一、蛇毒磷脂酶A_2的研究（论文文献综述）
陈俊[1]（2021）在《717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究》文中指出1目的1.1观察717解毒合剂对蝮蛇咬伤患者的临床疗效,对蝮蛇伤患者血生化值如心肌酶谱（CK、CK-MB）,肝功能指标（AST、ALT）,肾功能指标（BUN、CREA）,血常规（WBC、CRP）,凝血功能（APTT、PT）,炎症介质（TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine）等值进行检测,探求717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的作用机制。1.2蛋白组学观察蝮蛇伤大鼠创面组织差异蛋白表达:收集各组大鼠腓肠肌创面组织,采用基于双向电泳（2-DE）-基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）蛋白质组学分析方法,对比分析正常大鼠与蝮蛇上大鼠创面蛋白差异表达情况。1.3动物实验观察蝮蛇毒对大鼠致毒效应以及717解毒合剂的治疗作用;屏障环境下,从脏器系数、生化指标、炎症因子水平等方面,观察蝮蛇毒对大鼠的致毒效应。并从NF-κB和MAPK信号通路研究717解毒合剂抗蝮蛇毒治疗蛇伤机制。2方法2.1临床观察:从2018年9月至2020年11月间在江西省中医院外一科住院部就诊的患者中择取150例符合临床试验条件的病患,随机分为治疗组及对照组,每组各分配75例病患。对照组予西医常规治疗,治疗组在此治疗基础上,每日另口服1剂717解毒合剂,分2次（早、晚饭后）温服。详细记录两组患者治疗7天内的病情表现、生化仪检测相关生化指标、ELISA检测TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine数值,具体内容为:2.1.1临床疗效;2.1.2两组患者病情程度与临床疗效比较;2.1.3肿胀、疼痛、瘀斑消退时间及治愈时间;2.1.4治疗前后局部症状、全身体征积分及总积分;2.1.5治疗前、治疗后1天、治疗后3天、治疗后7天总积分;2.1.6治疗前后心肌酶谱、肝功能指标、肾功能指标检测2.1.7两组患者治疗前后相关因子表达水平。2.2动物实验2.2.1实验一:将16只SPF级SD大鼠随机、对半分成两组,雌雄各半,取蝮蛇毒皮下注射于大鼠左下肢制成蛇伤模型,2h后取2种疮面肌肉进行蛋白质分析,2D-DIGE双向电泳,MALDI-TOF-MS质谱分析,观察大鼠蛋白表达情况,采用软件Mascot distiller过滤基线峰、识别信号峰。应用Mascot软件搜索NCBI数据库,寻找匹配的相关蛋白质,同时查询其功能,来明确鉴定的差异蛋白质为何种蛋白质。2.2.2实验二:52只SPF级SD大鼠（雌雄各半）分为正常组和蝮蛇毒组,蝮蛇毒组再分为2h、4h、12h、24h、36h、72h共计六组,于大鼠左后肢注射蝮蛇毒造模,分别于2h、4h、12h、24h、36h、72h麻醉模型大鼠并取心、肝、脾、肺、肾组织及动脉血。观察:（1）大鼠注射蛇毒后一般反应;（2）生化仪检测血清CK、CK-MB、LDH、AST、ALT、GLDH、ALP、UREA、CREA、UA等数值;（3）观察脏器病理学改变。2.2.3实验三:72只SPF级SD大鼠（雌雄各半）随机分为正常对照组、模型对照组、蛇毒血清组、低剂量药物组、中剂量药物组、高剂量药物组,共计6组。左下肢注射蝮蛇毒,2小时后给予治疗,蛇毒组尾静脉注射抗蛇毒血清0.6mL/只,717解毒合剂组按5、20、50mL/kg.d剂量灌胃,共灌6天。20只KM小鼠随机、对半分成2组,雌雄各半,按10mL/kg.d剂量灌胃,共灌3天。SD大鼠各组分别于注射蝮蛇毒后2h、治疗后72h、治疗第6天腹腔麻醉后腹主动脉取血、取肝脏组织。观察:2.2.3.1观察大鼠一般情况,蝮蛇毒小鼠腹膜情况,镜下大鼠肝脏组织结构;2.2.3.2 ELISA法检测三次取血所得血清中TNF-α、NF-κB含量,第6天所取血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、NF-κB、CRP、INF-β因子表达水平;RT-PCR法检测IκBαmRNA、p38MAPK mRNA表达水平,Western blot检测iNOS、COX-2蛋白表达,免疫组化法检测各组织中NF-кB P50、NF-кB P65表达。