一、一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2-4-3基因（论文文献综述）
王志浩[1]（2021）在《表达鸡传染性法氏囊病变异株VP2重组乳酸菌的构建及免疫效果评价》文中研究说明乳酸菌通常是指存在于自然界及人和动物肠道黏膜中的一类可以将糖类代谢为乳酸等有机酸类物质的革兰氏阳性菌的统称,部分乳酸菌具有生物安全和食品安全特性,是世界公认的益生乳酸菌,益生乳酸菌不含内毒素,其细胞壁及核酸等成分具有免疫佐剂作用,因此乳酸菌常是表达外源抗原的首选载体。传染性法氏囊病（IBD）是严重危害禽类的一种由病毒引起的免疫抑制性疾病,最近在中国、日本和北美流行变异株传染性法氏囊病毒（IBDV）的感染,且目前常规的IBDV疫苗不能保护变异株IBDV（vaIBDV）的感染。因此本研究拟通过构建表达变异株IBDV VP2的重组乳酸菌作为预防变异株IBDV（vaIBDV）的候选疫苗来进行新型疫苗的研究。本研究采用生物安全和食品安全级益生乳酸乳球菌NZ3900菌株作为宿主菌,采用无抗生素标记的食品安全级p NZ8149表达质粒载体构建表达vaIBDV VP2（vaVP2）的重组乳酸乳球菌。为了提高抗原递呈细胞对重组vaVP2蛋白的摄取能力,我们将vaVP2蛋白与鼠伤寒沙门氏菌侵袭蛋白RCK蛋白的部分功能结构域进行了融合表达,成功构建了重组乳酸乳球菌r-L.lactis-vaVP2-RCK。通过Western blot表明,重组乳酸乳球菌成功表达了52 k D左右大小的目的蛋白,与预期结果相同,蛋白定量检测表明重组蛋白的表达量为57.6μg/m L。动物试验结果表明,每只鸡肌肉注射免疫108CFU的重组乳酸乳球菌r-L.lactis-vaVP2-RCK,免疫两周后血清对变异株vaIBDV-SHG19中和抗体滴度为1:24-6,对超强毒vv IBDV-HLJ0504中和抗体滴度为1:21-2;攻毒结果表明,对攻毒变异株vaIBDV-SHG19的SPF鸡起到100%的免疫保护作用,BBIX指数均大于0.7,法氏囊未受到损伤;对攻毒经典超强毒vv IBDV-HLJ0504的SPF鸡也可提供100%的存活,但法氏囊受到一定程度的损伤,BBIX指数几乎都小于0.7。检测免疫鸡外周单核细胞（PBMCs）中T淋巴细胞及抗原递呈细胞的增殖活性表明,免疫重组乳酸乳球菌r-L.lactis-vaVP2-RCK两周后可以显着提高鸡外周单核细胞中T淋巴细胞及抗原递呈细胞的增殖活性;并且免疫三周攻毒一周后鸡血清中细胞因子IL-12及干扰素-γ（IFN-γ）的含量显着高于攻毒对照组和空白对照组。以上结果表明:免疫重组乳酸乳球菌r-L.lactis-vaVP2-RCK可以对变异株病毒vaIBDV起到完全的免疫保护作用,并且对经典超强毒vv IBDV-HLJ0504也可起到一定的免疫保护作用。本研究构建的重组乳酸乳球菌r-L.lactis-vaVP2-RCK通过注射免疫可以诱导机体产生的独特的中和抗体,可以完全抵抗变异株IBDV感染,对目前IBD变异株的防控具有重要的现实意义。
项瑞[2]（2021）在《鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒重组蛋白的免疫保护效果研究》文中指出新城疫、禽流感以及鸡传染性法氏囊病是具有高度传染性的疾病,对多种家禽和野生鸟类均有不同程度的影响,对商品鸡和散养鸡农户都造成了巨大的损失。使用疫苗是控制这些疾病的最主要方法。目前临床上主要使用新流法灭活疫苗进行免疫防控,根据临床调查发生,疫苗免疫,存在免疫效率低,需反复接种等问题。本实验利用实验室已制备鉴定的新城疫重组蛋白（HN、NP、M、F）;禽流感重组蛋白（HA、NA、M1）。同时构建传染性法氏囊VP2蛋白的表达载体p RSFduet1-sumo-VP2（BC6/85）并在大肠杆菌系统中表达,为验证重组蛋白的免疫保护效果,首先分别使用新城疫、禽流感和VP2重组蛋白进行预实验,验证其免疫原性。根据试验结果再制备三联抗原液,检测鸡群免疫后的血清抗体水平。在免疫后第四周,使用新城疫SZ株、传染性法氏囊BC6/85株分别攻毒两组鸡群,本论文的主要研究结果如下。1.传染性法氏囊VP2蛋白的表达及检验将扩增的VP2基因克隆至p RSFduet1-sumo载体,获得p RSFduet1-sumo-VP2重组质粒。经过测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达VP2蛋白。并利用亲和层析镍柱纯化VP2蛋白,最后切割sumo标签。将重组蛋白产物经SDS-PAGE分析,获得目的蛋白条带。经Western-blotting进一步鉴定,VP2蛋白与IBDV阳性血清具有较好的反应性。经双向琼脂扩散实验测得VP2蛋白的AGP效价为1:64。经血凝试验测得NDV重组蛋白的血凝效价为26,AIV重组蛋白产生的血凝效价为29。2.重组蛋白的免疫原性实验先将表达的VP2蛋白与本实验室保存的新城疫、禽流感重组蛋白分别与白油佐剂进行乳化制备抗原液,分别免疫30日龄SPF鸡。再将三种蛋白共同乳化制备抗原液,共同免疫鸡群。在免疫后第14天、21天、28天进行采血分离血清,利用血凝抑制实验和双向琼脂扩散实验测定抗体效价。结果表明:免疫新城疫重组蛋白的鸡群HI效价为3.4log2;免疫禽流感重组蛋白的鸡群HI效价为7.9log2;VP2蛋白免疫组在第4周抗体达到高峰,最高AGP效价为1:128。免疫4周后,100%的鸡群获得有效免疫。三联抗原液免疫实验中,80%的鸡群产生对新城疫的抗体;90%鸡群产生对禽流感的抗体;100%的鸡群产生对传染性法氏囊的抗体。3.新城疫及传染性法氏囊的攻毒实验三联重组蛋白免疫鸡群后28天分别皮下注射新城疫SZ株20μL(含105.0EID50);传染性法氏囊BC6/85株0.2 m L（病毒含量大于100BID-法氏囊感染剂量）进行攻毒实验。结果表明:NDV重组蛋白保护率为90%,IBDV VP2保护率为70%。小结:本研究成功表达了传染性法氏囊VP2蛋白,同时制备了新城疫（基因Ⅶ型）、禽流感（H9亚型）、传染性法氏囊（BC6/85株）三联抗原液,动物试验表明其具有良好免疫保护效果,为后续新流法基因工程亚单位疫苗的研发提供了材料和数据支撑。
王宇[3]（2019）在《表达FLAG标签融合VP1蛋白的重组IBDV拯救及其作为致弱疫苗候选株评估研究》文中认为鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是一种由其病原体鸡传染性法囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）感染而引起的在雏鸡中急性并具有高度传染性和免疫抑制性的疾病。疫苗免疫是防控的主要手段,随着变异毒株（Variant IBDV）和高致病力的超强毒株（Very virulent IBDV,vvIBDV）的出现,开展新型疫苗株的构建研究十分必要。IBDV属双链RNA（dsRNA）病毒科（Birnaviridae）,其基因组由A、B二个节段dsRNA所组成。在本研究中,成功构建了一种高效的双启动子RNA polymerase（Pol I）-Pol II反向遗传系统,可以在无需VP1和VP3辅助的情况下完全从克隆的cDNA直接拯救重组IBDV。我们将IBDV-A44株A片段和B片段基因组分别克隆在真核表达载体pCI-neo的CMV启动子和polyA之间,构建IBDV感染性克隆p2-mA和p2-mB,直接转染293T细胞,72h后取上清继续在DF-1细胞上传代,直接拯救出与亲本毒有一致的复制动力学重组病毒。进一步,我们在VP1的C末端引入8-aa FLAG表位（DYKDDDDK）,得到表达FLAG标签的A44/FLAG拯救毒株。通过RT-PCR、间接免疫荧光、序列测定、Western-blot及透射电镜等均检测到了拯救的IBDV及融合表达的VP1蛋白FLAG标签。通过病毒空斑实验、复制动力学试验和SPF鸡攻毒试验,显示尽管与亲本病毒的病毒复制动力学具有相似的模式,但表达FLAG标签融合VP1的重组病毒在DF-1细胞系斑块表型显着减少,以及对法氏囊的损伤显着减少。此外,重组FLAG标记的IBDV具有与亲本毒株相当水平引发针对VP2的中和抗体的能力,并且在单次免疫时,赋予针对野生型IBDV的后续致死攻击的完全保护。总之,该研究表明,拯救的表达FLAG标签融合VP1的重组病毒可作为减毒活IBDV疫苗株;编码VP1的B区段基因中外源表位序列的靶向插入是用于设计减毒很好的策略,对探索IBDV分子致弱机制与研发适合于流行毒株的新型疫苗具有重要意义。
