表达,SOCS3几乎在所有分组中都得到了显着的转录激活。大多数组别中Tyk2、STAT1、STAT2、IRF7、ISG15、Mx1、RSAD2、PML等关键抗感染免疫基因被显着下调,IL10与SOCS3参与了BPIV3感染后抑制宿主抗病毒应答。为进一步研究牛IL10的信号转导以及其是否能发挥免疫负调控作用,克隆了牛IL10、牛IL10R1与SOCS3基因并分析其生物信息与进化保守性。对IL10、IL10R1胞外区与SOCS3进行了蛋白表达与纯化,并制备了相应的高效价抗体。采用腺病毒系统表达了牛IL10、IL10R1胞外区,然后在牛与鼠细胞上证实重组IL10可快速并强烈诱导SOCS3的表达,这种作用可以被IL10R1胞外区所抑制。IL10与SOCS3都具有抑制Ⅰ型干扰素及其下游分子表达的功能,即牛IL10与SOCS3可用于牛与鼠细胞的负免疫调控研究,而IL10R1胞外区可作为IL10通路的阻断剂。进一步探讨BPIV3感染中IL10参与负调控的相关机制,研究表明BPIV3以时间与剂量依赖性的方式诱导原代巨噬细胞与肺上皮细胞在感染极早期迅速上调IL10的m RNA并大量分泌IL10蛋白,同时TNF-α与Ⅰ型干扰素及其下游蛋白Mx1的表达受到了显着的抑制。IL10在原代巨噬细胞中的产量远高于上皮细胞,外源与内源性的IL10都可提高BPIV3的滴度。IL10R1胞外区作为游离的受体竞争掉IL10或抑制剂阻断IL10产生的通路都能降低病毒的复制能力。在My D88（Myeloid differentiation factor,MYD88）缺失与My D88抑制剂处理的BMDM细胞上,IL10/SOCS3的表达大幅降低,表明依赖My D88分子转导信号的通路在BPIV3感染过程中诱导IL10的表达起到了重要作用。此外,应用通路抑制剂证实NF-κB和p38 MAPK在BPIV3诱导IL10表达中为关键通路。JAK-STAT通路中的多种JAK与STAT分子均参与IL10与BPIV3之间复杂的调控作用。综上所述,BPIV3是我国犊牛传染性肺炎的主要病原之一,感染后可显着上调IL10与SOCS3的表达并引起宿主免疫抑制,主要下调以Ⅰ型干扰素及其下游分子介导的抗病毒应答,这种由IL10介导的负调控依赖于My D88、NF-κB和p38 MAPK信号通路。本研究可为进一步阐明BPIV3的分子致病机制与开发以调控IL10为靶标的免疫防控提供理论基础。
郭军培[2]（2021）在《猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响》文中研究表明胃泌素释放肽（Gastrin-releasingpeptide,GRP）是1979年从猪的胃组织中分离得到的一种神经肽,是哺乳动物蛙皮素样肽家族中的一员,在体内GRP通过与其受体（Gastrin-releasing peptide receptor,GRPR）结合发挥多种生理功能。GRP及其受体在多种动物的神经系统和外周组织中广泛表达,参与调控体内多种生物学作用,包括:促进正常/肿瘤细胞的增殖分化、促进胰液分泌、调节应激和恐惧等情绪性行为、参与调控摄食和节律等。自GRP发现以来,目前大多数关于GRP及其受体功能的研究都集中于人和大小鼠上,关于猪体内GRP的表达及其生物学作用的研究较缺乏。为研究GRP在猪体内的分布情况,我们首先制备了猪GRP多克隆抗体,并研究了GRP蛋白在猪体内的分布。本课题组前期研究结果表明,GRP可能对公猪的生殖功能具有调控作用,因此本试验以猪Leydig cells为模型,研究GRP对猪Leydig cells睾酮分泌/合成、增殖及凋亡的影响。通过以上研究旨在发现GPR在猪体内可能存在的生理功能及对猪Leydig cells的影响,为进一步研究GRP对公猪生殖相关激素的调控机制奠定基础。1.猪GRP多克隆抗体的制备本试验通过大肠杆菌原核表达技术,构建了重组表达载体pET32a（+）-pGRP,并转化到表达菌株BL21（DE3）获得pGRP融合蛋白表达菌株,IPTG诱导表达菌株获得Histag-pGRP融合蛋白,以纯化后的融合蛋白为免疫原,制定免疫程序免疫试验动物后获得抗血清,即为制备的多克隆抗体。具体如下:（1）根据猪GRP基因序列,设计并合成添加酶切位点的引物序列;通过PCR扩增获得pGRP目的片段,包括全长开放阅读框（441 bp）,编码146个氨基酸;随后与pMD19T连接构建pMD19T-pGRP重组质粒;将pMD19T-pGRP和pET32a（+）质粒经双酶切线性化后连接构建pET32a（+）-pGRP重组表达载体;并转化至表达菌株BL21（DE3）中获得BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株。（2）利用IPTG诱导BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株获得His-tag-pGRP融合蛋白,并对获得的蛋白进行检测和纯化。（3）制定免疫程序后,以纯化后的融合蛋白为免疫原免疫试验动物家兔,并获得抗血清;采用ELISA检测抗血清的效价为1:50,000,并通过Western Blot检测抗血清的反应原性;纯化后的抗血清即为制备的多克隆抗体。2.GRP在猪体内的分布定位和表达本部分主要通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白在猪组织中的分布表达情况。结果表明:GRP蛋白在猪的中枢神经系统和外周组织器官中都有表达,其中在中枢神经系统GRP蛋白主要表达在下丘脑、小脑等组织;在外周组织中主要表达在胃肠道和泌尿生殖道。综上所述,GRP蛋白在猪体内的广泛存在表明GRP可能对猪的多种生理功能具有调节作用。3.GRP对猪Leydigcells的影响为研究GRP对猪Leydig cells的影响,我们使用一定浓度的GRP处理猪Leydig cells,收集上清和蛋白样品分别进行如下检测:检测GRPR蛋白在Leydig cells中表达,结果表明一定浓度（1和10 nM）的GRP可以显着促进GRPR蛋白的表达;检测上清中睾酮分泌和睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）表达的影响,结果表明GRP能够促进睾酮的分泌,其中1和10nM的GRP能够显着增加睾酮的浓度（P<0.01和P<0.05）;Western Blot结果也表明不同浓度GRP处理细胞对睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）的表达有一定的促进作用;进一步检测了GRP对Leydig cells细胞增殖和凋亡的影响,CCK-8结果表明GRP对细胞活性有一定的作用,GRP浓度为1和10nM时能够显着增加细胞数量（P<0.01和P<0.05）;Western Blot检测结果表明一定浓度的GRP对Cyclin B1蛋白表达有促进作用,但是对PCNA影响不显着;同时流式细胞术检测结果表明一定剂量的GRP能够促进细胞凋亡并促进凋亡相关蛋白的表达;检测了GRP处理对G-蛋白偶联受体信号通路中pPKC/PKC和pPKA/PKA蛋白表达的影响,结果显示一定浓度的GRP能够增加pPKC/PKC的比值,但是对pPKA/PKA的比值影响不显着。该论文构建重组表达载体pET32a（+）-pGRP并制备猪GRP多克隆抗体,通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白猪体内的分布和表达情况,结果表明GRP蛋白在猪组织中具有广泛的分布表达,表明GRP在猪体内可能具有多种生理功能。该论文进一步研究GRP对猪睾丸间质细胞睾酮的分泌和合成的影响,结果表明一定浓度的GRP能够促进睾酮分泌并调节睾酮合成相关蛋白的表达;另外,研究结果还表明一定浓度的GRP对睾丸间质细胞的细胞增殖和凋亡也有影响;并发现GRP/GRPR系统对睾丸间质细胞的调节作用可能是通过pPKC/PKC途径。
杨雪花[3]（2020）在《朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析》文中进行了进一步梳理朊病毒病的确诊取决于对患病个体脑组织中PrPSc含量及其特殊病理变化的检测,因此特异性抗体对朊病毒病的诊断至关重要。本研究采用人源重组PrP蛋白23-231免疫Prnp基因敲除小鼠,ELISA测定血清效价为1:20480,收集小鼠血清制备PrP多克隆抗体（pAb P54）。通过蛋白PrP特异性Western blot、免疫组织化学和细胞免疫荧光实验评价制备抗体的特异性。Western blot结果显示pAb P54抗体可与重组PrP蛋白、正常啮齿动物和人脑组织中PrPC以及羊瘙痒因子感染的小鼠、仓鼠和不同类型的人朊病毒病脑组织中的PrPSc反应,且制备的抗体对脑组织中PrPC和PrPSc识别的条带特征与商品化PrP单克隆抗体（6D11及3F4）的几乎相同,三种糖基化形式清晰可见。免疫组织化学分析结果显示制备的抗体能够特异地识别羊瘙痒因子139A感染的小鼠和263K感染的仓鼠脑组织切片中的异常沉积的朊蛋白。免疫荧光实验结果显示pAb P54抗体可识别细胞核周围的PrP蛋白（绿色荧光）。上述结果证明制备的pAb P54多克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,可用于人和啮齿动物朊蛋白的识别,并且适用于多种检测方法,在朊蛋白生物学研究以及人和啮齿动物脑组织朊病毒的检测具有较好的应用前景。朊蛋白由机体PRNP基因所编码,该蛋白在不同哺乳动物间相对保守,其氨基酸序列与朊病毒病的易感性有关。沙狐为犬科狐属的动物,主要栖息于干草原、荒漠和半荒漠地带,广泛分布于中亚和我国西部的多个地区,通常以啮齿类动物和鸟类为其主要的食物来源,同时也被多种食肉类动物捕食。高原鼠兔则为鼠兔科鼠兔属的动物,是青藏高原特有物种和关键物种,也是草原上大多数中小型肉食动物和几乎所有猛禽的主要捕食对象。在本研究中,我们首次克隆并测序了青藏高原沙狐及高原鼠兔的全长Prnp基因,利用软件对序列分析得出相应的氨基酸序列并对其进行比较。其中沙狐的Prnp基因编码区共774bp,对应编码257个氨基酸的朊蛋白;高原鼠兔Prnp编码区共包含759bp,对应编码252个氨基酸的朊蛋白。根据这两物种的Prnp序列,深度比对分析这两种动物与其他动物物种的亲缘关系,其中沙狐与其它三种同属狐类的序列相似度为100%;高原鼠兔与同属动物北美鼠兔的氨基酸序列仅有一个氨基酸位点不同;与其它多个物种（主要包括人、犬、牛、鹿、羊、骆驼、猫、小鼠和仓鼠等）的序列相似性也进行比对分析。本研究首次获得了沙狐及高原鼠兔Prnp序列并上传Pubmed数据库,同时作为青藏高原食物链循环的中间环节,对它们的Prnp基因序列及蛋白的测定、分析将有助于判定在特定地区不同物种间朊病毒传播的潜力。