3结果3.1临床研究3.1.1治疗组、对照组总有效率分别为90.41%、76.39%,两组患者在临床疗效方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.2治疗组62例轻、中度患者,治愈17例、显效25例、有效16例、无效4例;11例重度患者,治愈5例、显效2例、有效1例、无效3例。对照组65例轻、中度患者,治愈8例、显效20例、有效22例、无效15例;7例重度患者,治愈4例、显效1例、无效2例。两组在轻、中度患者的临床疗效上差异不显着（P>0.05）,在重度患者的临床疗效方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.3治疗组患者平均肿胀、疼痛、瘀斑消退时间4.48±0.87天、4.95±0.57天、7.43±1.42天,平均住院时间4.98±1.17天;对照组患者平均肿胀、疼痛、瘀斑消退时间5.75±1.01天、6.50±0.86天、8.52±1.44天,平均住院时间6.46±1.45天。两组患者在肿胀、疼痛、瘀斑消退及疾病治愈时间方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.4治疗后治疗组患者局部症状积分、全身体征积分、总积分具体为1.48±0.87、1.94±1.15、2.44±1.44;对照组分别为2.46±0.86、2.95±1.15、4.20±1.30,组间差异显着（P<0.01）,具有统计学意义;3.1.5 717解毒合剂能有效治疗蝮蛇咬伤患者,治疗后两组患者积分均下降,第3天、第7天积分下降明显（P<0.01）,比较有统计学意义;3.1.6两组患者治疗前后CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN、Cr值比较差异显着（P<0.05）,有统计学意义;3.1.7两组患者治疗后的WBC、CRP、APTT、PT、TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine数值均下降,治疗前后有统计学意义。3.2动物实验3.2.1实验一蝮蛇伤模型大鼠较正常大鼠蛋白表达升高斑点为160个,降低的斑点为141个,其中蝮蛇伤四个斑点鉴定蛋白主要含有Myosin-4,Alpha-1B-glycoprotein两种蛋白,初步验证了蛋白组学技术应用于蛇伤早期鉴别诊断标志物筛选的可行性。3.2.2实验二3.2.2.1创面2h后出现中毒现象,4h水肿明显,12h组织液渗出,36h出现自愈趋势,72h开始结痂;3.2.2.2在无菌环境中,蝮蛇毒大鼠脏器或增大或减小,36h后各脏器均有恢复趋势;3.2.2.3治疗后,各组TP、ALB值均降低,GLOB先减小后增大,ALT、AST、ALP、CK、LDH、UREA、CREA、UA值先升高后降低,各指标均有后期恢复趋势;3.2.2.4心肌细胞、肝细胞、肾脏组织4h出现较明显损伤、见炎性浸润,72h出现组织溶解、坏死现象。肺组织后期见轻微肺泡间增宽现象,少见炎细胞浸润。3.2.3实验三3.2.3.1血清组及717解毒合剂中、高剂量组大鼠皮毛光润,精神状态良好,饮食、活动均趋于正常,创面愈合程度高;模型组大鼠皮毛较松散,精神状况不佳,饮食、活动量较少,反应迟钝。造模4小时后小鼠腹部皮下见紫黑色弥漫性出血,72小时症状减轻,中药组减轻更明显。3.2.3.2正常大鼠肝小叶肝细胞排列整齐呈多角形,模型组肝小叶结构稍紊乱,肝细胞体积增大,胞浆染色淡、胞内空泡化,有明显炎细胞浸润,点状坏死灶,717解毒合剂能减轻肝细胞肿胀程度,以高剂量组效果最明显,肝索排列较为整齐,组织结构趋向正常。3.2.3.3蝮蛇伤大鼠血清中TNF-α、NF-κB、IL-2、IL-4、IL-6、CRP、INF-β表达升高;肝组织中COX-2、i NOS、p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、P-STAT3、IκBαmRNA,NF-κB,NF-κB P50蛋白表达升高,p38MAPK mRNA、IκBα蛋白表达下调,717解毒合剂能起到有效的逆向调节作用。