一、噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用(论文文献综述)
蒲璐,黄亚佳,杨帅,金帆[1](2020)在《合成生物学在感染性疾病防治中的应用》文中认为合成生物学是一门综合基因组学、分子生物学和工程学等一系列方法和原理而形成的综合性学科。随着合成生物学理论和技术的不断发展,科学家们设计和构建了越来越复杂的基因回路和元件,并开始在各种领域中使用这些系统,其中就包括生物医学领域。因新抗病原体药物研发速度逐渐落后于耐药性病原体出现的速度,感染性疾病的治疗已经成为现代医学重点关注的课题,对此,应用于感染性疾病的合成生物学疗法不断被尝试。本文概述了感染性疾病及其治疗的困难,简述了利用合成生物学对抗感染性疾病的优势和CRISPR技术在感染性疾病诊断中的应用,重点介绍了合成生物学在细菌和病毒感染性疾病治疗中的应用及在感染性疾病预防中的应用,感染性疾病预防具体包括预防性工程菌的构建、疫苗的研发和感染源的改造。通过回顾合成生物学家为研究感染性疾病的治疗及预防做出的努力,期望能获得新的灵感。虽然目前合成生物学疗法还处在试验阶段,但在感染性疾病防治研究中已经取得了不小的进展,可预见合成生物学将在该领域获得突破并做出贡献。
刘轲[2](2018)在《基于DNA纳米技术与原子力显微镜高分辨成像的精准基因检测研究与应用》文中研究表明DNA纳米技术是纳米科学领域的一门新兴学科,它是利用DNA依据碱基互补配对原则通过自组装行为构建成为各种维度的空间结构,具有长远的开发应用价值。DNA纳米技术的发展史可追溯到上世纪80年代中期由美国科学家N.C.Seeman开创的交叉结结构,至今已足足历经35年的飞速发展,它涵盖了DNA拼块自组装、DNA折纸术以及DNA纳米器件应用等多个方向的研究。DNA纳米材料由于具有其他传统纳米材料无法比拟的优越性,而迅速成为数学、物理、化学、计算机以及生物医学等多个学科领域的宠儿。本文通过回顾DNA纳米技术的发展史,综述性地探讨了目前DNA纳米技术在各个学科领域的前沿进展,并重点关注DNA纳米技术在生物医学尤其是遗传学领域的应用。本论文的研究主要是对当前现有DNA自组装技术进一步的理解和发展,并致力于遗传学和精准医学检测领域一些目前亟待解决的关键问题。所开展的研究工作主要包括以下几个方面:第一部分——基于DNA折纸标记的单分子单倍体分型技术。随着国际人类基因组计划的完成以及当前高通量测序技术的飞速发展,转化医学以及精准医疗等领域对遗传检测分析方法的需求也越来越高。然而目前的测序技术仍然面临着巨大的挑战,由于仪器读长的限制使得无法获取完整的DNA长片段信息。传统的单倍型检测分析方法或因为模拟计算的不精确性,或因为实验技术的复杂性而导致信息获取较为困难。在本文的研究中,我们以DNA折纸结构作为可视化探针对目标基因多态性位点进行特异性标记,通过原子力显微镜扫描得到的折纸探针图形信号直接转化为长片段目标基因的单倍型信息,并初步实现了对单分子DNA高分辨率的单倍体分型检测。这一研究不仅弥补了当前测序以及实验室基因型检测技术难以解决的问题,而且发展了一种基于DNA纳米技术与原子力显微镜相结合的新颖遗传信息检测分析方法,未来有希望应用于更广泛的基因组学分析研究,也为DNA自组装技术在生物医学领域的应用提供新的思路。第二部分——基于DNA折纸标记的乙肝病毒基因型单分子检测。在前一章完成了基于DNA折纸标记识别长片段目标基因单倍型的前期工作基础上,我们进一步深入探讨DNA纳米技术应用于精准医学检测领域的方向。如何精确诊断、预测疾病的发生发展以及提高病人的生存率,是当今生物医学研究面临的重大挑战。提高检测方法的特异性和灵敏度是解决这一难题的途径之一。传统常见的基因检测方法(如PCR、RT-PCR或测序)都是通过扩增基因组模板分子放大叠加信号来识别基因型信息。这种方式只能反映出基因组的总体遗传信息,但对于少量的罕见变异却常常被放大叠加信号所掩盖而忽略。只有实现单个分子水平上的检测才能真正做到精准的遗传信息识别。病毒基因型的精准检测对于诊断、治疗病毒感染型疾病非常关键。当前传统的检测方法大多依赖于病毒标志物的浓度水平,经常会由于患者处于病毒感染的“窗口期”而出现错检漏检的可能性,从而耽误疾病治疗的黄金时期。因此在这项研究中我们以乙型肝炎病毒(HBV)为例,通过建立一套针对不同基因型HBV的DNA折纸靶向识别探针,借助原子力显微镜(AFM)的高分辨率成像直接读取病毒DNA的遗传变异信息,从而准确判定乙肝病毒的基因型。在后续的实证研究中,我们以11例临床血液样本中提取的HBV DNA分子为研究对象,通过原子力显微成像进行单盲检测,分型结果与一代测序分析结果保持高度一致,由此验证了该检测方法高度的特异性。此外,灵敏度也是考察检测方法是否高效的金标准之一。经过多次反复测试和稳定性评估,最终发现该方法的最低检测限可达10 pM,其灵敏度要优于目前大多数现有的检测方法。研究结果表明,这种基于DNA纳米技术与原子力高分辨显微成像相结合的乙肝病毒基因型分析方法的是稳定可靠的,在未来将有望成为实验室或临床鉴定HBV基因型的一种有力手段。在论文的最后部分,对DNA纳米技术未来的发展进行一些前瞻性的展望,并介绍几个未来在多学科领域可能应用的畅想。也由此可以预见,即使DNA纳米技术目前的研究进展还无法与传统纳米材料相提并论,但是DNA纳米材料在越来越多跨学科交叉研究项目中的应用已经成为一种趋势。DNA纳米技术这门冉冉升起的新兴学科将拥有广阔的应用前景和研究价值,必将在未来各个科学领域大展宏图。