范明惠[4]（2018）在《IBDV强、弱毒株病毒样颗粒免疫原性的比较及噬菌体抗IBDV抗体文库的构建》文中认为传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的急性、致死性疾病,主要攻击禽类重要的中枢免疫器官法氏囊,能够引起免疫抑制进而导致严重的继发感染,最终造成鸡的死亡,危害家禽养殖业的发展。疫苗是防控该病的有效方法,传统的疫苗存在一些难以避免的缺点,弱毒苗的广泛使用易导致毒株突变,而强毒灭活苗存在灭活不彻底等生物安全隐患。近年兴起的病毒样颗粒（VLP）等亚单位疫苗能克服上述缺点,诱导机体产生良好的免疫反应。目前很多鸡场也采用卵黄抗体紧急治疗IBD发病鸡群,在一定程度上降低了经济损失。卵黄抗体虽然制备方式简单,但是具有纯度差和抗体滴度低等缺点,采用基因工程方法制备高纯度的治疗性抗体是病毒性疾病治疗的发展趋势。VP2是IBDV唯一的衣壳蛋白,位于病毒衣壳的外部,能够刺激机体产生中和抗体,决定IBDV的抗原性,是制备VLP疫苗的重要靶标。然而IBDV强、弱毒VP2诱导免疫反应存在差异,为筛选更有效的IBDV VLP候选疫苗,本研究在IBDV超强毒株Gx株VLP制备的基础上,扩增IBDV人工致弱毒株Gt株的VP2基因序列,将其克隆在酵母表达载体pAO815上构建成pAO815-NHisGtVP2质粒,将其电转至酵母菌株SMD1168后,经过5天的诱导表达,成功表达了Gt VP2蛋白。通过疏水层析纯化的方法制备了纯度高的弱毒VLP,建立了更高效的VLP制备方法。琼脂扩散试验结果表明制备的Gt VLP具有良好的抗原性。将Gx和Gt VLP免疫SPF鸡,比较评价了二者对IBDV超强毒的免疫保护效果。强、弱毒VLP免疫组血清中和抗体滴度在免疫5周内始终维持在较高的水平,表明二者均能诱导产生持续的免疫反应。强毒VLP免疫组能够产生100%的攻毒保护率,攻毒后法氏囊状态良好。而弱毒VLP免疫组能够产生80%的攻毒保护率,攻毒后鸡的法氏囊萎缩明显。这些结果表明,免疫强毒VLP比免疫弱毒VLP对鸡群抵抗IBDV超强毒株具有更好的保护效果。噬菌体展示技术是筛选抗体的有效技术手段,为了筛选有效的IBD治疗性抗体,本研究从免疫过Gx VLP的鸡全血中分离外周血淋巴细胞,从中扩增出抗体的轻链可变区（VL区）与重链可变区（VH区）,通过柔性Linker将二者连接。将其克隆进噬菌粒构建了pCANTAB5E-scFv质粒,转化之后建立了鸡源噬菌体抗IBDV抗体文库。通过三轮的淘选富集以及ELISA鉴定,最终测序得到了5株阳性抗体序列。表达纯化后的单链抗体的中和活性有待进一步验证。本研究比较了强、弱毒病毒样颗粒的免疫保护效果,为临床上亚单位疫苗的研究和应用提供了一定的参考依据,建立了噬菌体抗IBDV抗体文库并筛选到了5株抗体序列,为IBDV高效抗体的筛选与表达奠定了基础,这些研究对IBDV的防控具有重要意义。
李松[5]（2015）在《鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定》文中认为鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的一种急性、高度接触性的传染性疾病。IBDV主要是侵害鸡法氏囊组织中的B淋巴细胞,使B细胞数量减少,引起严重的免疫抑制,进而导致免疫失败和诱发继发感染。近几年来,IBD流行毒株不断产生新的变异。本研究从福建某地区疑似IBD病鸡的法氏囊、脾脏等组织中成功地分离到一株病毒,通过鸡胚培养、RT-PCR检测、基因测序、动物回归试验等方法对这株病毒进行了鉴定,结果如下:1.经绒毛尿囊膜接种该分离病毒,鸡胚头部、四肢末端等出血,其鸡胚半数致死量（EID50）为10-4.5/0.2mL。2.动物回归试验中,感染该病毒的SPF雏鸡大腿肌和胸肌出血,法氏囊、脾脏肿大出血。3.通过测序比对分析发现,该分离病毒株与参考的中等偏强毒力疫苗株的核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性高,分别为98.7%-99.0%,99.0%-99.5%,七肽区均为SWSASGS,毒力相关位点的氨基酸相同,在遗传进化关系上也处于同一进化分支,亲缘关系近,可能存在相同的来源。结果表明,本研究所分离的病原为IBDV,具有较强的毒力。
高冬妮,金丽颖,安琦,申燕,平文祥,葛菁萍[6]（2013）在《鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株全基因组的克隆与分子系统进化树分析》文中进行了进一步梳理为了获得鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株的全基因组cDNA,确定其分子进化关系。以IBDV J1C7株细胞培养液为材料,用蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取IBDV基因组dsRNA,利用特异性引物将基因组A、B节段分两段进行RT-PCR并通过融合PCR方法将具有部分重叠序列的A、B节段的上、下游基因组进行拼接,从而构建出完整的A、B节段基因组,利用pMD-18T载体快速克隆PCR产物。结果表明:获得了3260 bp的A节段全长（Genbank登录号EF646854）和2827 bp的B节段全长（Genbank登录号EF646853）。氨基酸同源性比对结果表明:J1C7株与弱毒疫苗株CEF94（芬兰）、P2（德国）、JD1（中国）、HZ2（中国）的亲缘关系最近（蛋白同源性为VP5:99.3%;VP2:99.3%100%;VP4:97.9%99.2%;VP3:96.4%98.1%;VP1:99.2%99.9%）。BDV J1C7株属于弱毒疫苗株,且与欧洲和中国的弱毒疫苗株有密切的亲缘关系,在进化树上归为一簇。本研究为构建IBDV的感染性cDNA,了解IBDV基因组的结构与功能打下了基础。
汪振兴[7]（2009）在《鸡传染性法氏囊病病毒快速、实用检测技术的研究》文中研究表明传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus）引起鸡和火鸡的急性、高度接触性传染病。该病主要侵害3到8周龄的雏鸡的中枢免疫器官,引起免疫抑制。IBD的流行给世界养禽业造成了巨大经济损失。80年代后IBD的流行的出现了新特点,超强毒株以及变异株不断出现,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此,建立IBDV快速检测技术和超强毒与经典毒的鉴别诊断技术,对防控IBDV的流行尤为重要。本文分别基于分子生物学和免疫学技术建立了检测IBDV病原的RT-PCR、抗原捕获ELISA（AC-ELISA）诊断方法,同时建立了荧光定量RT-PCR方法,实现了IBDV超强毒株与经典疫苗毒株的鉴别诊断。为了建立特异、灵敏、通用性强的RT-PCR检测技术,根据IBDV VP4基因的保守序列,设计了一对通用引物Rpa/Rpb,通过优化反应条件,建立了检测IBDV的RT-PCR方法。检测灵敏度达到10.5pg总RNA。可以检测出1:320倍稀释的阳性法氏囊样品。使用建立的方法检测禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒,以及沙门氏菌、葡萄球菌等对照菌株,均为阴性。81个样品的检测结果表明,与OIE推荐的RT-PCR方法相符率为96.3%。