4结论4.1 717解毒合剂能有效治疗蝮蛇咬伤患者,减少肿胀、疼痛、瘀斑消退及疾病治愈时间,降低局部症状、全身体征积分及总积分;4.2 CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN、Cr,TNF-α、NF-κB、IL-6、p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、P-STAT3、IκBαmRNA、NF-κB P50等可作为蝮蛇咬伤程度及疗效评价指标;4.3 717解毒合剂通过调控NF-ΚB与MAPK信号通路起到抗蝮蛇毒活性,对主要炎症因子具有抑制作用,在治疗后期更具有抗炎活性及免疫调节作用,也为临床研究提供了实验依据。
王萍,李恒,和七一,胡先成,熊艳,彭建军,余晓东[2]（2019）在《中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中主要酶类活性的抑制作用》文中提出【目的】探究中华眼镜蛇（Naja atra）血清对自身蛇毒中主要酶类活性的抑制作用。【方法】不同稀释倍数的中华眼镜蛇血清与蛇毒于37℃孵育30min后,检测蛇毒中磷脂酶A2、透明质酸酶、乙酰胆碱酯酶、L-氨基酸氧化酶和5′-核苷酸酶活性的变化情况。【结果】中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中磷脂酶A2和5′-核苷酸酶具有明显的抑制作用:当血清稀释2倍时,可以使蛇毒磷脂酶A2活性降低28.44%（p<0.001）;当血清稀释8倍时,可以使蛇毒中5′-核苷酸酶活性活性降低23.44%（p<0.001）。中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中的透明质酸酶、乙酰胆碱酯酶和L-氨基酸氧化酶均无抑制作用。【结论】中华眼镜蛇血清中存在蛇毒磷脂酶A2和5′-核苷酸酶的抑制剂,该结果为后期蛇毒抑制剂的筛选提供了理论依据。
李进红[3]（2019）在《磷脂酶A1和C的固定化及其在联合脱胶中的应用》文中研究指明磷脂有很好的乳化、分散作用,并能促进体内脂肪代谢、肌肉生长、神经系统发育和体内抗氧化损伤。但残留于植物油脂中,它会使油脂变得不稳定,促使酸败加剧,颜色加深,增加过滤和操作的难度,造成设备结焦、增加脱色脱酸负担等问题。酶法脱胶具有减少水的使用量,提高产油率,绿色无毒害等优点。将磷脂酶固定在合适的载体上,不仅能增加酶的稳定性,还可以实现磷脂酶的回收再利用。本文选择将磷脂酶C固定到大孔树脂上,磷脂酶A1固定到磁性Fe3O4纳米粒子上;并将固定化磷脂酶A1和固定化磷脂酶C进行单一及联合油脂脱胶应用。通过考察脱胶油含磷量和得油率对不同脱胶工艺进行比较分析获得研究结果如下。（1）以固定化磷脂酶的酶活力和蛋白吸附率为考察指标,从001×10、001×7、D345等几种大孔树脂中筛选出弱碱性阴离子交换树脂D345为较优固定化载体。经单因素实验和正交实验,得到固定化磷脂酶C的最适制备条件为:加酶量6.0 mL pH 5.5,时间6.0 h,戊二醛浓度1.0%,温度30℃。制备的固定化酶酶活力可达1832U/g,酶蛋白吸附率为78.7%;固定化磷脂酶C较适反应温度50℃,pH 6.5,热稳定性和pH稳定性均在一定程度上提高,在4℃冰箱中保存40 d剩余67.0%的酶活力。（2）将Fe3O4纳米粒子与TEOS（硅酸四乙酯）反应制备Fe3O4-SiO2磁性载体,然后再将载体与3-APTES（3-氨基丙基三乙氧基硅烷）反应制备氨基化Fe3O4-SiO2,最后用戊二醛将Fe3O4-SiO2磁性复合载体进行交联,最终制备得到改性Fe3O4-SiO2载体,以酶活回收率和蛋白固载率为考察指标,获得最佳固定化的条件为:加酶量8.0mL/50mg载体、温度30℃,pH 6.0,时间8.0 h,戊二醛浓度8.0%,此条件下制得磁性固定化PLA1酶的酶活回收率达到63.3%,蛋白固载率为68.0%。（3）通过扫描电子显微镜分析,可以观察到Fe3O4磁性纳米粒子基本形貌为球状,具有良好的分散性,团聚较少,其平均粒径在15 nm左右。Fe3O4-SiO2磁性复合载体的粒径较为均一,表面平滑,呈球状,各载体间分散性良好,载体的平均粒径为200 nm左右。