赵宁宁[4]（2020）在《鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究》文中研究说明鸡球虫病是危害养鸡业最为严重的寄生虫病之一,每年给养鸡业带来巨大的经济损失。耐药虫株的出现、药物残留、鸡球虫活疫苗生产成本昂贵、散毒等问题,使鸡球虫病的防控面临更严峻的挑战。随着现代生物技术的发展,安全无毒的第三代疫苗被认为是理想的抗球虫疫苗;而筛选鉴定免疫原性强的保护性抗原和种特异性抗原是研发第三代疫苗的基础和关键。本研究应用比较免疫蛋白质组学对E.tenella特异性抗原组进行筛选鉴定;通过免疫原性试验鉴定E.tenella特异性抗原,并对其功能进行研究;为鸡球虫新型亚单位疫苗的研发提供理论依据和新思路。研究内容具体包括以下六个方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制备和鉴定本研究通过口服感染鸡球虫卵囊制备E.tenella和E.maxima高免血清,应用ELISA、Western blot、体外阻断及被动免疫等试验对抗体质量进行评价。ELISA结果显示,随着接种次数的增多,血清抗体滴度升高,且第五次接种8天后血清抗体滴度达到高峰。以制备的高免血清为一抗对裂殖子全蛋白进行Western blot分析,结果显示,E.tenella免疫血清识别的抗原种类和反应强度均高于E.maxima免疫血清。抗体阻断试验显示E.tenella高免血清对E.tenella子孢子入侵的抑制率显着高于E.maxima高免血清。被动免疫结果显示E.tenella免疫血清可提供良好的免疫保护力（ACI=181.26）,而E.maxima免疫血清只能提供有限的免疫保护（ACI=141.36）。以上结果表明本研究制备的E.tenella和E.maxima免疫血清抗体存在较大差异,可以用于后续差异免疫蛋白质组学分析。2、E.tenella特异抗原组的筛选为了系统筛选E.tenella特异性抗原组,本研究选取E.tenella裂殖子进行免疫蛋白质组分析。制备E.tenella裂殖子全蛋白,分别以E.tenella和E.maxima高免血清为一抗对其进行免疫印迹反应,共鉴定了109个差异显着的蛋白质点。选取差异倍数为2.0倍以上的蛋白点进行质谱分析,成功鉴定了36个抗原基因。为了验证组学的可靠性,本研究选取EtHSP60、EtSERPIN1、Etprofilin、EtCCT2、Etpyruvate kinase、EtMIC1、EtRACK和EtG-3-P等八个抗原基因进行原核表达;以重组蛋白质为抗原,E.tenella和E.maxima免疫血清为一抗进行Western blot分析,结果显示与免疫蛋白质组学结果符合率为83.33%。3、差异抗原功能初步分析为了对差异抗原进行初步探究,本研究从抗原基因在不同阶段的转录差异、内源性表达与定位、以及是否参与子孢子入侵等方面进行分析。RT-PCR显示上述8个基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子阶段均转录,且转录水平存在较大差异。EtCCT2、EtHSP60、EtRACK、EtProfilin、EtSERPIN1和EtG-3-P在裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段;EtPyruvate kinase在孢子化卵囊、子孢子和裂殖子具有较高的转录水平;EtMIC1在子孢子和裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段。为了进一步研究其功能,制备了鼠源多克隆抗体;以制备的多抗为一抗对子孢子和裂殖子进行间接免疫荧光分析,结果显示,8种抗原在子孢子和裂殖子虫体内均表达,且EtMIC1、EtHSP60、EtSERPIN1和EtCCT2可以定位在虫体表面,可能为膜抗原。体外阻断入侵试验显示抗EtMIC1和EtSERPIN1多克隆抗体对子孢子入侵有明显的抑制作用,抑制率分别为38.5%和36.7%;而其它多抗的抑制作用不明显。4、柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定为了对E.tenella特异性抗原进行进一步鉴定,本研究评价了E.tenella差异抗原和E.maxima同源抗原对E.tenella的免疫保护效果。成功克隆并表达了巨型艾美尔球虫EmMIC1、EmHSP60、EmSERPIN1、Emprofilin、EmCCT2、Empyruvate kinase、EmRACK和EmG-3-P基因。分别以16个重组蛋白为免疫原免疫雏鸡,评价其对E.tenella的免疫保护效果。结果显示,重组EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1、EtPyruvate kinase和EmPyruvate kinase免疫组可以显着降低由E.tenella感染引起的盲肠病变程度、卵囊排出量和体重减轻程度,可以提供良好的免疫保护力,ACI分别为180.77、171.44、173.69、171.44和167.87。EtG-3-P、EmG-3-P和EtSERPIN1可以提供有限的免疫保护力（ACI:150.94/149.55/152.56）。以上结果显示,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1和Etpyruvate kinase可以提供对E.tenella良好的免疫保护力,而只有巨型艾美尔球虫Empyruvate kinase具有较强的交叉免疫原性。因此,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1可能是E.tenella种特异性抗原,pyruvate kinase可能是E.tenella和E.maxima的共有抗原。5、特异性抗原EtCCT2功能差异分析以上研究结果表明EtCCT2是E.tenella的特异性抗原,功能上可能与EmCCT2存在较大差异。因此,本研究对EtCCT2/EmCCT2的功能进行研究。前期研究结果显示,该蛋白可以定位于虫体的表面,且与入侵无关,因此,我们猜测EtCCT2可能通过与宿主互作发挥其功能。为了验证以上猜想,本研究探究了EtCCT2/EmCCT2与宿主的相互作用。共聚焦观察结果显示EtCCT2与内源性和外源性鸡CCT4（GgCCT4）存在共定位现象;免疫共沉淀实验显示EtCCT2与内源性和外源性GgCCT4共沉淀。该结果表明EtCCT2与GgCCT4存在明显的互作关系。鸡CCT是8聚体的环状蛋白复合物,CCT2的邻位是CCT4和CCT5。那么EtCCT2是否与GgCCT5同样存在相互作用关系。为了进行验证,本研究构建了GgCCT5的真核表达质粒,与EtCCT2共转后发现EtCCT2与GgCCT5存在明显的互作关系。为了进一步研究互作对细胞的影响,我们检测互作复合物的定位情况。结果发现,互作复合物以颗粒状的形式聚集,随着时间的延长互作复合物入核,最终导致核裂解,细胞凋亡增加。EmCCT2功能分析显示,EmCCT2只与GgCCT5互作,不诱导细胞凋亡发生。另外研究发现,鸡柔嫩艾美尔球虫感染和CCT2的表达会调控宿主CCT4的表达水平。因此,EtCCT2可能是柔嫩艾美尔球虫的潜在毒力因子,可以通过与GgCCT互作调控宿主宿主细胞的进程。6、特异性抗原EtMIC1抗原表位及其关键氨基酸的鉴定利用抗EtMIC1单克隆抗体（1-A1和1-H2）,通过分段表达的方式鉴定EtMIC1的抗原表位,并对表位进行种特异性及免疫原性鉴定。通过截短表达的方式,成功鉴定了EtMIC1两个抗原表位(I:91LITFATRSK99和CTR:698ESLISAGE705)。定点突变分析显示所有的表位氨基酸是反应的必须氨基酸。序列比对显示,I表位在七种鸡球虫之间具有较大的差异;Western blot实验表明该单抗与其它种鸡艾美尔球虫表位肽之间无交叉反应原性。为了鉴定表位的免疫原性,以重组的表位肽免疫雏鸡,评价其诱导的抗鸡柔嫩艾美尔球虫的免疫效果。结果显示,I表位肽可以显着减轻柔嫩艾美尔球虫感染引起的盲肠病变、卵囊排出及鸡体重减轻情况,可以提供与EtMIC1几乎同等程度的免疫保护力。另外,I表位肽可以诱导产生高滴度的血清抗体水平,显着提高淋巴细胞转化水平和CD4+细胞的比例。以上结果表明,I表位肽具有良好的免疫原性,具有诱导体液和细胞免疫的能力,可能是柔嫩艾美尔球虫特异性抗原表位。综上所述,本研究通过比较免疫蛋白组学筛选了3个E.tenella特异性抗原和一个E.tenella和E.maxima共同抗原;鉴定了柔嫩和巨型艾美尔球虫CCT2蛋白的功能差异,初步证明该基因可能是E.tenella潜在的毒力因子;鉴定了EtMIC1关键抗原表位。这将为鸡柔嫩艾美尔球虫新型亚单位疫苗的设计和研发提供新的靶点。
陆文静[5]（2020）在《趋化因子CCL28的基因克隆、表达及其单克隆抗体的研制与初步应用》文中研究说明CCL28是属于小分子量细胞因子CC基因亚家族的粘膜相关上皮趋化因子,在正常人体的不同粘膜部位如腮腺、乳腺、气管及结肠等均有不同程度的表达。除了具备广谱抗菌效果、参与免疫屏障的作用外,CCL28在各类上皮肿瘤细胞系也呈现高表达。研究发现人源CCL28与小鼠、大鼠、猪和羊等动物源CCL28在氨基酸水平上的同源性高达60%以上。然而CCL28与其受体CCR3/CCR10的互作机制、CCL28能否作为疫苗粘膜佐剂、CCL28能否作为肿瘤治疗靶点等尚需进一步深入研究。为探究CCL28的相关生物学作用,本研究在克隆表达人源CCL28基因的基础上,研制出了针对人源CCL28的特异性单克隆抗体,且以裸鼠结肠癌肿瘤模型初步测试了单抗的治疗效果。1、人源CCL28基因克隆表达与多抗制备为获得用于制备人源CCL28单克隆抗体的免疫原和筛选抗原,本实验根据Genbank对CCL28基因的分析,设计并合成了特异性的引物,并将其克隆至pcDNA3.1载体上,成功获得了真核表达质粒pCDNA3.1-CCL28。将阳性重组子pGEX-6P-1-CCL28转接至BL21感受态细胞中、经IPTG诱导表达获得了可溶性的融合蛋白GST-CCL28。纯化的GST-CCL28免疫小鼠制备了抗CCL28多克隆抗体。Western Blot证明获得的多抗不仅能与原核表达产物GST-CCL28反应,而且能识别真核表达质粒表达的CCL28。以上融合蛋白GST-CCL28的获得,CCL28真核表达质粒的构建及抗CCL28多克隆抗体的制备为研制抗CCL28单克隆抗体提供了材料。2、人源CCL28单克隆抗体的研制为了获得针对人源的CCL28单克隆抗体,本研究用获得的重组蛋白GST-CCL28免疫6周龄BALB/c小鼠,取加强免疫的小鼠进行细胞融合。以转染pcDNA3.1-CCL28重组质粒的293T细胞为筛选抗原,通过IFA筛选出分泌抗CCL28抗体的细胞株,进行亚克隆后得到一株针对CCL28的单克隆抗体,命名为5A3。其亚类鉴定为IgG2b,轻链为κ链。IFA与Western blot均证明单抗5A3可以很好地与外源性表达的CCL28发生特异性反应,荧光效价在1:12800以上。表位鉴定证实单抗5A3能识别CCL28的80aa-96aa位的重要功能区域。抗CCL28单克隆抗体的研制及其识别表位的鉴定为进一步探究CCL28的生物学功能及其在肿瘤治疗中的作用打下了基础。3、人源CCL28单克隆抗体抗肿瘤作用初探由于CCL28在各类上皮肿瘤细胞系呈现高表达,且CCL28的拮抗剂能协同参与治疗乳腺癌患者,为探究抗人源CCL28的鼠源单克隆抗体能否作为有效拮抗剂用于人类肿瘤中的治疗,本研究在用人结肠癌细胞系HCT116-P53+/+建立裸鼠结肠癌肿瘤模型的基础上,利用研制的抗CCL28单克隆抗体5A3尾静脉注射和肌肉注射进行了初步肿瘤治疗探索,定期观察裸鼠肿瘤生长情况。经周期性记录肿瘤数据发现,抗人源CCL28单克隆抗体5A3相对于对照单克隆抗体对肿瘤增长速度虽有一定抑制效果,但经统计分析两者没有显着差异。以上初步结果表明抗CCL28单克隆抗体5A3对肿瘤的治疗效果有待于进一步评价。