说明建立的检测鸡传染性法氏囊病病毒的RT-PCR方法敏感、特异,可用于IBDV的检疫、诊断和监测。为了建立特异的免疫学检测技术,使用纯化的鸡抗IBDV多克隆抗体和鼠抗IBDV单克隆抗体,建立了抗原捕获ELISA（AC-ELISA）检测鸡法氏囊病毒的方法。使用建立的方法检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌等均为阴性。IBDV疫苗及阳性法氏囊组织1:160倍稀释仍可以检出。检测IBDV超强毒、疫苗毒、人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品78份,检出阳性24份,与RT-PCR检测结果相符率为96%（75/78）。说明建立的方法敏感、特异,可用于临床样品的检测。为了鉴别IBDV超强毒株与经典毒株,根据超强毒株和经典毒株VP4基因序列的差异,分别设计了FAM标记的超强毒荧光探针和JOE标记的经典毒荧光探针,建立了实时荧光RT-PCR鉴别IBDV超强毒株和经典疫苗毒株的方法。检测超强毒和经典毒的敏感性分别可达420和320个拷贝数。建立的实时荧光RT-PCR方法敏感性高、特异性强,可用于临床样品中IBDV超强毒和经典毒的鉴别诊断。
祁小乐[8]（2007）在《鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究》文中研究指明鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的一种主要危害3-6周龄雏鸡的急性、高度接触性传染病。该病于1957年首发于美国Gumboro地区，50年米，一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异，特别是超强毒株（vvIBDV）的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局（the Office Internationnal des Epizooties，OIE）将IBD列为“影响社会经济的重要疾病”。关于IBDV的变异以及毒力和细胞嗜性的分子基础，一直是科研工作者研究的重点之一。本课题组的前期研究将超强毒Gx株（vvIBDV）经SPF鸡胚传5代、CEF上传20代驯化致弱为减毒株Gt。Gx株致鸡死亡率高达60％以上且不适应CEF细胞培养，Gt株对鸡无明显毒力且能在CEF上增殖，传代致弱过程中的F9代毒对鸡的毒力显着降低而且适应CEF细胞培养。本研究建立了IBDV基因组长距离高保真PCR方法（LA-PCR），利用此方法克隆了IBDV减毒株Gt的全基因组以及超强毒Gx传代致弱过程中的F9代毒的VP2并对其进行了测序。序列分析发现，与Gx株比较，F9代毒VP2有2个氨基酸突变（Q253H和A284T），Gt株VP2在此基础上又有10个氨基酸突变。另外，Gx株与Gt株在VP3和VP4上各有4个、6个氨基酸差异。本研究的目的是构建高效IBDV反向遗传操作系统，研究VP2、VP3、VP4等基因的序列差异与IBDV细胞嗜性、复制和毒力的关系。目前用于IBDV研究的体外转录、基于T7RNA聚合酶的体内转录、RNA聚合酶Ⅱ体内转录等反向遗传操作系统在病毒拯救效率和操作简便性等方面仍然存在着一些问题。本研究以全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV高效反向遗传操作系统。分别在Gt株基因组两端引入了锤头状核酶结构（Hammerhead ribozyme，HamRz）和丁肝病毒核酶结构（Hepatitis delta ribozyme，HdvRz），并将其克隆在真核表达载体pCAGGS的CMV增强子和β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，经Plasmid Midi Kit（QlAGEN）纯化后，在LipofectamineTM 2000（Invitrogen）的介导下，直接转染DFI细胞，72h后取上清继续在CEF上传代。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE，且与亲本毒Gt有一致的复制动力学曲线。该系统高效、简便、稳定，具有良好的细胞普适性，能在DFI、Vero/E6、Vero/P12等多种细胞上高效拯救出病毒。IBDV高效反向遗传操作系统的建立为深入研究IBDV的基因功能奠定了基础，也为其它双RNA病毒的反向遗传操作提供借鉴。采用融合PCR（fusion PCR）的方法对Gx、F9、Gt等三个毒株的VP2基因进行了相互替换，利用所建立的反向遗传操作系统，拯救出了三个VP2基因嵌合病毒rGx-F9VP2、rGx-GtVP2、rGt-F9VP2。通过复制动力学试验和SPF鸡攻毒试验，证明：VP2的253和284位氨基酸决定IBDV细胞嗜性，Q253H和A284T可使vvIBDV适应CEF培养，并且具有明显的减毒作用；VP2的A222P、I242V、I256V、D279N、I294L、S299N、S330R等七个氨基酸变化可促进IBDV在CEF上的复制，这七个位点也与IBDV的毒力相关。另外，将vvIBDV Gx株的VP3/3’NCR、VP4/VP3/3’NCR、VP4替换Gt株的相应区域，利用上述反向遗传操作系统，拯救出三个嵌合病毒rGt-GxVP3/3’NCR、rGt-GxVP4/VP3/3’NCR、rGt-GxVP4。通过病毒复制动力学试验和对SPF鸡攻毒试验，证明VP3与IBDV在CEF上的复制相关（其中P981L可能有正向促进作用）；VP3不影响IBDV的毒力；VP4不影响IBDV的毒力以及在CEF上的复制，对VP3亦无协同作用。本研究用全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV反向遗传操作系统，并对IBDV VP2、VP3、VP4的功能作了研究，对全面了解IBDV的结构与功能，明确IBDV变异的分子基础，揭示IBDV致病与免疫的分子机制，探索IBDV分子致弱方法，研发适合于流行毒株的新型疫苗具有重要意义。
刘锴[9]（2007）在《传染性法氏囊B87株全长cDNA的克隆及反向遗传系统的初步建立》文中认为传染性法氏囊病（Infection bursal disease, IBD）是由鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行。而常规的从“性状-基因”的研究策略具有一定的局限性,研究者不能更有针对性地、主动地对各种病毒进行研究。因此,可以考虑反其道而为之,即从“基因-性状”,这样,反向遗传操作技术（Reverse genetics manipulation technique）应运而生。反向遗传操作技术的诞生和运用,开启了人们对病毒基因组进行人工操作以及详细了解病毒基因及其产物功能的大门。本研究克隆了IBDV B87株的全基因组,并对其基因组进行了详细的生物信息学分析,结果发现了一些针对不同强弱毒力的毒株,而呈规律性变化的氨基酸位点,同时发现VP2仅是决定IBDV毒力的因素之一。B节段在系统发育中要比A节段相对保守。结合计算机软件在A、B节段基因组上分别各找到一个沉默突变的位点,通过PCR的方法进行沉默突变,获得了带有遗传标志的A、B基因组全长载体。在此基础上构建了A、B基因组5′带有T7转录子基因的体外转录载体和带有绿色荧光蛋白的体内转录真核表达载体。将体外转录载体转录的RNA与体内转录载体分别和脂质体共转染Vero细胞,经多次传代“拯救”出带有遗传标志的IBDV病毒。