通过透射电子显微镜分析,可以看出Fe3O4纳米颗粒的固定化载体呈核壳形,中间黑色的实心为Fe3O4纳米颗粒,载体周围呈现出均匀的灰色薄层为SiO2层。通过傅立叶红外光谱分析,表明磷脂酶成功的固定到了磁性载体上,通过X射线衍射,可以看出固定化载体材料中反尖晶石型晶体结构为磁性Fe3O4的晶面。（4）以含磷量为指标,优化固定化磷脂酶C和固定化磷脂酶A1的较适油脂脱胶条件,对于固定化磷脂酶C较适脱胶条件为:酶添加量1.2 g/kg、时间4.0 h、温度55℃、pH 6.5。对于固定化磷脂酶A1较适脱胶条件为:酶添加量0.6 g/kg,时间2.0 h、温度60℃、pH 5.5。研究表明,对不同来源和不同含磷量的毛油,固定化磷脂酶A1脱胶均能有效降低毛油中的含磷量,固定化磷脂酶C能提高中性油的得油率,但脱胶油中含磷量尚未达到物理精炼要求（<10 mg/kg）;而采用固定化磷脂酶C和固定化磷脂酶A1联合脱胶,可以充分发挥两者的优势,在有效降低脱胶中含磷量的同时,还能提高产油率,提高经济效益。
郭倩[4]（2014）在《中介蝮蛇毒PLA2神经毒素Gintexin的神经肌肉效应研究》文中研究指明中介蝮（Gloydius intermedius）为蝰科蝮亚科毒蛇,广泛分布于我国西北和华北地区,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种蝮蛇。蛇毒磷脂酶A2（Snake venom phospholipase A2, svPLA2）是蛇毒液中毒性最强的组分之一,除酶活性外,还表现出多种毒理药理学活性,具有潜在的利用价值。但是,关于中介蝮蛇毒PLA2神经毒素的结构与功能的关系、作用机理等有待阐明,本研究分离了其主要神经毒素,并在此基础上对其神经-肌肉的阻断效应进行了初步探究。本论文的研究内容1.中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化（1）凝胶过滤层析利用凝胶过滤填料Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行初步分离,缓冲液为50mM碳酸氢铵（pH8.0）,流速0.3mL/min,收集5个峰（P1-P5）,12%SDS-PAGE检测纯度,并测定其PLA2酶活性及小鼠致死效应。（2）反相高效液相和质谱分析利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离凝胶过滤层析得到的P3组分,对有PLA2活性的组分做质谱分析,将其序列与中介蝮毒腺cDNA文库中PLA2基因编码的氨基酸序列对应起来,进行生物信息学分析。2. Gintexin对神经肌肉接头的效应（1）神经肌肉接头的阻断效应分别取大鼠膈神经膈肌标本和小鸡颈二腹肌标本,固定于浴槽中,给0.5g预张力神经刺激（6V、0.9Hz、0.2ms）至少平衡15min,分别用40mM KCl和55μMACh检测标本性能是否良好,随后加入不同终浓度的Gintexin（2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL）,待收缩完全抑制后再分别加40mM KCl和ACh观察标本的肌肉完整性和突触后膜上乙酰胆碱受体是否收到影响,并记录肌肉收缩张力。（2）免疫组化对作用位点的确定将神经肌肉接头阻断效应实验中使用的大鼠膈神经膈肌标本和小鸡颈二腹肌标本置于10%甲醛溶液中固定24h,经常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、连续切片（厚度3μm）,为白片,随后进行脱蜡、内源性HRP灭活、抗原修复、血清封闭、一抗4℃过夜（兔抗PLA2、SNAP25,分别用PBS缓冲液1：1000及1：100稀释）,次日,加HRP标记二抗,DAB显色,核复染,观察PLA2。3.肌肉损伤效应（1）组织化学将上述神经-肌肉标本切片脱蜡,分别进行HE染色和Masson染色,观察肌细胞和结缔组织的损伤情况。（2）肌酸激酶的测定将体重18-20g的昆明小鼠分组,分别在小鼠腓肠肌注射粗毒（8μg在50μL生理盐水中）和Gintexin（1.5μg在50μL生理盐水中）,另取3只昆明小鼠注射50gL等量生理盐水作为对照；在不同时间点（1h、3h、6h、9h、12h、24h）用摘眼球的方式取血,随后10000rpm离心10min,取上清即为血清样品,采用全自动生化分析仪进行肌酸激酶的测定；分析结果。