李芳芳[6]（2020）在《捻转血矛线虫R-Smads的鉴定及功能研究》文中提出捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是寄生于牛、羊等反刍动物胃肠道最重要的寄生线虫之一。因吸食大量血液、分泌毒素、造成机械性损伤等导致患畜贫血、消瘦、腹泻,严重时可导致死亡。由于国内缺乏有效的疫苗、现有药物防治效果不佳且出现抗药性,亟需高效新型的疫苗和药物。随着分子生物学的发展,捻转血矛线虫基因组和转录组数据的公布为研究该寄生虫生长发育及其致病的分子机制等提供了有效的依据,但是“捻转血矛线虫感染性幼虫的调控机制、入侵机制、免疫逃避机制”等科学问题仍未得到很好的解决,而这些基础问题严重制约着新型抗寄生虫药物或疫苗的开发。基于寄生线虫感染性三期幼虫与秀丽隐杆线虫dauer幼虫在行为、形态和发育上的相似性,有学者提出dauer发育的调控机制可能同样调控寄生线虫感染性三期幼虫的发育。研究表明,在与秀丽隐杆线虫同一分支（第V分支）的捻转血矛线虫中同样存在类似的dauer调控通路。其中TGF-β信号通路重要组成成分——膜外配体Hc-DAF-7、I型受体HcTGFBR1、II型受体Hc-TGFBR2、Co-Smad Hc-DAF-3和转录因子Hc-DAF-5在捻转血矛线虫中被鉴定并证明对该线虫体外由L3期向L4期的发育过程具有重要的作用。R-Smad蛋白作为TGF-β信号从膜上向核内传递的重要调控子,在该信号通路中发挥至关重要的作用,但迄今为止,在寄生线虫中对该类蛋白一无所知。本文根据秀丽隐杆线虫中R-Smads（Ce-DAF-8、Ce-DAF-14和Ce-SMA-2）的蛋白序列,对捻转血矛线虫基因组和转录组数据进行比对分析,找到了三个相应的同源基因,分别命名为Hc-daf-8、Hc-daf-14和Hc-sma-2。通过氨基酸序列比对及进化树分析,结果显示基因编码蛋白Hc-DAF-8和Hc-SMA-2具有保守的R-Smad蛋白的功能域及特异性的氨基酸残基,其中Hc-DAF-8属于TGF-β激活的R-Smads亚家族,Hc-SMA-2属于BMP激活的R-Smads亚家族。Hc-DAF-14与Ce-DAF-14一样,分化程度较高,缺乏N端保守的MH1区域,虽然Hc-DAF-14 L3 loop中两个决定R-Smad亚型特异性的氨基酸与TGF-β激活的R-Smads一致,但是进化树结果显示这两个蛋白与常见的两类R-Smads均不在同一分支。通过荧光定量法,对捻转血矛线虫八个发育时期和性别（虫卵、L1期幼虫、L2期幼虫、L3期幼虫、L4期雌虫、L4期雄虫、成年雌虫、成年雄虫）进行了Hc-daf-8、Hc-daf-14和Hc-sma-2这三个基因的转录水平分析。结果显示:这三个基因在各个发育阶段均有转录,其中Hcdaf-8和Hc-sma-2在成年雄虫阶段转录水平最高,Hc-daf-14在L3和成虫期转录水平最高。用制备的有效的多抗血清对捻转血矛线虫成虫进行了免疫荧光实验,确定了蛋白的组织定位。结果显示:Hc-DAF-8在成虫雌虫的皮下肌肉、肠道细胞质和部分虫卵;雄虫的皮下肌肉、肠道和粘腺中明显表达。Hc-SMA-2主要表达在成虫雌虫的皮下肌肉、虫卵及雄虫的睾丸、肠道。功能研究证明,Hc-daf-8能救援Ce-daf-8的突变株,使其正常发育至成虫。人Smad3特异性的抑制剂SIS3也被证明能显着抑制捻转血矛线虫体外从L3向L4的发育。另外RNAi实验显示,特异性的si RNA能有效的下调Hc-daf-14和Hc-sma-2的转录水平,并且Hc-sma-2干扰后能显着地降低捻转血矛线虫体外从L3向L4的发育率。本研究首次鉴定了捻转血矛线虫TGF-β信号通路重要组成分子R-Smad蛋白编码基因Hc-daf-8、Hc-daf-14及Hc-sma-2,补充完善了对捻转血矛线虫TGF-β信号通路的研究。其中,Hc-daf-8和Hc-sma-2与TGF-β信号通路其他组成分子功能一致,均对捻转血矛线虫体外从三期幼虫向四期幼虫的发育即自由生活阶段向寄生生活阶段的转变过程发挥至关重要的作用。继捻转血矛线虫胰岛素信号通路的系统研究之后,TGF-β信号通路的系统研究为捻转血矛线虫感染性幼虫与入侵宿主相关的发育调控机制的阐明提供了更多的理论依据,也为开发新型高效的药物标靶提供了一定的理论指导。
季星妤[7]（2020）在《鸡RIG-I样受体MDA5及下游接头蛋白MAVS的相关研究》文中提出天然免疫是机体的第一道防御屏障,其通过一系列模式识别受体（PRRs）识别各种病原微生物产生的病原相关分子模式（PAMPs）。其中RIG-I样受体家族（RLRs）为胞浆内主要RNA识别受体,包括RIG-I、MDA5和LGP2。MDA5能够识别长双链RNA,并将信号传递给下游接头蛋白MAVS以介导信号通路,产生干扰素、促炎因子以及相关趋化因子,最终启动天然免疫抵御病原微生物。MDA5识别RNA病毒,也有研究证明MDA5能够识别DNA病毒和寄生虫复制过程中产生RNA以及细胞内源RNA。由于鸡缺失RIG-I,鸡MDA5（chMDA5）发挥关键作用。本研究从鸡细胞中克隆出鸡源MDA5,构建chMDA5及其信号接头蛋白chMAVS真核表达载体并验证两者表达及信号功能。同时通过DF-1细胞转染表达与敲除系统检验chMDA5和chMAVS的抗病毒作用以及二者之间的信号功能关系。最后构建chMDA5原核表达质粒,纯化细菌表达蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体为后续试验提供服务。1.chMDA5和chMAVS的克隆表达及其信号功能本研究从HD11细胞中RT-PCR扩增出chMDA5编码基因,与中间载体pENTER4-MCS-3FLAG连接获得重组中间质粒pENTER4-chMDA5-3FLAG。同时将合成chMAVS基因同样克隆到中间载体获得重组中间质粒pENTER4-chMAVS-3FLAG。将重组中间质粒分别与目的载体pDSET47特异位点性重组（LR）获得重组真核表达质粒pcDNA-chMDA5-3FLAG 和 pcDNA-chMAVS-3FLAG。Western blotting 检测 chMDA5 与chMAVS在转染293T细胞中表达,蛋白大小分别是140kDa和50kDa,符合预期。荧光共聚焦显微镜表明chMDA5和chMAVS都定位于细胞浆,但不存在明显共定位。启动子双荧光素酶报告基因和RT-PCR方法检测chMDA5和chMAVS的信号功能,结果显示chMDA5和chMAVS共转染293T细胞激活NF-κB通路,显着上调IL-1β与IL-8的转录。而共转染DF1细胞激活鸡IFNβ启动子,上调细胞下游基因IFNβ和OASL表达,上述结果差异显示了细胞种属特异性。此外信号接头蛋白也表现出种属特异性,与前述chMDA5和chMAVS共转染293T细胞只激活NF-κB相对照,chMDA5和猪（p）MAVS共转染可以有效激活细胞ISRE和NF-κB信号。定量RT-PCR方法检测鸡不同组织内chMDA5和chMAVS转录分布,发现chMDA5和chMAVS分布情况较为一致,主要集中在消化腺和肠道,其次是肺脏和脾脏。2.chMDA5和chMAVS转染表达与敲除对RNA和DNA病毒复制的影响DF1细胞用于单独或共转染chMDA5和chMAVS表达质粒,转染细胞用不同病毒感染刺激,包括RNA病毒水泡性口炎病毒（VSV）、仙台病毒（SeV）、脑心肌炎病毒（EMCV）、鸡新城疫病毒（NDV）和DNA病毒痘苗病毒VacV株、SMV株。qRT-PCR检测感染细胞中病毒复制基因和细胞下游基因表达情况。根据已知序列利用Benchling软件分别设计chMDA5和chMAVS的gRNA编码DNA序列（引物）,引物退火后与plentiCRISPRv2载体连接,获得重组敲除质粒gMDA5与gMAVS。敲除gRNA质粒和相应真核表达质粒共转染293T细胞检验gRNA敲除效率,挑选其中敲除效果较好gRNA质粒用于细胞转染实验。DF1用于单独或共转染gMDA5和gMAVS基因敲除质粒,转染细胞同样用上述不同RNA和DNA病毒感染刺激,qRT-PCR检测感染细胞中病毒复制基因和细胞下游基因表达情况。结果显示转染表达与敲除细胞系统中,chMDA5-chMAVS能够响应RNA病毒VSV、SeV、EMCV、NDV并产生IFN与OASL以影响病毒复制,chMDA5-chMAVS表达DF-1细胞系统中上述RNA病毒复制受到抑制,而敲除细胞系统中RNA病毒复制得到提高。同时,chMDA5和chMAVS共表达能够进一步增强抑制RNA病毒效果,而共敲除细胞系统中RNA病毒复制进一步升高。因此chMDA5与chMAVS在抗RNA病毒天然免疫中起到至关重要的作用。DNA病毒感染细胞结果表明,内源性chMDA5和chMAVS不影响病毒复制和下游病毒刺激基因表达,因此chMDA5-chMAVS在抗DNA病毒感染中无显着作用。3.chMDA5的多抗制备将pENTER4-chMDA5与原核目的载体pDSET527通过特异位点同源重组（LR）获得重组原核表达质粒。表达质粒转化细菌BL21（DE3）,大量扩增后使用IPTG诱导chMDA5蛋白表达。从细菌裂解上清中分离获得大小符合预期的可溶性chMDA5蛋白。将分离蛋白纯化并浓缩后进行定量,免疫BALB/c小鼠（每次15μg/只）,三次免疫后采集血清。Western blotting检测发现,血清多抗能够检测外源表达chMDA5。
令小东[8]（2020）在《鲫鱼抵御杀鲑气单胞菌感染的分子机制及重组腺病毒候选疫苗的研究》文中指出杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）是鱼类疖病的病原体,给鲑科鱼类的养殖造成了严重的经济损失。过去几十年,虽然在预防疖病方面做了大量的研究,但该病原仍在渔场肆意流行。因此,急需开发经济有效的疫苗来预防杀鲑气单胞菌的感染。另外,随着多种新亚型的出现及宿主范围逐年扩大,其对世界范围内其他海水和淡水鱼类的养殖也造成了巨大的威胁。目前,虽然已有非典型菌株感染鲫鱼的报道,但鲫鱼抵御感染的免疫机制和组织病理学变化仍不清楚。为明确一株新分离非典型杀鲑气单胞菌的生物学特性和被感染鲫鱼的免疫应答机制,以及研究针对鲑科鱼类杀鲑气单胞菌感染的候选疫苗,本研究采用全基因组测序、转录组学、组织病理学、重组腺病毒以及其他分子生物学技术进行了以下四个方面的研究:（1）采用第二代全基因组测序技术,对鲫鱼体内分离的一株杀鲑气单胞菌进行全基因组测序。通过对基因组组分的分析和基因功能注释发现,该菌株的平均GC含量为58.6%,全基因组总长度4656393bp,编码基因的个数为4226个。发现了109个非编码RNA,包括102个tRNA,占总基因组的0.1723%;7个sRNA,占总基因组的0.0227%。8个基因岛,总长度为97861bp,以及一个前噬菌体,总长度为29875bp。分泌蛋白预测发现具有信号肽结构的蛋白374个,具有跨膜结构的蛋白1032个。分泌系统蛋白预测发现,T2SS型效应蛋白13个,T6SS型效应蛋白5个,T3SS型效应蛋白127个。发现了424个毒力因子,主要包括溶血素、O抗原、鞭毛运动蛋白、S层蛋白、OmpA、T3SS、胞外多糖、荚膜多糖等。也注释到30种耐药相关的基因,主要抵抗氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素、大环内酯类、氯霉素等。以上结果为进一步功能基因组学的研究及制定新的预防和治疗方案提供了理论基础。（2）基于转录组学和组织病理学方法,分析了鲫鱼感染杀鲑气单胞菌的免疫应答和组织损伤情况。结果显示,在感染第5天的鲫鱼头肾组织中,共鉴定出6579个差异表达基因（DEGs）,其中3428个基因表达下调,3151个基因表达上调。进一步的GO和KEGG注释和分析表明,这些DEGs主要富集在酶调节活性、对氧化应激的反应、铁离子稳态等分子功能;以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、NF-κB、toll样受体（TLR）、核苷酸寡聚化结构域（NOD）样受体（NLR）等免疫相关信号通路。鲫鱼感染后所有DEGs中发现的4个C型溶菌酶基因均显着上调。而且,被感染的鱼体表有严重的出血,肠、肝、脾、肾均有不同程度的炎性损伤,尤其是肠黏膜上皮杯状细胞增生和肾小管上皮细胞变性坏死最为严重。随着杀鲑气单胞菌感染浓度的增加,累积死亡率增加,后肠及头肾组织病变程度也加重。另外,四个免疫相关基因（TNF-α、IL-1β、IL-11、C-lysozyme）的相对表达水平与对照组相比均出现显着差异（P<0.05）。因此,这些基因和信号通路的调控对于维持机体内环境的稳态和抵抗病原菌感染具有重要的作用。另外感染鲫鱼的组织病变特征和其他鱼类并不相同,这为鲫鱼抵御非典型杀鲑气单胞菌感染的免疫应答机制和组织病理学鉴别诊断提供了重要的科学依据。（3）在以上研究的基础上,通过采用荧光定量PCR、免疫印迹、原核表达、体外抑菌等试验方法,进一步对鲫鱼感染杀鲑气单胞菌后C型溶菌酶的表达特征及抗菌特性进行了研究。结果显示,杀鲑气单胞菌感染的鲫鱼肝脏、脾脏、肾脏以及后肠中C型溶菌酶的基因和蛋白表达均显着上调,其中肝脏C型溶菌酶的基因上调最为显着,是未感染的15倍。另外,通过原核表达的重组C型溶菌酶对杀鲑气单胞菌具有明显的抑菌活性,且随着重组溶菌酶剂量的增加,培养皿上可见的抑菌圈半径变大。当用40μg的重组溶菌酶时,抑菌圈平均半径达到0.92cm。因此,鲫鱼的C型溶菌酶在抵御杀鲑气单胞菌的感染中发挥了重要的作用。这些研究不但揭示了鲫鱼被杀鲑气单胞菌感染后C型溶菌酶的免疫应答特征,而且重组的溶菌酶为今后解决细菌的耐药性提供了一定的科研基础。（4）通过重组腺病毒技术,我们成功构建了能表达保护性抗原A层蛋白的重组腺病毒。免疫虹鳟鱼后,测定外周血液中特异性抗体水平及免疫保护率。同时,通过荧光定量PCR检测免疫前后头肾和后肠中IgM和IgT的相对表达水平。免疫印迹结果表明,重组腺病毒可感染HEK-293细胞并表达A层蛋白（由Vapa编码）。攻毒后28天鱼的存活率显示,与对照组（76.6%）和空载体组（73.6%）的累积死亡率相比,免疫接种的实验组死亡率（40%）显着降低。更重要的是,它还能显着增加外周血中的特异性抗体水平。以及免疫后头肾和后肠中IgM和IgT的相对表达水平均不同程度的增加,尤其IgT在后肠中的倍增最为显着。因此,重组腺病毒的接种可以激活虹鳟鱼的体液免疫应答,而且对杀鲑气单胞菌的感染具有免疫保护作用。总之,该研究为预防杀鲑气单胞菌的感染提供了一种候选疫苗,并为进一步研究虹鳟鱼抗体介导的适应性免疫应答机制奠定了理论基础。