杨蒙[10]（2007）在《鸡传染性法氏囊病病毒强弱毒株的鉴别及VP2基因在大肠杆菌中的表达》文中研究说明鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊,不但会使感染鸡致病死亡,生产性能下降,而且还可致雏鸡免疫抑制,导致鸡群对新城疫、马立克病及传染性支气管炎等多种重要疫病的免疫失败,引起了世界禽病工作者的高度重视,是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。尤其是20世纪80年代中期以后出现的超强毒株（vvIBDV）,能使感染鸡的死亡率达到60%以上,给世界养禽业带来了严重的经济损失。1957年该病首次在美国特拉华州的甘布罗镇（Gumboro）的肉鸡群中发生。最初分离到的病毒发病率高,但致死率通常在2%～5%,偶尔达20%～30%,这种病毒株称之为标准毒IBDV（vIBDV）。20世纪80年代后期,美国出现了与标准毒在抗原性上有明显差异的变异株。欧洲国家首先报道了致死率高达90～100%的超强毒（vvIBDV）,90年代初传至中国及亚洲其他地区。vvIBDV感染现己遍布于全球主要养禽地区,在工业化养鸡业发达的国家尤为严重。IBDV是双链RNA病毒,属于双RNA病毒科（Biranviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）,无囊膜,呈二十面体对称,病毒粒子直径60nm。其基因组由A、B两个节段组成。B节段（约218kb）编码VP1蛋白,为RNA依赖的RNA聚合酶。A节段（约313kb）具有两个相互重叠的开放阅读框（ORF）,下游的ORF1编码的前体蛋白VP2/VP4/VP3可进一步剪切加工为VP2、VP4及VP3。其中VP2是病毒的主要宿主保护性抗原,与病毒的抗原变异和毒力相关;VP4为一种丝氨酸蛋白酶,负责前体蛋白VP2/VP4/VP3的自我剪切;VP3是病毒的结构蛋白之一,具有群特异性抗原。上游的ORF2（438bp）编码非结构蛋白VP5（约15ku）,该蛋白非病毒复制所必需,与病毒致病性有关。IBDV不同毒株氨基酸的差异主要发生于VP2区特别是206至305个氨基酸,称之为VP2高变区,是抗原性的主要部位。这段区域内不同毒株间的变异很大,其分子结构的改变常导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗不能控制其流行。在VP2基因高变区内包括2个亲水区和1个七肽区。亲水区是变异发生的热点部位,对于超强毒株抗原性极为重要。本研究区分了IBDV超强毒株和强毒、疫苗株,并在大肠杆菌中表达了IBDV的VP2基因,获得了以下结果:1. RT-PCR辅助限制性内切酶方法鉴别IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株首先根据GenBank上IBDV VP2基因组的保守序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增出大小为802bp的PCR产物。对比分析了IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株基因组PCR产物的酶切位点,选出Aha I、Stu I和BamH I、Nsp I两组限制性内切酶。分别对超强毒株、强毒株及疫苗株进行酶切,以区分超强毒株、强毒株及疫苗株。结果表明,超强毒株能被Aha I、Stu I切出327bp的片段,而强毒株及疫苗株则只能被BamH I、Nsp I切出270bp的片段。这种方法能够准确、快速地检测出发病是否由IBDV超强毒株引起,为IBD的诊断提供了一种新的手段。2. IBDV VP2基因的原核表达根据IBDV陕西地区分离株的VP2基因的cDNA为模板,设计相应引物进行扩增。得到的目的基因连接到pET-32α原核表达载体中,得到重组质粒pET-VP2。经过PCR、酶切及测序分析,确定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确,与预期序列相符。再将重组质粒转化到大肠杆菌JM109中,IPTG诱导表达得到分子质量约为60ku的目的蛋白,为制备抗VP2蛋白的单克隆抗体提供了基础材料。
二、一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2-4-3基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2-4-3基因（论文提纲范文）
（1）表达鸡传染性法氏囊病变异株VP2重组乳酸菌的构建及免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳酸菌概述 |
| 1.2 乳酸菌作为活载体表达外源蛋白的概述 |
| 1.2.1 乳酸菌免疫调节作用的研究 |
| 1.2.2 乳酸菌表达外源蛋白的研究 |
| 1.2.3 乳酸菌作为疫苗活载体的研究 |
| 1.3 鸡传染性法氏囊病(IBD)的概述 |
| 1.3.1 IBD病原特征及遗传变异 |
| 1.3.2 IBD变异株的防控 |
| 1.4 目的与意义 |
| 第二章 表达变异株VP2 蛋白重组乳酸菌的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试剂材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因的优化及合成 |
| 2.2.2 目的片段与表达载体的扩增及纯化 |
| 2.2.3 宿主菌株乳酸菌乳球菌NZ3900 感受态的制备 |
| 2.2.4 重组质粒pNZ8149-vaVP2 的构建 |
| 2.2.5 重组乳酸菌r-L.lactis-vaVP2 的构建及鉴定 |
| 2.2.6 重组乳酸菌r-L.lactis-vaVP2 的诱导表达 |
| 2.2.7 重组乳酸菌r-L.lactis-vaVP2 表达目的蛋白定量测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因片段及线性载体的扩增 |
| 2.3.2 重组乳酸菌r-L.lactis-vaVP2 的筛选及PCR鉴定 |
| 2.3.3 重组乳酸菌r-L.lactis-vaVP2 目的蛋白的表达鉴定 |
| 2.3.4 重组乳酸菌r-L.lactis-vaVP2 目的蛋白定量测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组乳酸菌R-L.LACTIS-VAVP2 的免疫效果评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株、单克隆抗体、疫苗及试验动物 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 试剂材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 动物试验的分组及设计 |
| 3.2.2 免疫攻毒保护试验 |
| 3.2.3 囊重指数及囊体比的检测 |
| 3.2.4 血清中和抗体的检测 |
| 3.2.4.1 IBDV的 TCID_(50)测定 |
| 3.2.4.2 血清中和抗体的测定 |
| 3.2.5 血清ELISA抗体滴度的检测 |
| 3.2.6 PBMCs中 T淋巴细胞增殖活性的检测 |
| 3.2.7 PBMCs中抗原递呈细胞增殖活性的检测 |
| 3.2.8 血清细胞因子的检测 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫后攻毒保护率 |
| 3.3.2 法氏囊指数及囊体比 |
| 3.3.3 血清中和抗体及ELISA抗体 |
| 3.3.4 PBMCs中 T淋巴细胞增殖活性 |
| 3.3.5 PBMCs中抗原递呈细胞增殖活性 |
| 3.3.6 血清细胞因子的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒重组蛋白的免疫保护效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡新城疫及其疫苗研究进展 |
| 1.1.1 新城疫概述 |