李卓[3](2017)在《人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定》文中研究表明肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是一种以发热、出血、急性肾功能损害为特征的急性传染病,通常由汉坦病毒(Hantaviruses,HTV)感染引起,在世界范围内广泛分布,中国是世界上发病人数最多的国家,而陕西省为我国HFRS的高发地区之一。长期以来,我国通过对重点疫区人群进行疫苗接种预防HFRS的发生,因此需要对HFRS疫苗的免疫效果进行定期评价。抗汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)抗体特别是中和抗体(neutralizing antibody,NAb)可直接与HTNV结合,参与机体对病毒的免疫清除。鼠源性抗体因为异源性反应很难应用于人体,目前很少有人源性抗体用于HFRS的紧急预防和治疗,因此,制备具有潜在中和活性的人源性抗体十分必要。本研究在评价了HFRS抗体检测试剂盒和疫苗接种者免疫接种效果的基础上,建立了疫苗接种者的B淋巴母细胞系(Blymphoblastoid cell lines,BLCLs)。将NAb阳性的疫苗接种者和HFRS患者的BLCLs抗体基因重组到噬菌体载体上,建立噬菌体Fab抗体库,筛选HTNV特异性抗体和中和活性抗体,经表达、纯化和鉴定获得了具有潜在中和活性的人源性抗HTNV Fab抗体,为HFRS的紧急预防、治疗以及疾病的诊断提供新的途径。为此,我们进行了以下实验:第一部分:HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化首先,基于HTNV抗体检测的需要,评价了国产与进口HFRS IgG抗体ELISA试剂盒的性能,结果表明国产试剂盒敏感性高,进口试剂盒特异性强。然后,采集疫苗接种者的血液标本,应用EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)转化技术建立了70株疫苗接种者BLCLs,检测了疫苗接种者的血清标本和BLCLs培养上清中HTNV特异性抗体,评价了咸阳地区HFRS疫苗接种的免疫效果。疫苗接种人群血清中HTNV核蛋白(nucleocapsid protein,NP)特异的IgM、IgG抗体以及HTNV NAb的水平和阳性率明显升高,三者具有较好的相关性;最强烈的抗体分泌反应发生在接种疫苗后3个月,与血清检测结果一致,表明针对HFRS的疫苗免疫接种计划在中国西北地区人群中可以有效地诱导体液免疫应答。最后,明确了NAb阳性的BLCLs(占44%)并对BLCLs进行了克隆化,NAb阳性的35株BLCLs(HFRS疫苗接种者与科室保存的患者BLCLs)为构建具有潜在中和活性的噬菌体抗体库提供基因资源;BLCLs的成功克隆化有望为单克隆抗体制备开辟新的途径。第二部分:抗HTNV噬菌体Fab抗体库的构建和筛选提取NAb阳性BLCLs的mRNA并合成cDNA,应用噬菌体展示技术建立了库容量为1.3×109的抗HTNV噬菌体Fab抗体库,Fab的阳性插入率为95%,抗体序列正确率为68%。以HTNV全抗原为靶分子,用固相筛选法经过4轮“吸附-洗脱-扩增”,对洗脱的噬菌体滴度进行测定,结果显示回收率明显增加。筛选前随机克隆测序正确率为68%,第4轮筛选后随机克隆测序正确率为81%;筛选前多样性为95%,第4轮筛选后多样性为31%。经Phage-ELISA检测,最终从第3、4轮筛选的50个克隆中选出了15个序列正确的特异性强的HTNV噬菌体Fab抗体。通过此部分实验,我们成功构建了抗HTNV噬菌体Fab抗体库并对其进行了筛选。第三部分:人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达和中和活性检测将第二部分筛选获得的特异性HTNV Fab噬菌体转染Ecoli.HB2151,诱导表达制备可溶性HTNV Fab抗体,并应用亲和层析法进行纯化。表达及纯化产物经还原电泳检测分析,发现在约25kDa处出现明显目的条带,与Fab的预期大小相符。间接ELISA表明这些可溶性HTNV Fab抗体均能与HTNV特异性结合。病毒中和实验结果显示3个Fab抗体具有中和活性。测序分析了15个Fab抗体轻链和重链可变区氨基酸序列,结果表明这些Fab抗体分属于6个抗体家族,大多数轻链和重链属于V3和V4家族,以IGKV3-20*01、IGHV4-59*01家族为主。同源性分析显示,3个具有中和活性的Fab抗体基因序列来自人胚系基因,未发现与其完全相同的抗体基因序列。第四部分:HTNV感染巨噬样人急性单核细胞白血病细胞系(differentiated THP-1,dTHP-1)诱导内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)反应HTV感染机体后可诱导强烈的免疫应答,但其致病机制尚未明确,我们从ER stress的角度,初步观测了HTNV感染对dTHP-1内质网应激的影响。检测结果显示HTNV感染dTHP-1细胞后,其内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白(78kDa glucose-regulated protein,GRP78)的mRNA和蛋白水平、X盒结合蛋白1(X box-binding protein 1,XBP-1)的mRNA水平均明显升高,表明HTNV感染可以诱导dTHP-1启动ER Stress。而在病毒感染后2h,C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的mRNA水平在病毒感染组与未感染组无明显差异;凋亡检测结果显示,HTNV感染dTHP-1 12h后细胞未发生明显凋亡;这些结果提示HTNV诱导的ER Stress在病毒感染早期(12h内)并未直接导致dTHP-1凋亡。