邸文达[9]（2019）在《捻转血矛线虫Hc-akt-1，Hc-daf-3和Hc-daf-5基因结构与功能的研究》文中研究说明捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是寄生于牛、羊等反会动物胃肠道以吸食血液为生的寄生线虫。该病呈全球性分布,可造成宿主的贫血,营养不良,严重时引起死亡,给全球畜牧业带来了巨大经济损失。由于缺乏有效的疫苗,针对寄生线虫病的控制主要依赖于化学药物,但是长期抗蠕虫药的过度使用,已经造成了抗药虫株的涌现及动物产品和环境药物残留问题,寻找新药物和有效的疫苗迫在眉睫。通过对寄生线虫信号通路关键分子的研究,不仅能够了解其生长发育中的分子调控机制,而且有助于发现新的药物靶标或者疫苗分子,为防治寄生线虫病提供理论依据。由于不能全程体外培养及缺乏有效的基因操作技术,寄生线虫中基因功能的研究受到了很大的阻碍,然而Dauer假说的提出给我们提供了新的思路。鉴于寄生线虫感染性三期幼虫（L3）与秀丽隐杆线虫Dauer幼虫在形态及生物学特征的相似性,学者认为二者受相同的信号通路调控。秀丽隐杆线虫调控Dauer形成的信号通路有环鸟苷酸信号通路、TGF-β信号通路、胰岛素样信号通路和激素样信号通路四种。其中胰岛素样信号通路被证实在捻转血矛线虫中存在,并且该通路中某些分子在捻转血矛线虫发育过程中发挥着重要作用,但AKT-1在虫体发育中的作用尚无任何报道。TGF-β DAF-7信号通路上游受体和配体分子被证实在捻转血矛线虫中存在,并且这些分子在捻转血矛线虫从自由生活向寄生生活阶段转变过程发挥调控作用,但下游的Smad蛋白及转录因子尚无任何报道,深入研究这些分子对于确定相关通路在寄生线虫中的作用有重要意义。因此,本研究通过分子生物学和生物信息学方法鉴定了可能对H.contortus发挥重要作用的三个基因,包括胰岛素样信号通路中的Hc-akt-1、DAF-7通路中的Hc-daf-3、Hc-daf-5;分析了各基因在H.contortus不同发育阶段的转录水平;利用异源转基因技术研究了各基因在秀丽隐杆线虫中的空间表达谱;免疫实验兔制备特异多克隆抗体检测Hc-DAF-3/Hc-DAF-5在捻转血矛线虫中的定位;利用AKT分子特异抑制剂AKT inhibitor Ⅳ以及RNAi研究了三个基因在捻转血矛线虫从自由生活阶段向寄生生活阶段转化过程中的调控作用;利用双分子荧光互补实验验证了Hc-DAF-3/Hc-DAF-5在哺乳动物细胞中的相互作用。研究结果报道如下:（1）捻转血矛线虫蛋白激酶B编码基因Hc-akt-1基因鉴定和功能研究Hc-akt-1存在两个转录本,即Hc-akt-1a/Hc-akt-1b,其CDS分别为1644 bp和1659 bp,gDNA全长10431 bp。分析发现该基因含14个外显子,13个内含子。上游假定的启动子序列全长3.5 kb,包含13个E-box,4个GATA,1个反向GATA,2个反向CAAT和2个CAAT模块以及1个GC box模块等启动子元件。Hc-AKT-1a/Hc-AKT-1b为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包含PH结构域与激酶区,二级结构建模发现Hc-AKT-1a和Hc-AKT-1b两分子间的不同主要存在于激酶区αD螺旋处。进化分析显示,Hc-AKT-1a/Hc-AKT-1b与秀丽隐杆线虫同源分子亲缘关系近。Hc-akt-1a/Hc-akt-1b在捻转血矛线虫所有发育时期包括虫卵,一期幼虫（L1）,二期幼虫（L2）,三期幼虫（L3）,四期雌虫（L4F）,四期雄虫（L4M）,成虫雌虫（AF）和成虫雄虫（AM）都有转录且呈现完全不同的转录丰度,Hc-akt-1a在成虫雌雄虫阶段转录显着上调,Hc-akt-1b在L3转录显着上调;二者比较发现,在虫卵及成虫阶段Hc-akt-1a转录水平显着高于Hc-akt-1b。在秀丽隐杆线虫中的异源转基因实验发现Hc-akt-1定位于秀丽隐杆线虫头部ASJ神经元。对于Hc-akt-1a/Hc-akt-1b进行了 RNA共干扰,在秀丽隐杆线虫中异源干扰发现,Hc-akt-1a/Hc-akt-1b转录水平的下调产生与Ce-akt-1转录水平下调相同的表型,即虫体出现对氧化性药物抵抗力增加和存活时间的延长。在捻转血矛线虫中通过浸泡脱鞘xL3于特异dsRNA进行干扰后,检测到干扰的虫体中两个转录本丰度的下调,且虫体由xL3到L4发育过程中口部发育受到抑制;特异的AKT inhibitorⅣ体外抑制实验中,同样可以抑制虫体向L4发育过程中口部发育。（2）捻转血矛线虫co-Smad编码基因Hc-daf-3基因鉴定和功能研究Hc-daf-3全长CDS为2097 bp,gDNA全长9487 bp,分析发现该基因含16个外显子,15个内含子。上游假定的启动子序列全长5.3 kb,包含14个E-box,10个GATA,9个反向GATA,14个反向CAAT和CAAT模块,10个TATA box等启动子元件。Hc-DAF-3为co-Smad蛋白,具有典型的MH1和MH2结构域,存在转录激活区（SAD）。进化分析显示,Hc-DAF-3与锡兰钩虫亲缘关系很近,与秀丽隐杆线虫亲缘关系远于与人的亲缘关系。Hc-daf-3在虫体所有时期包括虫卵,一期幼虫（L1）,二期幼虫（L2）,三期幼虫（L3）,四期雌虫（L4F）,四期雄虫（L4M）,成虫雌虫（AF）和成虫雄虫（AM）都有转录,其中在L3和雌性成虫转录水平高。在秀丽隐杆线虫中异源转基因实验发现Hc-daf-3微弱的定位于秀丽隐杆线虫阴门。通过制备特异的多克隆抗体检测Hc-DAF-3天然蛋白在捻转血矛线虫成虫中的表达,发现其主要表达于雌雄虫生殖器官及内角质。在捻转血矛线虫中通过浸泡特异siRNA干扰xL3,可检测到干扰后虫体中该基因转录丰度的下调,干扰后的虫体从xL3到L4发育过程中口部发育受到抑制。（3）捻转血矛线虫转录因子编码基因Hc-daf-5基因鉴定和功能研究Hc-daf-5全长CDS为1629 bp,gDNA全长8535 bp,分析发现该基因含11个外显子,10个内含子。上游假定的启动子序列全长4.1 kb,包含12个E-box,6个GATA,2个反向GATA,8个反向CAAT和CAAT模块,1个TATA box以及3个GC box模块等启动子元件。Hc-DAF-5作为转录因子,具有SDS区和Dach box区,此外在C端存在卷曲螺旋。进化分析显示,Hc-DAF-5与巴西日圆线虫亲缘关系最近,秀丽隐杆线虫次之,与脊椎动物亲缘关系最远。Hc-daf-5在虫体所有时期包括虫卵,一期幼虫（L1）,二期幼虫（L2）,三期幼虫（L3）,四期雌虫（L4F）,四期雄虫（L4M）,成虫雌虫（AF）和成虫雄虫（AM）都有转录,其中在L3转录水平高。在秀丽新杆线虫中异源转基因实验发现Hc-daf-5主要定位于秀丽隐杆线虫神经系统,包括头部神经、尾部神经和腹侧神经索。通过体外表达重组Hc-DAF-5蛋白制备特异的多克隆抗体检测了 Hc-DAF-5天然蛋白在捻转血矛线虫成虫中的表达,主要表达于雌雄虫生殖器官和肠道。通过对捻转血矛线虫浸泡特异siRNA干扰xL3,可检测到干扰后虫体中该基因转录丰度的下调,干扰后虫体从xL3到L4发育过程中口部发育受到抑制。通过荧光双分子互补实验验证了Hc-DAF-3与Hc-DAF-5在真核细胞中的相互作用。本研究首次探索了捻转血矛线虫TGF-β信号通路（DAF-7通路）两个重要分子的基因结构和功能,探索了胰岛素信号通路AKT分子的基因结构和功能。深入探讨了捻转血矛线虫尤其是从自由生活阶段向寄生生活阶段转化过程中的调控机制,阐释了 Dauer假说在寄生线虫研究中的局限性,也为开发寄生线虫新的药物靶标和疫苗候选分子提供了一定的理论指导。
刘聪[10]（2019）在《马NLRP3激活系统的建立及其在EIAV感染调控炎症反应研究中的初步应用》文中提出作为慢病毒家族中基因组结构最为简单的病毒,马传染性贫血病毒（EIAV）弱毒疫苗的研制成功可为包括人类免疫缺陷病毒（HIV-1）在内的其他慢病毒的致病与免疫保护机制研究提供重要参考。EIAV强毒感染马后临床上以贫血及多脏器的炎性坏死为特征。而疫苗株免疫马后并不引起器官的炎性损伤,安全有效。这些现象一方面表明,EIAV强毒株可以诱导炎症的过度激活;另一方面也表明EIAV强弱毒株在诱导及调控炎症方面具有差异性。炎症小体的激活是炎症发生的核心。初期研究发现,EIAV强毒感染机体后能更有效地诱导炎症小体NLRP3 mRNA的上调表达,同时强毒株感染后其下游的效应分子IL-18和IL-1β也较弱毒株有明显的优势表达。但对于EIAV病毒感染后是否激活NLRP3炎症小体以及激活的调控机制尚不清楚,马源的NLRP3激活及检测系统也尚未建立。因此,本研究旨在建立马源NLRP3激活筛选系统,并应用此系统开展EIAV感染后对NLRP3的激活及调控机制的研究。为此,本研究从病毒感染马组织中提取RNA,并以此为模板,扩增获得了马源NLRP3、IL-1β和caspase-1的序列,并构建了相应的表达载体,纯化重组蛋白,将其作为免疫原分别免疫鼠和兔,成功制备并纯化了马源NLRP3单抗、IL-1β和caspase-1的多抗。Western blot结果表明,这些抗体均能特异性识别293T细胞转染后相应蛋白（NLRP3、IL-1β和caspase-1）的外源性表达。同时,也可检测马源细胞中相应蛋白的内源性表达,且具有较高的特异性和敏感性。另外,利用分泌型荧光素酶Gluc报告质粒和马NLRP3炎症小体复合中的相应质粒,成功构建了马NLRP3炎症小体的体外激活报告系统。在此基础上,初步对EIAV感染后NLRP3炎症小体的激活情况进行了探讨。研究发现,EIAV强毒感染12 h后,上清中和细胞内的IL-1β和caspase-1的蛋白水平明显增加,且NLRP3在胞浆内的聚集增多。同时,NLRP3炎症小体复合物的关键蛋白ASC也形成了ASC斑点聚集的特异性激活特征。上述结果说明,EIAV强毒感染后能有效地激活NLRP3炎症小体。随后,利用建立的NLRP3激活筛选系统,发现了Env蛋白可以有效地激活NLRP3,Co-IP及PLA实验结果也证实了Env蛋白可以和NLRP3结合。但Env蛋白是如何调控NLRP3激活的机制仍需后续研究。综上所述,本研究成功制备了马源NLRP3单抗、马源IL-1β和caspase-1多抗。成功构建了基于Gluc报告质粒的马源NLRP3炎症小体体外激活系统,并筛选到可以与NLRP3作用的EIAV病毒蛋白。本研究结果为研究马相关病毒激活炎症反应提供了有效的生物学工具,并为进一步研究EIAV激活和调控NLRP3炎症小体的机制奠定了重要基础。
二、凋亡相关蛋白(eIF-5A)——双向电泳分离、编码基因克隆和表达、多抗制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凋亡相关蛋白(eIF-5A)——双向电泳分离、编码基因克隆和表达、多抗制备（论文提纲范文）
（1）IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛呼吸道疾病病原及其固有免疫应答 |
| 1.1 牛呼吸道病原识别病原的分子基础 |
| 1.2 气道和肺上皮细胞对牛呼吸系统疾病的抵抗能力 |
| 1.3 固有免疫系统的效应细胞 |
| 第二章 牛副流感病毒3 型感染及其逃避宿主免疫的研究进展 |
| 2.1 宿主范围与传播特点 |
| 2.2 流行病学与基因型 |
| 2.3 BPIV3 编码基因与蛋白特征 |
| 2.4 牛副流感的临床症状与病理变化 |
| 2.5 病原分离与鉴定 |
| 2.6 BPIV3 造成的经济损失 |
| 2.7 BPIV3 的治疗与预防 |
| 2.8 副黏病毒拮抗Ⅰ型干扰素的研究概况 |
| 第三章 IL10 的信号转导与其在病毒致病中的作用 |
| 3.1 白细胞介素-10 的来源细胞与基本作用 |
| 3.2 IL10 的受体与信号转导 |