| 1.1.2 新城疫在我国的流行现状 |
| 1.1.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.1.3.1 传统疫苗 |
| 1.1.3.2 载体疫苗 |
| 1.1.3.3 利用Toll样受体配体作为佐剂的疫苗 |
| 1.1.3.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.1.4 新城疫防控措施 |
| 1.2 禽流感及其疫苗研究进展 |
| 1.2.1 禽流感概述 |
| 1.2.2 H9 亚型禽流感在我国流行现状 |
| 1.2.3 H9 亚型禽流感疫苗研究进展 |
| 1.2.4 禽流感防控措施 |
| 1.3 鸡传染性法氏囊病及其疫苗研究进展 |
| 1.3.1 鸡传染性法氏囊病概述 |
| 1.3.2 传染性法氏囊病流行现状 |
| 1.3.3 传染性法氏囊病毒蛋白结构和功能相关研究 |
| 1.3.4 鸡传染性法氏囊病疫苗研究进展 |
| 1.3.5 鸡传染性法氏囊病防控措施 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 传染性法氏囊VP2 蛋白的制备及检验 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 毒株 |
| 2.1.2 主要试剂及配制 |
| 2.1.2.1 主要试剂 |
| 2.1.2.2 主要溶液的配制 |
| 2.1.2.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 传染性法氏囊VP2 蛋白的制备 |
| 2.2.2 传染性法氏囊VP2 蛋白的纯化 |
| 2.2.3 VP2 蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.2.4 重组蛋白的Western Blot分析 |
| 2.2.5 传染性法氏囊VP2 蛋白的滴度测定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 VP2 片段的PCR扩增结果 |
| 2.3.2 VP2 片段PCR扩增产物回收结果 |
| 2.3.3 克隆质粒的菌液PCR鉴定结果 |
| 2.3.4 VP2 蛋白的SDS-PAGE分析结果 |
| 2.3.5 VP2 蛋白的Western Blot鉴定结果 |
| 2.3.6 VP2 蛋白滴度测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 免疫保护效果研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 新城疫及禽流感重组蛋白的滴度测定 |
| 3.2.2 抗原液的制备及检验 |
| 3.2.2.1 单抗原液的制备 |
| 3.2.2.2 三联抗原液的制备 |
| 3.2.2.3 抗原液的检验 |
| 3.2.3 单个抗原的免疫保护效果研究 |
| 3.2.3.1 新城疫及禽流感的抗体检测 |
| 3.2.3.2 传染性法氏囊的抗体检测 |
| 3.2.4 三联抗原液的免疫保护效果研究 |
| 3.2.4.1 新城疫及禽流感的抗体检测 |
| 3.2.4.3 传染性法氏囊抗体检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 新城疫、禽流感重组蛋白血凝效价测定结果 |
| 3.3.2 单个抗原的免疫保护效果研究结果 |
| 3.3.2.1 新城疫及禽流感的抗体检测结果 |
| 3.3.2.2 新城疫的攻毒试验结果 |
| 3.3.2.3 传染性法氏囊的抗体检测与攻毒试验结果 |
| 3.3.3 多抗原液的免疫保护效果研究结果 |
| 3.3.3.1 新城疫及禽流感的抗体检测结果 |
| 3.3.3.2 新城疫的攻毒试验结果 |
| 3.3.3.3 传染性法氏囊的抗体检测与攻毒试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）表达FLAG标签融合VP1蛋白的重组IBDV拯救及其作为致弱疫苗候选株评估研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 传染性法氏囊病 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒 |
| 1.2.1 病毒的分类和形态 |
| 1.2.2 血清型和理化性质 |
| 1.2.3 生物学特性和抵抗力 |
| 1.2.4 IBDV的基因组 |
| 1.2.5 IBDV的编码蛋白及其功能 |
| 1.2.6 IBDV的培养特性 |
| 1.2.7 流行病学 |
| 1.2.8 IBDV的诊断方法 |
| 1.2.9 IBDV的防治 |
| 1.3 IBDV反向遗传研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 传染性法氏囊病病毒反向遗传拯救系统的建立 |
| 2.1 实验仪器和试剂 |
| 2.1.1 细胞、载体与菌株 |
| 2.1.2 分子生物学试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 IBDV全基因组真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 拯救系统的建立及鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 拯救表达FLAG标签融合VP1 蛋白的重组IBDV |
| 3.1 实验仪器和试剂 |
| 3.1.1 细胞、载体与菌株 |
| 3.1.2 分子生物学试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 构建p2-mBFlag和 p2-FlagmB |
| 3.2.2 IBDV/Flag的拯救及鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 A44/FLAG毒株的形态学及致病性研究 |
| 4.1 实验仪器和试剂 |
| 4.1.1 细胞、毒株、实验动物 |
| 4.1.2 分子生物学试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 IBDV病毒的扩大培养以及浓缩 |
| 4.2.2 病毒纯化 |
| 4.2.3 动物实验 |
| 4.2.4 间接免疫荧光 |
| 4.2.5 法氏囊组织收样 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 电镜观察结果 |
| 4.3.2 动物实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（4）IBDV强、弱毒株病毒样颗粒免疫原性的比较及噬菌体抗IBDV抗体文库的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病(IBD)的概况 |
| 1.1.1 IBD概述 |
| 1.1.2 IBD的流行病学 |
| 1.2 鸡传染性法氏囊病毒 |
| 1.2.1 IBDV病原学及基因组结构 |
| 1.2.2 IBDV基因组编码的蛋白 |
| 1.2.3 IBDV的致病性 |
| 1.3 病毒样颗粒(VLPs)的表达与制备 |
| 1.3.1 VLPs的表达概述 |
| 1.3.2 VLPs的纯化概述 |
| 1.4 噬菌体展示技术的研究进展 |
| 1.4.1 噬菌体展示技术概述 |
| 1.4.2 噬菌体展示技术在抗体筛选中的应用 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 弱毒株VP2病毒样颗粒的表达与制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、感受态 |