薛琴琴[4](2017)在《宫颈癌靶向多肽的进一步鉴定》文中指出背景:宫颈癌是全球第二大妇科肿瘤,发病率仅次于乳腺癌,且发病逐渐趋于年轻化。宫颈癌的病因较明确,同生活方式有密切关系,如早婚、早育、性生活过早或频繁、口服避孕药、抽烟、以及病原体感染等,其中,与宫颈癌发生关系最密切的是人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染。早期宫颈癌可通过手术治疗,晚期和复发性宫颈癌主要采用放化疗,但效果并不理想。对于晚期和复发性宫颈癌,有待开发一种低毒、有效的治疗方式,而宫颈癌分子靶向治疗为解决这一问题提供了新思路。靶向治疗的关键在于发现与肿瘤细胞及组织具有较高结合特异性和敏感性的靶向分子或分子片段,进而展开靶向分子探针及靶向分子导向的靶向抗肿瘤药物载体的开发。目前,噬菌体肽库技术是筛选肿瘤靶向分子最为有效的方法。它是将外源肽和噬菌体衣壳蛋白融合而展示于噬菌体,再通过“亲和、消减、富集”的生物淘筛(Biopanning)流程筛选与靶分子特异性结合的噬菌体克隆。从肽库中筛出的多肽有特异性强、分子质量小、组织穿透力大、易合成、免疫原性低、毒副作用小等优点,有望将其与放射性核素、荧光标记物等偶联作为分子探针,用于肿瘤的早期影像诊断,而最重要的是,可通过偶联抗癌药物、纳米颗粒、化疗药物载体如脂质体等用于肿瘤的靶向治疗,可以在大大提高化疗药物疗效的同时,明显降低其毒副作用,因而具有十分广阔、诱人的社会经济前景。我们前期以SiHa细胞为靶细胞,以本实验室改良的Biopanning程序成功的筛选到了靶向宫颈癌细胞的阳性12肽噬菌体克隆,为本研究奠定了基础。目的:本研究就是在前期筛选的阳性噬菌体克隆的基础上,多层次、多角度的鉴定其结合特异性,并获得最佳的阳性噬菌体克隆,据其展示肽序合成多肽分子探针,从细胞/组织水平上对该多肽探针的结合特异性/敏感性进行了研究,为进一步利用其研发宫颈癌靶向分子探针早期诊断试剂、靶向化疗药物递送载体体系奠定基础。方法:1.本研究前期利用噬菌体展示技术,以人宫颈癌细胞SiHa为靶细胞,以人胚肾细胞HEK293为阴性吸附细胞进行Biopanning,获得了 6个与宫颈癌细胞结合特异较好的阳性噬菌体克隆;2.通过细胞免疫荧光、免疫化学法、流式细胞仪等方法进行鉴定噬菌体克隆与SiHa细胞的结合特异性,并确定最佳的阳性噬菌体克隆;3.采用宫颈癌临床组织鉴定最佳噬菌体克隆的组织结合特异性;4.根据最佳噬菌体克隆肽序合成未标记的探针多肽、对照多肽和FITC标记的探针多肽、对照多肽;5.通过竞争抑制实验、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪检测多肽探针与SiHa细胞的结合特异性/敏感性;6.采用宫颈癌临床组织、组织芯片鉴定多肽分子的组织结合特异性/敏感性;7.对多肽分子探针进行定位分析;8.以MTT法检测多肽分子探针的细胞毒性;9.通过生物信息学方法预测分析多肽分子的理化性质及二级结构;10.预测可能与多肽分子探针相互作用的靶分子,并用AutoDock4.2.6软件进行分子对接。结果:1.通过细胞免疫荧光、细胞免疫化学及流式细胞仪鉴定,与SiHa细胞结合特异性最佳阳性噬菌体克隆为S7;2.组织免疫荧光结果显示S7克隆与宫颈癌组织有较好的结合特异性;3.未标记的探针多肽、对照多肽和FITC标记的探针多肽、对照多肽分别被合成,命名为 CSP3 Probe、Ctrl Probe 及 FITC-CSP3 Probe、FITC-Ctrl Probe;4.利用合成的各种多肽做的竞争抑制实验、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪检测结果显示CSP3 Probe与SiHa细胞有较好的结合特异性/敏感性;5.通过宫颈癌临床组织和组织芯片鉴定,CSP3 Probe与宫颈癌组织结合特异性/敏感性良好;6.CSP3 Probe结合位点位于细胞膜上;7.MTT检测结果显示CSP3 Probe对SiHa细胞没有毒性作用;8.经生物信息学分析,多肽CSP3是一个疏水性较弱的分子,二级结构为无规则卷曲;9.利用ScanProsite搜索到了一个可能与CSP3相互作用的分子ADF-H,分子对接结果显示ADF-H可能是CSP3的靶分子。结论:通过多层次、多角度的鉴定,均表明CSP3 Probe与宫颈癌细胞/组织有良好的结合特异性/敏感性,CSP3 Probe可偶联放射性同位素、纳米颗粒、抗癌药物、化疗药物载体如脂质体等用于宫颈癌的早期影像诊断和靶向治疗。
吴东明[5](2011)在《鲤春病毒血症病毒模拟抗原表位的初步筛选》文中认为鲤春病毒血症病毒病(Spring Viraemia of Carp, SVC),是鲤科鱼类的一种急性、出血性、传染性、高致死率的传染病,能感染四大家鱼和其他几种鲤科鱼类,经常在鲤科鱼类中流行,并导致患病鱼大量死亡,危害严重。所以我国农业部将SVC列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》(1992)中的二类动物疫病,同时国际动物卫生组织也将SVC列为必须申报的疫病。因SVCV多发生于春天气温升高时,由此得名。其病原微生物为鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus, SVCV,以下简称鲤春病毒)属于弹状病毒科,因其蛋白质谱与水疱性口炎病毒属(Vesiculovirus)成员的蛋白质谱相似,1994年被国际病毒学分类委员会(ICTV)划为水疱性口炎病毒属中的暂定成员,鲤春病毒血症病毒为单链、负股的RNA病毒;由5段基因编码5种结构蛋白,它们为核蛋白(简称N蛋白)、磷蛋白(简称蛋白P)、糖蛋白(简称G蛋白)、依赖的聚合酶(简称L蛋白)与基质蛋白(简称M蛋白)。本研究目的是从噬菌体肽库筛选鲤春病毒血症病毒的模拟抗原表位。首先制备亲和纯化的鲤春病毒兔抗血清IgG包被酶标板对12肽库进行反复淘选,对获得的目的噬菌体进行鉴定及抗原性分析,获得一批阳性噬菌体克隆,其中一部分与鲤春病毒血症病毒兔抗血清反应产生较高的吸光值,Western blotting分析表明这些噬菌体能被鲤春病毒血症病毒兔抗血清所识别,具有类似于鲤春病毒抗原的反应原性。从而获得一批具有模拟鲤春病毒血症病毒抗原表位的噬菌体克隆,为今后进一步研究它们在鲤春病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础。