| 3.3 IL10 的相关家族与病毒编码的IL10 |
| 3.4 IL10 在病毒致病中的作用 |
| 3.5 IL10 重要产物SOCS3 在病毒感染中的作用 |
| 3.6 病毒诱导IL10 产生的信号通路 |
| 3.7 阻断IL10 清除病毒感染的新策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犊牛BPIV3 血清抗体调查与BPIV3 A的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 血清与病料采集 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 2.2 鼻棉拭子中的BPIV3 鉴定与分离培养 |
| 2.3 病毒的鉴定与纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 3.2 BPIV3 分离培养 |
| 3.3 BPIV3 的特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BPIV3 感染C57BL/6 小鼠与巨噬细胞的转录组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要动物、细胞与毒株 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 2.2 转录样本的制备 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 qPCR验证转录组测序结果 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 3.2 BPIV3 感染鼠巨噬细胞后细胞因子的变化 |
| 3.3 BPIV3 感染C57 小鼠后肺组织的转录组分析 |
| 3.4 BPIV3 感染原代巨噬细胞转录组测序与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的重组表达及特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆与生物信息学分析 |
| 2.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 2.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 2.4 牛IL10、IL10R1 腺病毒制备及蛋白表达 |
| 2.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建 |
| 2.6 构建牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体 |
| 2.7 牛IL10 的生物学活性及信号通路研究 |
| 2.8 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆 |
| 3.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 3.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 3.4 牛IL10、IL10R1 胞外区的腺病毒感染细胞与表达蛋白鉴定 |
| 3.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建与活性分析 |
| 3.6 牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体的构建 |
| 3.7 牛IL10 和IL10R的生物学活性 |
| 3.8 牛IL10 的信号通路 |
| 3.9 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 IL10 在牛副流感病毒3 型感染中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染细胞表达IL10 并发挥其活性 |
| 2.2 IL10/IL10R1对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 感染细胞诱导IL10 的转录与表达 |
| 3.2 BPIV3 感染对STAT3 表达的影响 |
| 3.3 BPIV3 感染对SOCS3 转录的影响 |
| 3.4 BPIV3 感染对其他细胞因子表达的影响 |
| 3.5 IL10对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3.6 IL10 受体阻断对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 IL10 与牛副流感病毒3 型感染的相互调控 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染诱导IL10 产生的信号通路 |
| 2.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 诱导IL10 产生所依赖的信号通路 |
| 3.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 文献综述: 胃泌素释放肽及其受体与睾丸间质细胞研究进展 |
| 1 胃泌素释放肽及其受体研究进展 |
| 1.1 胃泌素释放肽及其受体的发现 |
| 1.2 胃泌素释放肽及其受体在体内的表达 |
| 1.3 胃泌素释放肽及其受体在体内的功能研究 |
| 1.4 GRP多克隆抗体的制备 |
| 2 睾丸间质细胞研究进展 |
| 2.1 睾丸间质细胞 |
| 2.2 生殖相关激素睾酮 |
| 2.3 睾丸间质细胞的增殖与凋亡 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第1章 猪胃泌素释放肽的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 重组载体的构建 |
| 1.3 融合蛋白pGRP的获得 |
| 1.4 多克隆抗体的制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET32a(+)-pGRP重组载体的构建 |
| 2.2 His-tag-pGRP融合蛋白的获得 |
| 2.3. pGRP多克隆抗体的获得 |
| 3 讨论 |
| 第2章 GRP蛋白在猪体内的分布与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1仪器和试剂 |
| 1.2 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 1.3 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 2.2 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 第3章 GRP对猪睾丸间质细胞睾酮分泌和合成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 细胞培养和处理 |
| 1.3 GRP对Leydig cells中GRPR表达的影响 |
| 1.4 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌的影响 |
| 1.5 GRP对Leydig cells睾酮合成相关蛋白表达的影响 |
| 1.6 GRP对Leydig cells细胞增殖的影响 |
| 1.7 GRP对Leydig cells凋亡的影响 |
| 1.8 GRP对Leydig cells增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRPR在Leydig cells中的表达情况 |
| 2.2 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌及睾酮合成相关蛋白的影响 |
| 2.3 GRP对猪Leydig cells细胞活性的影响 |
| 2.4 GRP对猪Leydig cells细胞凋亡的影响 |
| 2.5 GRP对猪Leydig cells中pPKA/PKA和pPKC/PKC蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1. 朊病毒病 |
| 2. 朊蛋白 |
| 3. PRNP基因 |
| 4. 朊病毒病的传播及种属屏障 |
| 5. PrP抗体 |
| 6. 研究目的及意义 |
| 第一部分 HuPrP23-231多克隆抗体制备 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 1. 朊病毒毒株及细胞系 |
| 2. 抗体和酶 |
| 3. 缓冲液及溶液配制 |
| 4. 其他相关材料与试剂 |
| 5. 实验仪器及设备 |
| 实验方法 |
| 1. Hu23-231蛋白表达纯化 |
| 2. 免疫小鼠及效价测定 |
| 3. 细胞培养及裂解液制备 |
| 4. 多抗验证 |
| 4.1 免疫印迹(Western blot) |
| 4.2 免疫组织化学 |
| 4.3 免疫组织荧光 |
| 4.4 免疫细胞荧光 |
| 实验结果 |
| 1. 蛋白表达纯化及动物免疫 |
| 2. ELISA血清效价测定 |
| 3. 多抗验证结果 |
| 3.1 免疫印迹 |
| 3.2 免疫组织化学 |
| 3.3 免疫组织荧光 |
| 3.4 免疫细胞荧光 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 沙狐及高原鼠兔Prnp序列测定分析 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 1. 材料与试剂盒 |
| 1.1 Prnp序列测定相关材料与试剂 |
| 1.2 质粒构建相关材料与试剂 |
| 2. 引物 |
| 3. 设计及分析软件 |
| 实验方法 |
| 1. 动物基因组提取 |
| 2. PCR扩增 |
| 3. 目的片段连接至T-vector并测序 |
| 4. 测序结果分析及提交 |
| 实验结果 |
| 1. 沙狐Prnp序列测定 |
| 1.1 PCR结果 |
| 1.2 Prnp基因测序结果 |
| 1.3 氨基酸序列比对结果 |
| 1.4 多物种序列相似性分析 |
| 1.5 序列上传至PubMed数据库 |
| 2. 高原鼠兔Prnp序列测定 |
| 2.1 PCR结果 |
| 2.2 Prnp基因测序结果 |
| 2.3 氨基酸序列比对结果 |
| 2.4 多物种同源关系分析 |
| 2.5 序列上传至PubMed数据库 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 不同物种PRNP特征及疾病易感性分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 病原生物学 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病流行病学及危害 |
| 1.2 鸡球虫免疫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫抗原的种类 |
| 1.2.2 天然免疫反应 |
| 1.2.3 细胞免疫 |
| 1.2.4 体液免疫 |
| 1.3 鸡球虫病防控研究进展 |
| 1.3.1 鸡球虫病的药物防控 |
| 1.3.2 鸡球虫病的疫苗防控 |
| 1.4 蛋白质组学在球虫疫苗研发中的应用 |
| 1.4.1 蛋白质组学概述 |
| 1.4.2 蛋白质组学技术 |
| 1.4.3 免疫蛋白质组学 |