研究结果：（1）凝胶过滤层析从中介蝮粗毒中共分5个蛋白峰（P1-P5）,P3组分具有PLA2酶活性最高,并有小鼠致死毒性。（2）用RP-HPLC分析发现：P3组分含有多种PLA2组分,将其氨基酸序列与中介蝮PLA2基因（86个克隆）cDNA编码的氨基酸序列对照发现,P3主要组分是Gintexin-A、Gintexin-B、Gin-E6b及少量的Gin-E6a,且Gintexin-A、Gintexin-B含量最多,可以达到65%。质谱结果表明,Gintexin-A分子量为9847Da, GintexinB分子量为14177Da,Gin-E6b分子量为13662Da,Gin-E6a为14074Da。氨基酸序列比对后可以判断出Gintexin同响尾蛇毒素Crotoxin-样,是由Gintexin-A和Gintexin-B通过非共价键结合的异型二聚体,所以可以用P3组分来研究Gintexin的毒理作用。（3）大鼠膈神经-膈肌和小鸡颈二腹肌的离体实验证明,小鸡颈二腹肌标本对Gintexin更加敏感,终浓度2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL的Gintexin完全阻断小鸡颈二腹肌标本神经传导的时间分别是49±0.8min（n=3）,40±0.7min（n=3）、30±0.8min（n=3）,但对突触后膜乙酰胆碱受体并没有影响。（4）免疫组化结果显示,Gintexin作用位点并非是神经纤维,而是神经肌肉接头处,由此可以判断,本研究分离的毒素作用的具体部位是神经突触,与离体实验的结果相结合可以确定,该毒素为突触前神经毒素。（5）通过组织化学的HE染色、Masson染色结果表明,肌细胞出现了一定的损伤效应,而且损伤作用比粗毒弱,而对肌细胞外及神经元外的结缔组织没有影响。（6）测定粗毒（8μg）和Gintexin（1.5μg）后不同时间点的血清CK活性,结果表明粗毒在注射3小时后CK活性最高,Gintexin组在3～6小时时CK活性都很高。结论：采用凝胶过滤层析和反相高效液相（RP-PHLC）技术,成功地从中介蝮蛇粗毒中分离纯化得到磷脂酶A2神经毒素,主要组分是由Gintexin-A和Gintexin-B构成的一种异二聚体复合物Gintexin,属于一种突触前神经毒素,具有一定的肌肉毒性。本工作为进一步研究中介蝮磷脂酶A2神经毒素的分子进化及作用机理奠定了理论基础。
张慧[5]（2013）在《乌苏里蝮蛇磷脂酶A2的分离、纯化及性质测定》文中研究说明蛇毒被誉为是自然界最集中的酶、活性蛋白质的来源之一，其蛋白质大多数是由具有各种催化活性的酶类组成的，目前已经发现近40种酶，许多酶已经得到了分离和纯化，这些酶，无论在生物化学研究还是在临床应用等实践中，都具有非常重要的意义。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一种重要的代谢和调节酶类，广泛分布于蛇毒、蜂毒和哺乳动物的组织中，它能够水解甘油磷脂的第二位酯酰键（Sn-2），将磷脂（磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等）水解生成溶血磷脂和游离脂肪酸[1-3]，在调节细胞内和细胞外的代谢中起着关键性的作用。根据存在的部位、氨基酸序列同源性和生化功能的特征，将PLA2超家族一般分为五种类型：分泌型（sPLA2）、胞质型（cPLA2）、非Ca2+依赖型（iPLA2）、血小板激活因子型（PAF-PLA2）、溶酶体型[4-9]。蛇毒中的PLA2具有广泛的药理学活性，由于各种蛇毒磷脂酶A2基因编码序列、蛋白表达调控机制不同，结构及生物学特性各异，可引起极为广泛的生理学效应，如神经毒性、肌肉毒性、心脏毒性、抗凝效应、促进或抑制血小板聚集、溶血活性、促水肿活性和引起惊厥等[10-15]。其中神经毒性和肌肉毒性是两种最主要的效应[16]。根据酸碱性，蛇毒PLA2可分为酸性、中性和碱性3类[17,18]。