李晓莉,姚慧,周登远,焦振山[6](2010)在《噬菌体展示抗体库技术的研究进展及临床应用》文中研究指明治疗性抗体的发展,主要经历了异源性抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段。目前,人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向,而噬菌体抗体库构建技术为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台。噬菌体展示抗体库构建技术,是一种将抗体组合文库与噬菌体表面展示技术相结合所形成的新技术,是20世纪90年代初期抗体工程领域的一项重大进展,目前广泛应用于生物医学的多个方面。将就此技术的原理、分类、筛选方法及主要应用领域等方面进行综述。
刘倩,赵玉军[7](2007)在《噬菌体展示技术研究进展》文中认为噬菌体表面展示技术是一种将外源蛋白或抗体可变区与噬菌体表面特定蛋白质融合并展示于其表面,构建蛋白质或抗体库,并从中筛选特异蛋白质或抗体的基因工程技术。介绍这一技术的原理、相关展示系统以及在蛋白质相互作用的研究,抗体及疫苗的制备、多肽药物的研制等方面的应用潜力和独特的优点。
田江克[8](2007)在《乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究》文中认为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病,可引起急、慢性病毒性肝炎,导致肝纤维化(LC),甚至肝细胞癌(HCC)。HBV感染致肝细胞损伤机制,很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此,研究HBV抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释,为寻找有效防治HBV的方法提供新线索。HBV基因组具有4个主要的开放读码框架(ORF),分别命名为S、C、P、X区,其中S区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域:前-S1,前-S2和S结构域,由此3个ATG开始编码产生3种大小不同的表面抗原蛋白:主蛋白(SHBs),中蛋白(MHBs.前-S2+S)和大蛋白(LHBs:前-S1+前-S2+S)。完整的MHBs多肽链是由55个aa的PreS2区和226个aa的S区组成的,研究表明,羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白(MHBst)具有反式调节功能,在HBV致病(癌)过程中发挥着重要的作用,但MHBst与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。为研究羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白的结合蛋白,本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型cDNA白细胞文库中与MHBst的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3,利用两种单倍体酵母a和α接合型可以配合形成二倍体,而其中表达的外源蛋白仍能相互作用,免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题,大大提高了杂交效率;在原技术基础上增加了3个报告基因,降低了假阳性率,保证实验结果的真阳性率达95%。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端167位aa截短的HBV表面抗原中蛋白的基因编码序列,经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体pGBKT7中构建“诱饵”质粒,转化酵母细胞AH109(a型)并在其内表达,Western-blotting验证。然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187(α型)进行配合。结果成功克隆出MHBst蛋白并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落10个。提取阳性酵母菌落的质粒,电穿孔法转化大肠杆菌,接种在氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,最后得到9种已知基因,ADP核糖基因子2个,RAB6相互作用蛋白1个,CCR4-NOT转录复合体亚基10(CCR4-NOT-10)1个,脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1个,醛缩酶B(ALDOB)1个,补体成分3(C3)1个,丙酮酸脱氢酶(PDH)1个,人类细菌人工染色体(BAC)1个。为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用,我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体pGADT7,在TNT网织红细胞裂解物体外翻译,掺入同位素35S,与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应,进一步证实LBP可以与MHBst特异性结合。本研究成功克隆出MHBst结合蛋白,为进一步研究其在HBV感染中的作用提供了新线索。