| 1.4.4 蛋白质组学在鸡球虫抗原鉴定中的应用 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验质粒、菌株、虫体、细胞 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器、设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 高免血清的制备 |
| 2.2.2 子孢子的分离纯化 |
| 2.2.3 裂殖子的分离纯化 |
| 2.2.4 裂殖子蛋白质的抽提 |
| 2.2.5 免疫差异蛋白质双向电泳 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 反转录合成c DNA |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.2.9 基因PCR扩增及产物回收 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.11 Blunt载体的制备 |
| 2.2.12 重组质粒的构建 |
| 2.2.13 原核表达 |
| 2.2.14 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.15 His重组蛋白的纯化 |
| 2.2.16 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.17 组织蛋白抽提 |
| 2.2.18 Western blot实验 |
| 2.2.19 酵母表面展示 |
| 2.2.20 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.21 多抗抑制子孢子入侵实验 |
| 2.2.22 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.23 抗球虫指数ACI计算 |
| 2.2.24 细胞转染 |
| 2.2.25 免疫共沉淀 |
| 2.2.26 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备与鉴定 |
| 3.1.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备 |
| 3.1.2 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体外鉴定 |
| 3.1.3 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体内鉴定 |
| 3.2 柔嫩艾美尔球虫差异蛋白质组的筛选、鉴定 |
| 3.2.1 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白双向电泳分析 |
| 3.2.2 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白免疫蛋白质组学分析结果 |
| 3.2.3 柔嫩艾美尔球虫免疫差异基因的鉴定 |
| 3.2.4 柔嫩艾美尔球虫免疫差异蛋白质表达、纯化 |
| 3.2.5 免疫蛋白质组学可靠性检测 |
| 3.3 差异抗原功能初步分析 |
| 3.3.1 差异抗原多克隆抗体的制备 |
| 3.3.2 差异抗原不同发育阶段转录谱分析 |
| 3.3.3 差异抗原在不同阶段的表达和定位分析 |
| 3.3.4差异抗原多克隆抗体体外抑制子孢子入侵实验 |
| 3.4 柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定 |
| 3.4.1 巨型艾美尔球虫同源基因的克隆、表达 |
| 3.4.2 重组抗原免疫保护力评价 |
| 3.4.3 重组抗原诱导体液免疫的能力 |
| 3.5 特异性抗原CCT2 的功能研究 |
| 3.5.1 EmCCT2 多抗的制备 |
| 3.5.2 CCT2 多抗对子孢子入侵的抑制作用 |
| 3.5.3 EtCCT2 与宿主细胞的相互作用 |
| 3.5.4 EtCCT2 对宿主细胞的影响 |
| 3.5.5 EmCCT2与EtCCT2 的功能差异 |
| 3.5.6 EtCCT2对GgCCT4 表达的影响 |
| 3.5.7 柔嫩艾美尔球虫感染对宿主CCT4 表达的影响 |
| 3.6 特异性抗原EtMIC1 表位及其关键氨基酸序列的鉴定 |
| 3.6.1 表位的鉴定 |
| 3.6.2 表位关键氨基酸的鉴定 |
| 3.6.3 不同种艾美尔球虫表位种特异性鉴定 |
| 3.6.4 感染初期EtMIC1 亚细胞定位结果 |
| 3.6.5 EtMIC1 表位及结构域免疫保护力评价 |
| 3.6.6 EtMIC1 表位诱导体液免疫和细胞免疫的能力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫蛋白质组学具有筛选高效抗原的优势 |
| 4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美尔球虫表面抗原 |
| 4.3 柔嫩艾美尔球虫Profilin样蛋白是潜在候选抗原 |
| 4.4 柔嫩艾美尔球虫CCT2 可能是毒力因子 |
| 4.5 ~(91)LITFATRSK~(99)是EtMIC1 的关键抗原表位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 博士在读期间发表的论文 |
（5）趋化因子CCL28的基因克隆、表达及其单克隆抗体的研制与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 综述 |
| 1 CCL28的研究进展 |
| 1.1 CCL28的发现与结构 |
| 1.2 CCL28的表达 |
| 1.3 CCL28的生物学作用 |
| 1.4 CCL28与人类疾病 |
| 2 研究目的及意义 |
| 第2章 人源CCL28基因克隆表达及多抗制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试验试剂 |
| 1.3 相关试剂的配制 |
| 1.4 相关试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 PCR扩增 |
| 2.3 重组质粒的构建 |
| 2.4 重组子的筛选鉴定 |
| 2.5 重组蛋白的表达与鉴定 |
| 2.6 重组蛋白的纯化和鉴定 |
| 2.7 动物免疫 |
| 2.8 多抗血清的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CCL28基因片段和线性化载体的扩增 |
| 3.2 重组产物的菌落PCR鉴定 |
| 3.3 SDS-PAGE分析重组蛋白GST-CCL28的表达及纯化效果 |
| 3.4 Western Blot验证蛋白纯化效果 |
| 3.5 IFA和Western Blot验证小鼠多抗血清 |
| 4 讨论 |
| 第3章 抗人源CCL28单克隆抗体的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试验试剂 |
| 1.3 相关试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细胞融合 |
| 2.2 阳性细胞株的筛选 |
| 2.3 单抗亚类鉴定 |
| 2.4 腹水的制备 |
| 2.5 腹水的纯化 |
| 2.6 SDS-PAGE验证腹水纯化效果 |
| 2.7 抗体效价的测定 |
| 2.8 IP验证抗体的特异性 |
| 2.9 抗体表位的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.2 单克隆抗体亚类鉴定结果 |
| 3.3 SDS-PAGE验证腹水纯化效果 |
| 3.4 IP验证单抗反应性和特异性 |
| 3.5 抗体表位鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第4章 抗CCL28单克隆抗体抗肿瘤应用初探 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试验试剂 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 成瘤细胞的准备 |
| 2.2 肿瘤模型的建立 |
| 2.3 抗体静脉注射 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 裸鼠成瘤模型 |
| 3.2 肿瘤数据分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（6）捻转血矛线虫R-Smads的鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 概况 |
| 1.1.1 捻转血矛线虫病 |
| 1.1.2 捻转血矛线虫的生活史及三期幼虫的特点 |
| 1.1.3 捻转血矛线虫病的治疗与防控 |
| 1.2 秀丽隐杆线虫dauer机制的研究 |
| 1.2.1 秀丽隐杆线虫的生活史及dauer幼虫的特点 |
| 1.2.2 秀丽隐杆线虫dauer机制的研究 |
| 1.3 Dauer假说及其在寄生线虫中的应用 |
| 1.3.1 粪类圆线虫dauer机制的研究 |
| 1.3.2 捻转血矛线虫dauer机制的研究 |
| 1.3.3 其他寄生线虫dauer机制的研究 |
| 1.4 TGF-β信号通路的研究 |
| 1.5 R-Smad蛋白的相关研究 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料和方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物及实验用菌株、载体 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 试剂溶液的配置 |
| 3.2.1 线虫培养基的配制 |
| 3.2.2 大肠杆菌培养基的配制 |
| 3.2.3 捻转血矛线虫体裂解液的配制 |
| 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制 |
| 3.2.5 SDS-PAGE缓冲液及Western blot缓冲液的配制 |
| 3.2.6 蛋白表达及纯化试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 捻转血矛线虫感染模型的建立 |
| 3.3.2 捻转血矛线虫不同发育阶段虫体的收集 |
| 3.3.3 捻转血矛线虫和秀丽隐杆线虫基因组的提取 |
| 3.3.4 捻转血矛线虫RNA的提取及c DNA的合成 |
| 3.3.5 目的基因编码区序列(CDS)的分离 |
| 3.3.6 生物信息学分析 |
| 3.3.7 荧光定量PCR |
| 3.3.8 多抗的制备 |
| 3.3.9 间接免疫荧光实验 |
| 3.3.10 daf-8基因救援实验 |
| 3.3.11 特异性抑制剂实验 |
| 3.3.12 捻转血矛线虫RNAi实验 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 捻转血矛线虫Hc-DAF-8结构和功能研究 |
| 4.1.1 Hc-daf-8基因序列的获得 |
| 4.1.2 Hc-DAF-8氨基酸序列特征 |
| 4.1.3 Hc-DAF-8的进化树分析 |
| 4.1.4 Hc-DAF-8的转录谱分析 |
| 4.1.5 Hc-DAF-8多克隆抗体的制备及检测 |
| 4.1.6 Hc-DAF-8在捻转血矛线虫成虫中的定位 |
| 4.1.7 Hc-daf-8的基因救援实验 |
| 4.1.8 特异性抑制剂实验 |
| 4.2 捻转血矛线虫Hc-DAF-14结构和功能研究 |
| 4.2.1 Hc-daf-14基因序列的获得 |
| 4.2.2 Hc-DAF-14氨基酸序列特征 |
| 4.2.3 Hc-DAF-14的进化树分析 |
| 4.2.4 Hc-DAF-14的转录谱分析 |