| 2.1.2 主要试剂、仪器及耗材 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 弱毒VP2基因的扩增与重组质粒的构建 |
| 2.2.2 线性化酵母表达重组质粒 |
| 2.2.3 Pichia酵母感受态制备及电转化 |
| 2.2.4 弱毒VP2蛋白在酵母中的诱导表达 |
| 2.2.5 弱毒VP2蛋白的纯化 |
| 2.2.6 弱毒VP2蛋白纯化后免疫原性的鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 pAO815-NHisGtVP2质粒的构建与鉴定 |
| 2.3.2 弱毒VP2蛋白的表达与鉴定 |
| 2.3.3 弱毒VP2蛋白的纯化与VLP的制备 |
| 2.3.4 弱毒VP2组成的病毒样颗粒反应原性的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 强、弱毒株病毒样颗粒免疫原性的比较 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株和实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫样品的处理 |
| 3.2.2 动物实验的分组与免疫 |
| 3.2.3 血清中和抗体滴度的检测 |
| 3.2.4 强、弱毒VLP的ELISA酶标板的包被 |
| 3.2.5 鸡血清中抗体总量的测量 |
| 3.2.6 攻毒保护实验 |
| 3.2.7 临床症状的观察及存活率、囊保护率的评价 |
| 3.2.8 法氏囊中病毒载量的测定 |
| 3.2.9 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 中和抗体滴度 |
| 3.3.2 囊重指数(BBIX) |
| 3.3.3 法氏囊中病毒的载量的检测 |
| 3.3.4 攻毒保护率 |
| 3.3.5 免疫强、弱毒VLP后血清与强、弱毒VLP的交叉反应 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 鸡源抗IBDV抗体文库的构建及有效抗体的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 感受态、载体 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 4.2.2 抗体重链、轻链可变区的扩增 |
| 4.2.3 VH和VL两个基因片段overlap-PCR |
| 4.2.4 pCANTAB5E-scFv质粒的构建 |
| 4.2.5 噬菌体初级抗体文库的构建 |
| 4.2.6 初级文库的质量与多样性分析 |
| 4.2.7 抗体的淘选 |
| 4.2.8 阳性单克隆噬菌体的ELISA鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 样品总RNA提取及cDNA合成 |
| 4.3.2 Anti-IBDVchickenscFv文库片段的制备 |
| 4.3.3 VH与VL片段的融合 |
| 4.3.4 电转化及噬菌体文库构建 |
| 4.3.5 噬菌体文库的质量与多样性分析 |
| 4.3.6 噬菌体抗体文库的淘选 |
| 4.3.7 阳性单克隆噬菌体ELISA及测序 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 综述 |
| 1.1 研究历史 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 分类地位 |
| 1.2.2 形态特征及其结构 |
| 1.2.3 理化特性 |
| 1.2.4 培养特性 |
| 1.3 IBDV基因组 |
| 1.3.1 IBDV基因组结构及其功能 |
| 1.3.2 IBDV编码蛋白及其生物学功能 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 发病机理 |
| 1.6 临床症状 |
| 1.7 病理变化 |
| 1.8 血清型 |
| 1.9 IBDV研究展望 |
| 1.10 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.1.3 其它 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 病毒的分离 |
| 2.2.3 鸡胚接毒试验 |
| 2.2.4 鸡胚半数致死量(ELD_(50))的测定试验 |
| 2.2.5 SPF雏鸡攻毒试验 |
| 2.2.6 RT-PCR扩增 |
| 2.2.7 VP2基因序列克隆和测定 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 病毒的分离与鸡胚接毒试验结果 |
| 3.2 ELD_(50)的测定试验结果 |
| 3.3 SPF雏鸡攻毒试验结果 |
| 3.4 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.5 VP2基因的克隆 |
| 3.5.1 RT-PCR扩增 |
| 3.5.2 纯化的PCR产物电泳鉴定 |
| 3.5.3 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.6 VP2基因序列测定及其序列分析结果 |
| 3.6.1 VP2基因序列、同源性及进化树分析 |
| 3.6.2 氨基酸序列分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病毒的分离与鸡胚接毒试验 |
| 4.2 流行病学 |
| 4.3 IBDV宿主 |
| 4.4 IBD的预防 |
| 4.5 IBD疫苗 |
| 4.6 VP2基因序列测定与分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）鸡传染性法氏囊病病毒快速、实用检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒研究进展 |
| 1 引言 |
| 1.1 传染性法氏囊病病毒的形态和结构 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒理化特性 |
| 1.3 IBD 流行病学 |
| 1.4 传染性法氏囊病病毒基因组结构 |
| 1.5 传染性法氏囊病病毒的分子致病机理 |
| 1.6 传染性法氏囊病病毒编码蛋白及其功能 |
| 1.7 传染性法氏囊病病毒抗原与毒力变异的分子机制 |
| 2 传染性法氏囊病病毒诊断技术 |
| 2.1 血清学诊断方法 |
| 2.2 分子生物学诊断技术 |
| 3 研究目的 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 RT-PCR 检测鸡传染性法氏囊病病毒方法的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 抗原捕获ELISA 检测鸡传染性法氏囊病病毒方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 第四章 荧光定量 RT-PCR 鉴别 IBDV 超强毒株与经典疫苗毒株 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 试剂配制 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文和申请的专利 |