钟彦伟[9](2006)在《干扰素β调节分子机制研究》文中指出乙型、丙型病毒性肝炎严重危害我国人民健康。但是到目前为止还没有有效而可靠的抗病毒根治办法。虽然干扰素α(IFNα)有一定的抗病毒作用,但研究表明仅对30%~40%的病人有效。拉米夫定、阿德福韦酯等虽然有一定抗病毒效果,但长期使用易引起病毒耐药变异,限制了其广泛应用。因此,对IFNα或拉米夫定等治疗无效的患者仍需探索新的治疗途径。 近年来研究表明,干扰素β(IFNβ)与干扰素α一样,是一种具有多种生物学作用的重要细胞因子,虽然其与IFNα抗病毒作用机理相似,但IFNβ具有独特性,而这一独特性与IFNβ的抗病毒效果紧密相关。因而IFNβ在乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗中具有重要应用前景。近年来的临床资料表明,由于IFNβ不易产生抗体,可有效治疗干扰素α治疗无效的慢性乙型肝炎、丙型肝炎患者,而且在治疗慢性丙型肝炎导致的肝细胞癌方面IFNβ比IFNα有更好的抗肿瘤治疗效果。但是到目前为止,IFNβ对于机体的免疫调节和抗病毒、抗肝纤维化、抗肝细胞癌治疗的分子机制还不十分清楚。 本研究利用先进的分子生物学技术,研究肝细胞内影响IFNβ转录调节的因素、IFNβ对肝细胞内基因表达谱的影响以及与IFNβ具有相互作用的肝细胞结合蛋白。以期能从中发现某些有价值的线索,为阐明IFNβ独特的抗病毒功能提供重要的实验依据。 为探索IFNβ对肝细胞内基因表达谱的影响,我们首先以分子生物学技术构建了真核表达质粒pcDNA3.1(-)-IFNβ,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,转染HepG2细胞,并制备细胞裂解液。应用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建差异表达的cDNA消减文库,对阳性克隆进行测序和同源性分析,初步确定IFNβ真核表达质粒转染HepG2细胞后上调或下调的基因;同时应用不同浓度的重组IFNβ刺激对数生长期的HepG2细胞,以生理盐水处理的HepG2细胞为平行对照,制备细胞裂解液。提取总mRNA,逆转录为cDNA,进行SSH的2次杂交PCR扩增,筛选重组IFNβ作用肝细胞后差异表达的基因。抑制性消减杂交结果表明,共获得了25种上调表达的基因,其中包括
吴煜,成军,杨艳杰,刘妍,王春花,纪冬[10](2006)在《噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒X抗原基因启动子DNA结合蛋白》文中研究指明目的筛选乙型肝炎病毒(HBV)X抗原基因启动子(Xp)DNA结合蛋白,为HBV复制机制研究探索新的途径。方法应用噬菌体展示技术,以HBV-Xp的PCR产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果噬菌体经富集后,从随机筛选的30个克隆中得到17个阳性克隆,成功构建了克隆载体。经测序分析及序列比对,最后得到5种已知基因编码蛋白(人血白蛋白、还原型烟酰胺二核甘酸脱氢酶亚型4、激肽酶原、泛素特异性蛋白酶10、睾丸增强因子转录子)和9种未知功能基因序列。结论从噬菌体人肝cDNA文库筛选得到多种具有不同生物学功能的蛋白,与HBV X抗原基因启动子具有结合作用。
二、噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用(论文提纲范文)
(1)合成生物学在感染性疾病防治中的应用(论文提纲范文)
1 感染性疾病概述及其治疗瓶颈 |
2 合成生物学对抗感染性疾病的优势 |
3 合成生物学在感染性疾病诊断中的应用 |
4 合成生物学在细菌感染性疾病治疗中的应用 |
4.1 细菌感染性疾病与生物被膜 |
4.2 工程噬菌体在生物被膜治疗中的应用 |
4.3 工程细菌在生物被膜治疗中的应用 |
4.4 CRISPR技术在细菌感染性疾病治疗中的应用 |
5 合成生物学在病毒感染性疾病治疗中的应用 |
5.1 合成生物学在病毒感染性疾病致病机理研究中的应用 |
5.2 CRISPR技术在病毒感染性疾病治疗中的应用 |
6 合成生物学在感染性疾病预防中的应用 |
6.1 工程细菌在感染性疾病预防中的应用 |
6.2 合成生物学在疫苗研发中的应用 |
6.2.1 人工病毒在减毒疫苗构建中的应用 |
6.2.2 人工细菌在减毒疫苗构建中的应用 |
6.2.3 酵母改造在新型疫苗构建中的应用 |
6.3 合成生物学通过改造感染源限制疾病的传播 |
7 总结与展望 |
(2)基于DNA纳米技术与原子力显微镜高分辨成像的精准基因检测研究与应用(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
文中常用缩写中英文对照表 |
第一章 绪论 |
1.1 DNA纳米技术的发展过程 |
1.1.1 DNA拼块(Tile)自组装 |
1.1.2 DNA折纸术(origami)的诞生 |
1.2 DNA纳米技术在各个领域的应用 |
1.2.1 DNA-纳米粒子组合排布 |
1.2.2 可计算的DNA纳米技术——DNA分子逻辑门电路与分子计算机 |
1.2.3 DNA折纸基因芯片与遗传检测 |
1.2.4 DNA纳米孔通道与单分子检测 |