| 4.2.5 Hc-DAF-14的RNA干扰实验 |
| 4.3 捻转血矛线虫Hc-SMA-2结构和功能研究 |
| 4.3.1 Hc-sma-2基因序列的获得 |
| 4.3.2 Hc-SMA-2氨基酸序列特征 |
| 4.3.3 Hc-SMA-2的进化树分析 |
| 4.3.4 Hc-sma-2的转录谱分析 |
| 4.3.5 Hc-SMA-2多肽的合成及抗体的检测 |
| 4.3.6 Hc-SMA-2在捻转血矛线虫成虫中的定位 |
| 4.3.7 Hc-SMA-2的RNA干扰实验 |
| 5 讨论 |
| 5.1 Hc-daf-8、Hc-daf-14和Hc-sma-2 的基因结构和序列特征 |
| 5.2 Hc-daf-8、Hc-daf-14和Hc-sma-2 的转录水平分析 |
| 5.3 Hc-daf-8、Hc-daf-14和Hc-sma-2 编码蛋白的定位特征 |
| 5.4 Hc-daf-8、Hc-daf-14和Hc-sma-2 的功能 |
| 5.4.1 寄生线虫基因功能研究方法 |
| 5.4.2 Hc-daf-8的功能 |
| 5.4.3 Hc-sma-2的功能 |
| 5.4.4 Hc-daf-14的功能 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 致谢 |
（7）鸡RIG-I样受体MDA5及下游接头蛋白MAVS的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述: 天然免疫RNA受体MDA5信号和病毒感染 |
| 1 天然免疫受体分类 |
| 2 主要的RNA识别受体 |
| 3 MDA5 |
| 3.1 MDA5的结构与定位 |
| 3.2 MDA5的激活与信号通路 |
| 3.3 MDA5的抗病毒免疫 |
| 4 MDA5信号接头蛋白MAVS |
| 4.1 MAVS的结构与定位 |
| 4.2 MAVS的功能 |
| 4.3 病毒逃逸MAVS |
| 4.4 MAVS的调节 |
| 5 新城疫病毒研究进展 |
| 6 小结 |
| 第一章 chMDA5和chMAVS的克隆表达及其功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡MDA5基因的克隆 |
| 2.2 中间载体pENTER4-chMDA5-3FLAG的构建 |
| 2.3 chMDA5与chMAVS在293T细胞中的表达 |
| 2.4 chMDA5与chMAVS mRNAs在鸡体各组织的分布情况 |
| 2.5 chMDA5与chMAVS的定位 |
| 2.6 chMDA5与chMAVS的功能鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第二章 chMDA5与chMAVS表达与敲除对病毒复制影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒感染chMDA5和chMAVS外源表达DF-1细胞下游基因表达变化与病毒复制 |
| 2.2 gRNA敲除质粒基因敲除效率鉴定 |
| 2.3 病毒感染chMDA5与chMAVS的敲除DF-1细胞下游基因表达变化与病毒复制 |
| 3 讨论 |
| 第三章 chMDA5的多抗制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 原核蛋白诱导表达条件筛选 |
| 2.2 原核蛋白的纯化与定量 |
| 2.3 chMDA5多克隆抗体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）鲫鱼抵御杀鲑气单胞菌感染的分子机制及重组腺病毒候选疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 杀鲑气单胞菌研究进展 |
| 前言 |
| 1 杀鲑气单胞菌与疖病 |
| 2 杀鲑气单胞菌的分离特性 |
| 3 系统发育与分类 |
| 3.1 传统分类方法 |
| 3.2 分子水平分类 |
| 3.2.1 随机扩增多态性DNA分析 |
| 3.2.2 核糖体基因分型技术 |
| 3.2.3 DNA芯片与比较基因组技术 |
| 3.2.4 质谱技术 |
| 3.3 宿主差异与杀鲑气单胞菌分型 |
| 4 毒力因子 |
| 4.1 外膜蛋白 |
| 4.1.1 A层蛋白 |
| 4.1.2 脂多糖 |
| 4.2 胞外分子 |
| 4.3 分泌系统 |
| 4.4 铁获取机制 |
| 5 杀鲑气单胞菌基因组特征 |
| 6 诊断 |
| 6.1 培养和表型特征诊断 |
| 6.2 血清学诊断 |
| 6.3 分子生物学诊断 |
| 7 控制和预防措施 |
| 7.1 培育具有抗病品种的鱼 |
| 7.2 疫苗研究 |
| 7.3 免疫增强剂 |
| 7.4 抗菌类药物的使用 |
| 8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 杀鲑气单胞菌AS110的全基因组测序 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因组DNA提取和测序 |
| 2.2.2 基因组组装和组分分析 |
| 2.2.3 基因功能分析及效应子预测 |
| 3 结果 |
| 3.1 数据与基因组概况 |
| 3.2 基因组组分分析 |
| 3.2.1 编码基因 |
| 3.2.2 重复序列 |
| 3.2.3 非编码RNA |
| 3.2.4 基因岛(GIs) |
| 3.2.5 前噬菌体 |
| 3.2.6 CRISPR |
| 3.3 基因功能分析 |
| 3.3.1 GO注释 |
| 3.3.2 KEGG数据库注释 |
| 3.3.3 COG数据库注释 |
| 3.3.4 TCDB数据库注释 |
| 3.3.5 碳水化合物活性酶(CAZy)数据库注释 |
| 3.4 效应子 |
| 3.4.1 分泌蛋白预测 |
| 3.4.2 分泌系统蛋白及T3SS效应蛋白预测 |
| 3.5 毒力或致病性分析 |
| 3.5.1 病原与宿主互作数据库(PHI)注释 |
| 3.5.2 致病菌毒力因子(VFDB)注释 |
| 3.5.3 耐药基因(CARD)注释 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 比较转录组和组织病理学分析非典型杀鲑气单胞菌对鲫鱼的感染 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌的分离和鉴定 |
| 2.2.2 杀鲑气单胞菌对鲫鱼的回归感染试验与诊断 |
| 2.2.3 杀鲑气单胞菌对鲫鱼的半数致死量 |
| 2.2.4 鲫鱼的攻毒试验及样本采集 |
| 2.2.5 组织学检查和病变严重程度的评估 |
| 2.2.6 RNA提取和文库制备 |
| 2.2.7 Illumina测序、组装和差异基因的表达分析 |
| 2.2.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.2.9 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细菌的分离和鉴定 |
| 3.2 回归感染和诊断 |
| 3.3 鲫鱼感染杀鲑气单胞菌的死亡率 |
| 3.4 杀鲑气单胞菌感染引起的组织病理学变化及病变严重程度的评估 |
| 3.5 感染的严重程度与免疫应答之间的关系 |
| 3.6 RNA-seq数据的初步统计分析 |
| 3.7 差异表达基因的鉴定与分析 |
| 3.8 DEGs的 GO和 KEGG富集分析 |
| 3.9 通过RT-qPCR验证RNA-seq数据 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 鲫鱼感染非典型杀鲑气单胞菌后C型溶菌酶的表达特征及抗菌特性 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物和细菌 |
| 2.1.2 主要试剂和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鲫鱼的攻毒试验及样本采集 |
| 2.2.2 RNA提取和逆转录 |
| 2.2.3 荧光定量PCR |
| 2.2.4 鲫鱼C型溶菌酶基因合成、表达及多抗制备 |
| 2.2.5 免疫印迹检测 |
| 2.2.6 体外抑菌试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白表达和多克隆抗体制备 |
| 3.2 qRT-PCR检测鲫鱼感染前后不同组织中C型溶菌酶基因的表达 |
| 3.3 免疫印迹检测鲫鱼感染前后不同组织中C型溶菌酶蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 杀鲑气单胞菌的重组腺病毒候选疫苗制备 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物和菌株 |
| 2.1.2 主要试剂和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌的培养与Vapa基因的合成 |
| 2.2.2 p AdTrack-CMV-Vapa与腺病毒质粒p Ad-easy-1 的同源重组 |
| 2.2.3 重组腺病毒载体的包装、收毒及扩增 |
| 2.2.4 免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.5 虹鳟鱼的免疫接种和取样 |
| 2.2.6 血清中特异性IgM抗体的测定 |
| 2.2.7 攻毒与免疫保护率的测定 |
| 2.2.8 RNA分离和c DNA的合成 |
| 2.2.9 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3 结果 |
| 3.1 重组穿梭载体和腺病毒骨架载体的验证 |
| 3.2 重组腺病毒载体的转染,重组腺病毒的制备及A层蛋白表达的检测 |
| 3.3 重组腺病毒诱导的特异性IgM抗体检测 |
| 3.4 攻毒和免疫保护率 |
| 3.5 IgM和 IgT的 qRT-PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（9）捻转血矛线虫Hc-akt-1，Hc-daf-3和Hc-daf-5基因结构与功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 捻转血矛线虫病及其病原简介 |
| 1.1.1 捻转血矛线虫病流行病学特征 |
| 1.1.2 捻转血矛线虫生活史及各个时期形态特征 |
| 1.1.3 捻转血矛线虫病的症状及病理特征 |
| 1.1.4 捻转血矛线虫病的诊断、治疗及防治 |
| 1.2 秀丽隐杆线虫Dauer相关调控通路机制研究 |
| 1.2.1 秀丽隐杆线虫生活史 |
| 1.2.2 秀丽隐杆线虫调控Dauer相关通路 |
| 1.2.3 Dauer假说及其在寄生线虫研究中的应用 |
| 1.3 胰岛素样信号通路(Insulin-like signaling pathway) |
| 1.3.1 胰岛素信号通路在不同物种中的研究 |
| 1.3.2 蛋白激酶B(AKT-1) |
| 1.4 转化生长因子-β信号通路(TGFβ-like pathway)研究进展 |
| 1.4.1 DAF-7信号通路及DBL-1信号通路 |
| 1.4.2 通用型Smad信号传导蛋白(DAF-3) |
| 1.4.3 转录因子(DAF-5) |
| 2. 研究目的和意义 |
| 3. 材料与方法 |
| 3.1 实验动物、虫株及菌株 |
| 3.2 主要仪器和试剂 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液配制 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 捻转血矛线虫感染模型的建立 |
| 3.3.2 捻转血矛线虫各阶段虫体的收集 |
| 3.3.3 捻转血矛线虫和秀丽隐杆线虫核酸的提取 |