近年来，国内外有很多关于从具窍蝮蛇[19-21]、丛林巴西蝮蛇[22,23]、响尾蛇[24]、短尾蝮蛇[25]、尖吻蝮蛇[26]、竹叶青蛇、五步蛇[27]、眼镜王蛇[28]等蛇毒中分离出PLA2的报道，并进行了大量相关的生物学活性研究，已有280多种蛇毒PLA2的氨基酸序列被确定。对PLA2的分离纯化主要采用凝胶过滤，离子交换，高效液相等方法。如Julián Fernández[9]等利用CM-Sephadex C-25层析柱、DEAE-Sepharose层析柱、高效液相色谱RP-HPLC C8从具窍蝮蛇中获得一种分子量为14.2kD、PI为4.9的PLA2；Fuly AL等[23]利用丙烯葡聚糖凝胶Sephacryl S-200HR、C2∕C18反相色谱柱从丛林巴西蝮蛇中纯化出分子量为18kD、PI为5.4的PLA2；张维文等[28]采用CM-Sephadex C-25、Sephadex G-75、DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-75多步柱层析法从广东眼镜王蛇毒中得到一种分子量为14kD、pI=3.8的酸性PLA2；罗艳萍等[25]采用CM-Sephadex C-25、DEAE-Sepharose CL-6B、Sephacryl S-200、Sephadex G-75柱层析法从短尾腹蛇中得到分子量为17.6kD的PLA2；潘剑茹等[29]通过嗜硫色谱Sephadex G-75、Blue胶和POROS HQ20离子交换色谱，从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到分子量为14.4kD的酸性PLA2单体，PI为5.66；黄立峰[3]运用一系列色谱层析分离方法Sephadex G-50和SephadexG-150凝胶过滤色谱、CM-Sepharose FastFlow离子交换层析色谱及POROS CM4.6/100预装柱色谱层析从舟山眼镜蛇粗毒中分离获得一种分子量为13.3kD的PLA2；Yuping Yuan[30]等利用阴离子交换柱Q-Sepharose、阳离子交换柱S-Sepharose、C8反相HPLC等方法从澳大利亚铜斑蛇中得到一种分子量为15kD的PLA2。本文首先采用醇沉的方法除去大部分杂蛋白，然后通过两次Sephadex G-50凝胶过滤层析法从长白山乌苏里蝮蛇蛇毒复杂的组分中分离纯化出一种分子量约为16.2kD的PLA2单体，并对其磷脂酶活性进行分析研究，国内外尚未有利用此方法获得此种PLA2的研究。
黄立峰,俞昌喜[6]（2012）在《舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP的部分理化性质测定》文中研究说明目的对舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP成分进行纯化及部分理化性质测定。方法采用色谱技术纯化蛇毒MP成分,质谱仪测定其相对分子质量（Mr）;Edman降解法分析部分氨基酸序列,与已知成分比对;以卵磷脂为底物测定MP组分的磷脂酶A2活性;采用Bliss法测定MP对小鼠的急性毒性。结果 MP的Mr为13 260,其N端16位氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSR,与已知蛇毒磷脂酶A2基本一致,并具有较强的磷脂酶A2活性;腹腔注射MP对小鼠的LD50值为14.3 mg/kg。结论 MP为一种眼镜蛇毒磷脂酶A2。
马兆瑞[7]（2012）在《中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒磷脂酶A2神经毒素的分离纯化及生物学活性鉴定》文中指出中介蝮（Gloydius intermedius）为蝰科蝮亚科毒蛇,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种蝮蛇,广泛分布于我国西北和华北地区。蛇毒磷脂酶A2（Snake venom phospholipase A2, svPLA2）是蛇毒液中毒性最强的组分之一,除酶活性外,还表现出多种毒理药理学活性,具有潜在的利用价值。但是,关于中介蝮蛇磷脂酶A2神经毒素的毒理学活性、结构与功能的关系、作用机理等有待阐明,而分离获得PLA2神经毒素是解决这些问题的前提。本论文的研究内容及结果：1.