1.2.5 DNA自组装纳米材料应用于细胞载药 |
1.3 本章小结 |
1.4 本文的提出与研究内容 |
第二章 基于DNA折纸标记的单分子单倍型分型研究 |
2.1 引言 |
2.1.1 单核苷酸多态性与单倍型 |
2.1.2 纳米技术应用于单倍型分型的研究进展与现状 |
2.1.3 基于DNA折纸探针标记的单分子单倍型分型技术的研究思路 |
2.2 实验材料与实验方法 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 实验方法 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 预实验阶段:基于PhiX174 噬菌体DNA构建标记模型 |
2.3.2 三嵌段介导探针的设计以及纳米金辅助特异性延伸 |
2.3.3 多形态DNA折纸标记的设计与实验优化 |
2.3.4 可视化模拟单倍体分型:PhiX174 DNA的多位点高分辨率精准标记 |
2.3.5 单倍体精准分型:多位点折纸标记在人类基因组样品中的实际应用 |
2.4 本章小结与展望 |
第三章 基于DNA折纸标记的乙肝病毒基因型单分子检测 |
3.1 引言 |
3.1.1 传统的HBV检测方法 |
3.1.2 HBV的基因组与基因型分类 |
3.1.3 常用的HBV核酸检测与分析方法 |
3.1.4 基于DNA折纸标记的HBV基因型单分子检测方法的提出与研究策略 |
3.2 实验材料与实验方法 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验方法 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 引物设计和HBV目标模板ssDNA生成 |
3.3.2 三嵌段介导探针的设计和延伸 |
3.3.3 DNA折纸标签探针的制作 |
3.3.4 可视化HBV基因分型:DNA折纸标签的标记测试 |
3.3.5 临床样本诊断:HBV基因分型的特异性和灵敏度 |
3.4 本章的小结与展望 |
第四章 总结与展望 |
参考文献 |
附录:合成DNA折纸的短链序列 |
致谢 |
攻读博士期间已发表或录用的论文 |
(3)人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定(论文提纲范文)
缩略语表 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
文献回顾 |
1 汉坦病毒概述 |
2 汉坦病毒人工制备抗体研究进展 |
3 病毒感染与内质网应激 |
第一部分 HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化 |
实验一 国产与进口人HFRS IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能比较 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验二 利用EBV转化技术建立HFRS疫苗接种者BLCLs |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验三 中国西部地区人群HFRS疫苗接种后的抗体反应 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
第二部分 具有潜在中和活性的HTNV噬菌体抗体库的构建及筛选 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
第三部分 人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达及中和活性的检测 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
第四部分 HTNV感染巨噬样人急性单核白血病细胞(dTHP-1)诱导内质网应激(ER stress)反应的初步探讨 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
小结 |
参考文献 |
个人简历和研究成果 |
致谢 |
(4)宫颈癌靶向多肽的进一步鉴定(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略词一览表 |
第1章 绪论 |
1.1 宫颈癌的发生 |
1.2 宫颈癌的筛查与诊断 |
1.2.1 宫颈细胞学检查 |
1.2.2 HPV检测 |
1.2.3 肉眼观察 |
1.2.4 阴道镜检查 |
1.2.5 病理学检查 |
1.2.6 分子标志物检测 |
1.3 宫颈癌的治疗 |
1.3.1 手术治疗 |
1.3.2 放射治疗 |
1.3.3 化学治疗 |
1.3.4 同步放化疗 |
1.3.5 靶向治疗 |
1.4 噬菌体展示技术 |
1.4.1 噬菌体展示技术的原理 |
1.4.2 噬菌体展示系统 |
1.4.3 噬菌体展示技术的应用 |
1.5 靶向多肽在肿瘤研究中的应用 |
1.5.1 靶向多肽与肿瘤标志物 |
1.5.2 靶向多肽用于分子影像诊断 |
1.5.3 靶向多肽用于肿瘤治疗 |
第2章 本课题的立论依据、研究内容及技术路线 |
课题技术路线 |
第3章 宫颈癌特异性结合阳性噬菌体克隆的鉴定 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 细胞系、宿主菌及噬菌体克隆 |
3.1.2 主要仪器及试剂配制 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 宿主菌E.coli ER2738的活化 |
3.2.2 噬菌体扩增 |