| 3.3.4 Hc-akt-1,Hc-daf-3和Hc-daf-5 cDNA获取 |
| 3.3.5 Hc-akt-1,Hc-daf-3和Hc-daf-5 gDNA与启动子序列的获取 |
| 3.3.6 生物信息学分析 |
| 3.3.7 Hc-akt-1,Hc-daf-3和Hc-daf-5不同发育阶段的转录水平分析 |
| 3.3.8 Hc-akt-1,Hc-daf-3和Hc-daf-5在秀丽隐杆线虫中的表达谱 |
| 3.3.9 Hc-akt-1在秀丽隐杆线虫中的RNAi |
| 3.3.10 AKT inhibitor Ⅳ体外对捻转血矛线虫发育的影响 |
| 3.3.11 Hc-DAF-3和Hc-DAF-5多抗的制备及在虫体中的定位 |
| 3.3.12 在捻转血矛线虫中Hc-akt-1,Hc-daf-3和Hc-daf-5的RNAi |
| 3.3.13 双分子荧光互补实验验证Hc-DAF-3与Hc-DAF-5的相互作用 |
| 4. 结果与分析 |
| 4.1 捻转血矛线虫Hc-akt-1结构和功能研究 |
| 4.1.1 捻转血矛线虫虫体分子学鉴定 |
| 4.1.2 Hc-akt-1全长cDNA及gDNA的获取 |
| 4.1.3 Hc-AKT-1二级结构的分析 |
| 4.1.4 Hc-AKT-1的系统发育树分析 |
| 4.1.5 Hc-akt-1在不同发育阶段的转录水平分析 |
| 4.1.6 Hc-akt-1在秀丽隐杆线虫中的空间表达谱 |
| 4.1.7 秀丽隐杆线虫中Hc-akt-1的异源RNA干扰 |
| 4.1.8 捻转血矛线虫中浸泡法RNAi干扰Hc-akt-1 |
| 4.1.9 抑制剂AKT inhibitor Ⅳ对捻转血矛线虫发育的影响 |
| 4.2 捻转血矛线虫Hc-daf-3基因结构和功能研究 |
| 4.2.1 Hc-daf-3全长cDNA及gDNA的获取 |
| 4.2.2 Hc-DAF-3序列分析 |
| 4.2.3 Hc-DAF-3的系统发育树分析 |
| 4.2.4 Hc-daf-3在不同发育阶段的转录水平分析 |
| 4.2.5 Hc-daf-3在秀丽隐杆线虫中的空间表达谱 |
| 4.2.6 Hc-DAF-3多克隆抗体的制备及免疫原性检测 |
| 4.2.7 Hc-DAF-3在捻转血矛线虫成虫中定位 |
| 4.2.8 饲喂法对于捻转血矛线虫Hc-daf-3的RNAi |
| 4.2.9 浸泡法RNAi下调Hc-daf-3转录对捻转血矛线虫发育的影响 |
| 4.3 捻转血矛线虫Hc-daf-5基因结构和功能研究 |
| 4.3.1 Hc-daf-5全长cDNA及gDNA的获取 |
| 4.3.2 Hc-daf-5二级结构分析 |
| 4.3.3 Hc-DAF-5的系统发育树分析 |
| 4.3.4 Hc-daf-5在不同发育阶段的转录水平分析 |
| 4.3.5 Hc-daf-5在秀丽隐杆线虫中的空间表达谱 |
| 4.3.6 Hc-DAF-5多克隆抗体的制备 |
| 4.3.7 Hc-DAF-5多克隆抗体的免疫原性检测 |
| 4.3.8 Hc-DAF-5在捻转血矛线虫成虫中定位 |
| 4.3.9 饲喂法对于捻转血矛线虫Hc-daf-5的RNAi |
| 4.3.10 浸泡法RNAi下调Hc-daf-5转录对捻转血矛线虫发育的影响 |
| 4.3.11 Hc-DAF-3与Hc-DAF-5的相互作用 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 捻转血矛线虫Hc-akt1基因结构与功能研究 |
| 5.1.1 Hc-akt-1基因结构与序列特征 |
| 5.1.2 Hc-akt-1基因在不同发育阶段转录水平 |
| 5.1.3 Hc-akt-1基因的功能分析 |
| 5.2 捻转血矛线虫Hc-daf-3基因结构与功能研究 |
| 5.2.1 Hc-daf-3基因结构与序列特征 |
| 5.2.2 Hc-daf-3基因的转录分析 |
| 5.2.3 Hc-daf-3基因的功能分析 |
| 5.2.4 RNAi干扰 |
| 5.3 捻转血矛线虫Hc-daf-5基因结构与功能研究 |
| 5.3.1 Hc-daf-5基因结构与序列特征 |
| 5.3.2 Hc-daf-5转录水平 |
| 5.3.3 Hc-daf-5基因的功能分析 |
| 5.3.4 蛋白质相互作用 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
（10）马NLRP3激活系统的建立及其在EIAV感染调控炎症反应研究中的初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 马传染性贫血病 |
| 1.1.1 马传染性贫血病概述 |
| 1.1.2 EIAV基因组结构及功能 |
| 1.1.3 EIAV感染临床特征及病理变化 |
| 1.2 EIAV感染诱导炎症反应的研究进展 |
| 1.2.1 EIAV强毒和疫苗毒诱导的炎症反应 |
| 1.2.2 EIAV强毒和疫苗毒感染后脏器病理损伤 |
| 1.2.3 EIAV感染上调NLRP3和TLR3的mRNA水平 |
| 1.3 NLRP3 炎症小体研究进展 |
| 1.3.1 炎症小体概述 |
| 1.3.2 炎症小体分类 |
| 1.3.2.1 NLRs家族 |
| 1.3.2.2 AIM |
| 1.3.2.3 RIG-I |
| 1.3.3 NLRP3 活化的分子机制 |
| 1.3.3.1 ROS信号途径 |
| 1.3.3.2 溶酶体途径 |
| 1.3.3.3 细胞内钾离子外流途径 |
| 1.3.3.4 其他途径 |
| 1.3.4 NLRP3 活化的调控 |
| 1.3.4.1 参与NLRP3 炎症小体活化的分子 |
| 1.3.4.2 NLRP3 炎症小体活化的负调控 |
| 1.3.4.3 病毒感染与NLRP3 的活化 |
| 1.3.5 NLRP3 炎症小体激活的研究方法 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 马NLRP3 单抗及IL-1β和 capsae-1 多抗的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、细胞及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液和培养液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抗原表位预测 |
| 2.2.2 引物设计及目的基因扩增 |
| 2.2.3 重组质粒构建 |
| 2.2.4 重组蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.2.5 动物免疫 |
| 2.2.5.1 制备单克隆抗体的小鼠免疫程序 |
| 2.2.5.2 制备多克隆抗体的兔免疫程序 |
| 2.2.6 血清抗体效价检测 |
| 2.2.7 杂交瘤细胞融合 |
| 2.2.8 阳性杂交瘤细胞筛选及抗体亚型鉴定 |
| 2.2.9 小鼠腹水和兔血清抗体制备及纯化 |
| 2.2.10 抗体效价及反应性检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的基因扩增及重组质粒构建 |
| 2.3.2 重组蛋白表达及纯化 |
| 2.3.3 血清抗体效价检测 |
| 2.3.4 杂交瘤细胞筛选和抗体亚型鉴定 |
| 2.3.5 抗体纯化及效价检测 |
| 2.3.6 抗体反应性检测 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 NLRP3 炎症小体激活筛选系统的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株及细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液和培养液配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计及质粒构建与表达 |
| 3.2.2 细胞活性检测 |
| 3.2.3 NLRP3 体外激活系统构建 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 质粒构建与表达 |
| 3.3.2 细胞活性检测 |
| 3.3.3 NLRP3 体外激活系统构建 |
| 3.3.4 NLRP3 体外激活系统验证 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 iGLuc报告系统在EIAV感染激活NLRP3 炎症小体中的应用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒、毒株及细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液和培养液配置 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 EIAV感染马单核巨噬细胞后炎症因子水平检测 |
| 4.2.2 马单核巨噬细胞感染EIAV后 caspase-1、IL-1β和 NLRP3 蛋白检测 |
| 4.2.3 iGLuc报告系统筛选激活NLRP3 炎症小体的病毒相关蛋白 |
| 4.2.4 EIAV 病毒蛋白激活 NLRP3 形成 ASC-斑点实验 |
| 4.2.5 EIAV 病毒蛋白与 NLRP3 的 PLA 实验 |
| 4.2.6 ELAV 病毒蛋白与 NLRP3 蛋白复合物 Co-IP 实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 EIAV感染马单核巨噬细胞后炎症因子水平的变化趋势 |
| 4.3.2 马巨噬细胞感染EIAV后 caspase-1、IL-1β和 NLRP3 蛋白表达检测 |
| 4.3.3 应用iGLuc炎症小体激活系统筛选EIAV病毒蛋白 |
| 4.3.4 EIAV 病毒蛋白形成 ASC-斑点实验 |
| 4.3.5 ELAV 病毒蛋白与 NLRP3 蛋白的互作实验 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、凋亡相关蛋白(eIF-5A)——双向电泳分离、编码基因克隆和表达、多抗制备（论文参考文献）
- [1]IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制[D]. 高明春. 吉林大学, 2021
- [2]猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响[D]. 郭军培. 扬州大学, 2021
- [3]朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析[D]. 杨雪花. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [4]鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究[D]. 赵宁宁. 山东农业大学, 2020(08)
- [5]趋化因子CCL28的基因克隆、表达及其单克隆抗体的研制与初步应用[D]. 陆文静. 扬州大学, 2020
- [6]捻转血矛线虫R-Smads的鉴定及功能研究[D]. 李芳芳. 华中农业大学, 2020(01)
- [7]鸡RIG-I样受体MDA5及下游接头蛋白MAVS的相关研究[D]. 季星妤. 扬州大学, 2020
- [8]鲫鱼抵御杀鲑气单胞菌感染的分子机制及重组腺病毒候选疫苗的研究[D]. 令小东. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [9]捻转血矛线虫Hc-akt-1，Hc-daf-3和Hc-daf-5基因结构与功能的研究[D]. 邸文达. 华中农业大学, 2019(02)
- [10]马NLRP3激活系统的建立及其在EIAV感染调控炎症反应研究中的初步应用[D]. 刘聪. 中国农业科学院, 2019(08)