（8）鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)研究进展 |
| 1.1.1 IBDV的形态结构 |
| 1.1.2 IBDV的基因组结构 |
| 1.1.3 IBDV的编码蛋白及非编码区 |
| 1.2 动物RNA病毒的反向遗传操作系统 |
| 1.2.1 体外转录拯救系统 |
| 1.2.2 基于T7 RNA聚合酶的体内转录系统 |
| 1.2.3 RNA聚合酶Ⅰ拯救系统 |
| 1.2.4 RNA聚合酶Ⅱ拯救系统 |
| 1.3 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的拯救系统 |
| 1.4 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的反向遗传操作研究 |
| 1.4.1 关于IBDV细胞嗜性的研究 |
| 1.4.2 关于IBDV毒力分子基础的研究 |
| 1.4.3 标记疫苗研究 |
| 1.4.4 对非编码区功能的研究 |
| 1.5 问题与展望 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鸡传染性法氏囊病病毒GT株全基因组克隆与序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒、细胞、质粒和菌种 |
| 2.1.2 工具酶与主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 IBDV全基因组RNA的提取 |
| 2.1.6 IBDV全基因组的反转录 |
| 2.1.7 IBDV全基因组cDNA的扩增与克隆 |
| 2.1.8 F9代毒VP2基因的扩增与克隆 |
| 2.1.9 IBDV Gt株全基因组及F9代毒VP2序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 IBDV Gt株全基因组的克隆 |
| 2.2.2 F9代毒VP2基因的克隆 |
| 2.2.3 基因组遗传演化分析 |
| 2.2.4 基因组序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞与单克隆抗体 |
| 3.1.2 质粒和菌种 |
| 3.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 引物设计与合成 |
| 3.1.6 分子标签引入 |
| 3.1.7 核酶结构引入 |
| 3.1.8 全基因组真核表达载体的构建 |
| 3.1.9 病毒拯救 |
| 3.1.10 拯救病毒RT-PCR及分子标签鉴定 |
| 3.1.11 拯救病毒间接免疫荧光鉴定 |
| 3.1.12 拯救病毒电镜检查 |
| 3.1.13 拯救毒与亲本毒复制动力学比较 |
| 3.1.14 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与稳定性 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 IBDV全基因组分子标签的引入 |
| 3.2.2 核酶结构的引入 |
| 3.2.3 全基因组真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 病毒的拯救 |
| 3.2.5 拯救病毒RT-PCR及序列测定 |
| 3.2.6 拯救病毒间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.7 拯救病毒电镜检查 |
| 3.2.8 拯救毒与亲本毒复制动力学比较 |
| 3.2.9 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与稳定性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 RNA聚合酶Ⅱ介导的IBDV拯救系统 |
| 3.3.2 点突变方法与分子标签 |
| 3.3.3 核酶与基因组的完整性 |
| 3.3.4 基因组的保真性与病毒的拯救 |
| 3.3.5 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与高效率 |
| 3.3.6 影响病毒拯救效率的其他因素 |
| 3.3.7 判定病毒拯救成功的指标 |
| 第四章 鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因功能的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 4.1.2 SPF鸡 |
| 4.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 引物设计与合成 |
| 4.1.6 Gt株VP2替换Gx株VP2 |
| 4.1.7 F9代毒VP2替换Gx株VP2 |
| 4.1.8 F9代毒VP2替换Gt株VP2 |
| 4.1.9 Gx株B节段真核表达载体的构建 |
| 4.1.10 VP2基因替换的嵌合病毒拯救 |
| 4.1.11 嵌合病毒的鉴定 |
| 4.1.12 嵌合病毒复制动力学试验 |
| 4.1.13 嵌合病毒毒力试验 |
| 4.1.14 试验鸡法氏囊病毒分离 |
| 4.1.15 试验鸡法氏囊RT-PCR与序列测定 |
| 4.1.16 试验鸡血清抗体效价的测定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 替换Gt株VP2的Gx株A节段真核表达载体的构建 |
| 4.2.2 替换F9代毒VP2的Gx株A节段真核表达载体的构建 |
| 4.2.3 替换F9代毒VP2的Gt株A节段真核表达载体的构建 |
| 4.2.4 Gx株B节段真核表达载体的构建 |
| 4.2.5 VP2基因替换的嵌合病毒拯救 |
| 4.2.6 嵌合病毒的RT-PCR及序列测定 |
| 4.2.7 嵌合病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 4.2.8 嵌合病毒的电镜观察 |
| 4.2.9 嵌合病毒复制动力学研究 |
| 4.2.10 试验鸡的症状 |
| 4.2.11 试验鸡的剖检病变 |
| 4.2.12 试验鸡的囊重比与囊指数 |
| 4.2.13 试验鸡法氏囊的组织病理变化 |
| 4.2.14 试验鸡法氏囊病毒分离 |
| 4.2.15 试验鸡法氏囊的RT-PCR与序列测定 |
| 4.2.16 试验鸡血清抗体效价的测定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 VP2的253和284位氨基酸决定IBDV细胞嗜性 |
| 4.3.2 VP2的222等7个氨基酸与IBDV在CEF上的复制有关 |
| 4.3.3 VP2的253和284位氨基酸是IBDV的重要毒力位点 |
| 4.3.4 VP2的222等7个氨基酸是IBDV潜在的毒力位点 |
| 4.3.5 VP2不是影响IBDV复制和毒力的唯一因素 |
| 4.3.6 氨基酸突变影响IBDV细胞嗜性、复制和毒力的可能机理 |
| 4.3.7 融合PCR与基因替换 |
| 4.3.8 不完全酶切在基因克隆中的应用 |
| 第五章 鸡传染性法氏囊病病毒VP3和VP4基因功能的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 5.1.2 SPF鸡 |
| 5.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 Gx株和Gt株A节段的亚克隆 |
| 5.1.6 Gx株VP3/3’NCR替换Gt株相应区域 |
| 5.1.7 Gx株VP4/VP3/3’NCR替换Gt株相应区域 |