3.2.3 噬菌体滴定 |
3.2.4 细胞培养 |
3.2.5 细胞免疫荧光 |
3.2.6 流式细胞术 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 噬菌体克隆的滴定结果 |
3.3.2 噬菌体克隆特异性的细胞免疫荧光鉴定 |
3.3.3 噬菌体克隆特异性的流式细胞仪鉴定 |
3.3.4 噬菌体克隆特异性的细胞免疫化学鉴定 |
3.3.5 噬菌体克隆与其它肿瘤细胞结合特异性的鉴定 |
3.4 讨论 |
第4章 噬菌体克隆S7与宫颈癌组织的结合特异性研究 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 组织及噬菌体 |
4.1.2 主要仪器及试剂配制 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 载玻片的处理 |
4.2.2 宫颈癌组织冰冻切片的制作 |
4.2.3 组织HE染色 |
4.2.4 组织免疫荧光 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 HE染色 |
4.3.2 噬菌体S7与宫颈癌组织的结合特异性 |
4.4 讨论 |
第5章 多肽探针与宫颈癌细胞的结合特异性研究 |
5.1 实验材料 |
5.1.1 细胞系 |
5.1.2 主要仪器及试剂配制 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 多肽分子探针的合成 |
5.2.2 多肽分子探针与噬菌体的竞争抑制 |
5.2.3 多肽分子探针的剂量效应 |
5.2.4 多肽分子探针的时间效应 |
5.2.5 多肽分子探针与SiHa细胞的结合特异性 |
5.2.6 多肽分子探针与其它肿瘤细胞的结合特异性 |
5.2.7 流式细胞术检测多肽分子探针的结合特异性 |
5.3 实验结果 |
5.3.1 多肽分子探针CSP3的合成 |
5.3.2 CSP3 Probe对噬菌体的竞争抑制 |
5.3.3 CSP3 Probe的剂量效应 |
5.3.4 CSP3 Probe的时间效应 |
5.3.5 CSP3 Probe与SiHa细胞的结合特异性 |
5.3.6 CSP3 Probe与其它肿瘤细胞的结合特异性 |
5.3.7 流式细胞仪检测CSP3 Probe的结合特异性 |
5.4 讨论 |
第6章 多肽分子探针与宫颈癌组织的结合特异性研究 |
6.1 实验材料 |
6.1.1 组织及多肽探针 |
6.1.2 主要仪器及试剂配制 |
6.2 实验方法 |
6.2.1 CSP3 Probe与宫颈癌临床组织的结合特异性 |
6.2.2 CSP3 Probe与宫颈癌组织芯片的结合特异性 |
6.3 实验结果 |
6.3.1 CSP3 Probe与宫颈癌临床组织的结合特异性 |
6.3.2 CSP3 Probe与其它肿瘤组织的结合特异性 |
6.3.3 CSP3 Probe与宫颈癌组织芯片的结合特异性 |
6.4 讨论 |
第7章 宫颈癌多肽分子探针的定位分析及功能研究 |
7.1 实验材料 |
7.1.1 细胞系及多肽探针 |
7.1.2 主要仪器及试剂配制 |
7.2 实验方法 |
7.2.1 CSP3 Probe的定位分析 |
7.2.2 MTT检测CSP3 Probe的细胞毒性 |
7.3 实验结果 |
7.3.1 CSP3 Probe的细胞膜定位 |
7.3.2 CSP3 Probe对SiHa细胞的毒性影响 |
7.4 讨论 |
第8章 多肽分子探针的生物信息学分析及靶分子预测 |
8.1 实验材料 |
8.2 实验方法 |
8.2.1 CSP3 Probe的序列分析 |
8.2.2 CSP3 Probe的靶分子预测分析 |
8.2.3 CSP3 Probe与靶分子的分子对接 |
8.3 实验结果 |
8.3.1 序列分析 |
8.3.2 CSP3 Probe的靶分子预测 |
8.3.3 CSP3 Probe与ADF-H的分子对接 |
8.4 讨论 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间的科研成果 |
(5)鲤春病毒血症病毒模拟抗原表位的初步筛选(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
1. 鲤春病毒血症病毒的概况 |
1.1 易感动物 |
1.2 传播途径 |
1.3 流行情况 |
1.4 病毒分类 |
1.5 病毒特性 |
1.6 临诊症状 |
1.7 国内外研究现状 |
2. 噬菌体展示技术 |
2.1 噬菌体的基本特征 |
2.2 噬菌体展示技术的原理 |
2.3 筛选技术 |
2.4 噬菌体展示系统 |
3. 噬菌体展示技术的应用 |
3.1 在新型疫苗研发方面的作用 |
3.2 在酶抑制剂筛选中的应用 |
3.3 在抗体工程中的应用 |
3.4 在多肽药物开发中的应用 |
3.5 在疾病诊断和治疗中的应用 |
3.6 在蛋白质相互作用研究中的应用 |
4. 前景与展望 |
鲤春病毒血症病毒模拟抗原表位的初步筛选 |
1. 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.1.1 细胞、毒种和实验动物 |
1.1.2 主要试剂及耗材 |
1.1.3 实验仪器 |
1.1.4 所用溶液及其配置 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 病毒的制备与纯化 |
1.2.2 多克隆抗体的制备与纯化 |
1.2.3 抗原表位的筛选 |
2. 结果 |
2.1 SVCV的繁殖 |
2.2 病毒的含量测定 |
2.2.1 病毒的蔗糖密度梯度离心结果 |
2.2.2 SVCV的TCID_(50)测定 |
2.2.3 RT-PCR检测SVCV |
2.3 兔抗阳性血清的滴度 |
2.4 肽库筛选的效率 |
2.5 筛选噬菌体的ELISA鉴定 |
2.6 免疫原性分析 |
3. 讨论 |
3.1 关于细胞培养与SVCV繁殖的讨论 |
3.2 病毒纯化的讨论 |
3.3 噬菌体ELISA鉴定的讨论 |
3.4 Western-blot分析的讨论 |
3.5 实验过程中遇到的困难 |
4. 结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(7)噬菌体展示技术研究进展(论文提纲范文)
1 噬菌体展示技术的原理概述 |
1.1 原理 |
1.2 丝状噬菌体系统 |
1.3 λ噬菌体系统 |
1.4 T4噬菌体展示系统 |
1.5 T7噬菌体展示技术 |
2 噬菌体展示技术的应用 |
2.1 蛋白质间相互作用研究 |
2.2 抗体和疫苗的制备 |
2.3 疾病的诊断与治疗 |
2.4 新型配体, 受体与短肽药物的筛选 |
3 结 语 |
(8)乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
引言 |
仪器设备 |
第一部分 |
前言 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
第二部分 |
前言 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
第三部分 |
前言 |
1 己知基因的克隆化鉴定 |
2 体外翻译 |
3 体外免疫共沉淀 |
4 讨论 |
全文结论 |
参考文献 |
附录 |
综述一 |
综述二 |
论着 |
致谢 |
(9)干扰素β调节分子机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
正文 |
第一部分 抑制性消减杂交技术研究干扰素β对HepG2细胞基因表达谱的影响 |
引言 |
第一章 抑制性消减杂交技术筛选IFNβ真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达基因 |
第二章 抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ作用HepG2细胞后差异表达基因 |
讨论 |
第二部分 基因芯片技术筛选干扰素β调节基因 |
引言 |
第一章 基因芯片技术筛选IFNβ真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达基因 |
第二章 基因芯片技术筛选重组干扰素β作用HepG2细胞后差异表达基因 |
讨论 |
第三部分 噬菌体展示技术筛选干扰素β启动子DNA结合蛋白 |
引言 |
讨论 |
第四部分 干扰素β与肝细胞蛋白之间相互作用的研究 |
引言 |
第一章 IFNβ酵母“饵”载体的构建及在酵母细胞中表达研究 |
第二章 酵母双杂交实验筛选与IFNβ具有相互作用的肝细胞蛋白基因 |
讨论 |
总结及展望 |
文献综述 |
附录一 主要仪器设备 |
附录二 英文缩略词 |
攻读博士学位期间发表和撰写的文章 |
致谢 |
(10)噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒X抗原基因启动子DNA结合蛋白(论文提纲范文)
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 HBV-X抗原基因启动子 (HBV-Xp) 的扩增 |
1.3 文库扩增 |
1.4 筛选 |
1.5 噬斑的PCR扩增 |
1.6 克隆载体的构建和鉴定 |
1.7 序列测定及同源性搜索 |
2 结 果 |
2.1 肝细胞cDNA文库的筛选 |
2.2 目的基因的PCR扩增 |
2.3 目的基因克隆的酶切鉴定 |
2.4 序列比对和同源性分析 |
3 讨 论 |
四、噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用(论文参考文献)
- [1]合成生物学在感染性疾病防治中的应用[J]. 蒲璐,黄亚佳,杨帅,金帆. 合成生物学, 2020(02)
- [2]基于DNA纳米技术与原子力显微镜高分辨成像的精准基因检测研究与应用[D]. 刘轲. 上海交通大学, 2018(01)
- [3]人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓. 第四军医大学, 2017(05)
- [4]宫颈癌靶向多肽的进一步鉴定[D]. 薛琴琴. 陕西师范大学, 2017(07)
- [5]鲤春病毒血症病毒模拟抗原表位的初步筛选[D]. 吴东明. 吉林农业大学, 2011(10)
- [6]噬菌体展示抗体库技术的研究进展及临床应用[J]. 李晓莉,姚慧,周登远,焦振山. 国际生物医学工程杂志, 2010(01)
- [7]噬菌体展示技术研究进展[J]. 刘倩,赵玉军. 微生物学杂志, 2007(06)
- [8]乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究[D]. 田江克. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
- [9]干扰素β调节分子机制研究[D]. 钟彦伟. 中国人民解放军军医进修学院, 2006(09)
- [10]噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒X抗原基因启动子DNA结合蛋白[J]. 吴煜,成军,杨艳杰,刘妍,王春花,纪冬. 解放军医学杂志, 2006(04)