| 5.1.8 Gx株VP4替换Gt株相应区域 |
| 5.1.9 嵌合A节段核酶结构的引入 |
| 5.1.10 嵌合A节段真核表达载体的构建 |
| 5.1.11 嵌合病毒的拯救 |
| 5.1.12 嵌合病毒的鉴定 |
| 5.1.13 嵌合病毒复制动力学研究 |
| 5.1.14 嵌合病毒毒力研究 |
| 5.1.15 试验鸡法氏囊病毒分离与鉴定 |
| 5.1.16 试验鸡法氏囊RT-PCR与序列测定 |
| 5.1.17 试验鸡的血清抗体效价测定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 嵌合A节段真核表达载体的构建 |
| 5.2.2 嵌合病毒的拯救 |
| 5.2.3 嵌合病毒RT-PCR及序列测定 |
| 5.2.4 嵌合病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 5.2.5 嵌合病毒的电镜观察 |
| 5.2.6 嵌合病毒复制动力学研究 |
| 5.2.7 试验鸡的症状与剖检变化 |
| 5.2.8 试验鸡的囊重比与囊指数 |
| 5.2.9 试验鸡法氏囊的RT-PCR与序列测定 |
| 5.2.10 试验鸡法氏囊的病毒分离 |
| 5.2.11 试验鸡的血清抗体效价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 VP3影响IBDV在CEF上的复制 |
| 5.3.2 VP4不影响IBDV在CEF上的复制 |
| 5.3.3 VP3、VP4不影响IBDV的毒力 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）传染性法氏囊B87株全长cDNA的克隆及反向遗传系统的初步建立（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 内容提要 |
| 前言 |
| 1 研究的背景及目的意义 |
| 2 拟解决问题及研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡传染性法氏囊病的研究进展 |
| 1 IBDV 的病原学 |
| 2 IBD 的诊断 |
| 3 病毒的变异 |
| 4 病毒的致病性 |
| 5 免疫抑制 |
| 6 传染性法氏囊病的防制 |
| 7 IBD 的治疗 |
| 第二章 RNA 病毒反向遗传操作技术研究进展 |
| 1 RNA 病毒反向遗传操作体系的逐步建立 |
| 2 从cDNA 克隆拯救感染性病毒 |
| 3 IBDV 反向遗传系统的研究进展 |
| 4 反向遗传操作技术的应用 |
| 5 国内反向遗传操作技术的研究概况 |
| 6 反向遗传操作技术展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 试验一 传染性法氏囊病毒887 株基因组双节段的克隆 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二 IBDV 887 疫苗株全基因组生物信息学分析 |
| 1 所用的序列分析及生物信息学软件 |
| 2 分析与讨论 |
| 3. 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 传染性法氏囊887 株基因组cDNA 序列的定点突变 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验四 传染性法氏囊 887 株体外转录载体的构建及反向遗传系统的初步建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验五 传染性法氏囊 887 株基因组全长cDNA反向遗传系统的初步建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
| 攻读博士期间发表的主要论文 |
（10）鸡传染性法氏囊病病毒强弱毒株的鉴别及VP2基因在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 鸡传染性法氏囊病的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 IBDV 的基因组结构及病毒蛋白 |
| 1.2.1 VP1 蛋白 |
| 1.2.2 VP2 蛋白 |
| 1.2.3 VP3 蛋白 |
| 1.2.4 VP4 蛋白 |
| 1.2.5 VP5 蛋白 |
| 1.3 病毒抗原变异和毒力差异的分子基础 |
| 1.3.1 IBDV 抗原性变异的分子基础 |
| 1.3.2 IBDV 毒力变异的分子基础 |
| 1.4 IBDV 疫苗研制、免疫途径及免疫失败的原因 |
| 1.4.1 IBD 疫苗种类 |
| 1.4.2 免疫程序 |
| 1.4.3 免疫途径 |
| 1.4.4 免疫失败的原因 |
| 1.5 国内研究进展 |
| 第二章 RT-PCR 快速鉴别IBDV 超强毒株、强毒株及疫苗株的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 VP2 基因的RT-PCR 扩增 |
| 2.2.2 酶切鉴定结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 传染性法氏囊病病毒VP2 基因的原核表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PCR 扩增结果 |
| 3.2.2 克隆载体pMD-18T-VP2 的鉴定 |
| 3.2.3 原核表达载体pET-VP2 的鉴定 |
| 3.2.4 VP2 蛋白的诱导表达和SDS-PAGE 分析 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略语英汉对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2-4-3基因（论文参考文献）
- [1]表达鸡传染性法氏囊病变异株VP2重组乳酸菌的构建及免疫效果评价[D]. 王志浩. 中国农业科学院, 2021
- [2]鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒重组蛋白的免疫保护效果研究[D]. 项瑞. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]表达FLAG标签融合VP1蛋白的重组IBDV拯救及其作为致弱疫苗候选株评估研究[D]. 王宇. 浙江农林大学, 2019(01)
- [4]IBDV强、弱毒株病毒样颗粒免疫原性的比较及噬菌体抗IBDV抗体文库的构建[D]. 范明惠. 中国农业科学院, 2018(12)
- [5]鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定[D]. 李松. 福建农林大学, 2015(01)
- [6]鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株全基因组的克隆与分子系统进化树分析[J]. 高冬妮,金丽颖,安琦,申燕,平文祥,葛菁萍. 中国农学通报, 2013(32)
- [7]鸡传染性法氏囊病病毒快速、实用检测技术的研究[D]. 汪振兴. 上海交通大学, 2009(S2)
- [8]鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究[D]. 祁小乐. 中国农业科学院, 2007(05)
- [9]传染性法氏囊B87株全长cDNA的克隆及反向遗传系统的初步建立[D]. 刘锴. 吉林大学, 2007(03)
- [10]鸡传染性法氏囊病病毒强弱毒株的鉴别及VP2基因在大肠杆菌中的表达[D]. 杨蒙. 西北农林科技大学, 2007(06)