中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化（1）凝胶过滤层析利用凝胶过滤填料Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行初步分离,缓冲液为50mmol/L碳酸氢铵（pH8.0）,分离得到5个蛋白峰（P1-P5）。分别测定各个峰组分磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,SDS-PAGE分析各个峰组分的蛋白纯度。结果表明,P2与P3为磷脂酶A2神经毒素,而P1、P4、P5中均不是磷脂酶A2神经毒素。SDS-PAGE分析表明这两个目的蛋白峰不是单一条带,因此需要进一步分离。（2）阴离子交换层析利用HiTrap DEAE阴离子交换层析柱对P2和P3做进一步的分离纯化,先用A液（50mmol/L醋酸铵,pH7.3）洗脱未结合的组分,之后0%-100%B液（50mmol/L醋酸铵,0.5mol/LNaCl,pH7.3）进行线性梯度洗脱。收集各个穿透峰及洗脱峰,分别测定各个峰组分磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,SDS-PAGE分析各个组分的蛋白纯度。结果表明,P2-5、P3-2和P3-3为PLA2神经毒素,SDS-PAGE分析表明P2-5、P3-2和P3-3不是单一条带,仍需进一步的分离纯化。（3）阳离子交换层析利用HiTrapCM阳离子交换层析柱对P2-5、P3-2和P3-3进行分离纯化,A液（50mmol/L醋酸铵,pH5.3）洗脱未结合的组分,之后0%-100%B液（50mmol/L醋酸铵,0.5mol/LNaCl,pH5.3）进行线性梯度洗脱,收集各穿透峰及洗脱峰。分别测定各个峰组分的磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,用SDS-PAGE分析各个组分的蛋白纯度。结果表明,P2-5-1、P3-2-1、P3-3-1具有酶活性,是导致实验动物偏瘫、呼吸衰竭的致死组分,为磷脂酶A2神经毒素。SDS-PAGE分析显示,P2-5-1、P3-2-1、P3-3-1纯度很高,接近单一条带,分子量在14kDa左右。2.生物学活性初步检测：（1）酶活性：采用人工合成底物4-硝基-3-苯甲酸（NOB）测得P3-2-1的酶活力为352nmol/minmg, Vmax为7.21nmol/min,最适温度为35℃,最适pH为8.0,且依赖于Ca2+。（2）间接溶血活性：采用红细胞血红蛋白释放法测定P3-2-1组分的间接溶血活性,1%Triton X-100为阳性对照、等体积的Tris-HCl为阴性对照,结果表明P3-2-1组分具有一定的溶血活性,溶血率为21%。（3）肌肉毒性：采用CK肌酸激酶试剂盒测定中毒小鼠血清肌酸激酶（CK）的酶活力。小鼠肌肉注射P3-2-1组分后,2h、4h、6h、8h与Oh组相比,CK酶活力均显着升高,注射2h后酶活力达到最大值。（4）抑菌活性：粗毒为阳性对照,无菌去离子水为阴性对照,检测P3-2-1组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效应,结果显示P3-2-1可显着地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,说明P3-2-1具有抑菌活性。结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术,成功地从中介蝮蛇粗毒中分离纯化得到磷脂酶A2神经毒素,分子量为14kDa,最适温度为35℃,最适pH为8.0,依赖于Ca2+,具有间接溶血活性、肌肉毒性及抑菌活性。本工作为进一步研究中介蝮磷脂酶A2神经毒素的分子进化及作用机理奠定了理论基础。
乔玉莉[8]（2012）在《广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响》文中研究表明目的从广西产眼镜蛇（Naja）蛇毒中分离纯化磷脂酶A2（phospholipase A2, PLA2）,并研究其理化性质及其对肝癌细胞生长的影响。方法（1）采用凝胶过滤层析法和离子交换层析法分离眼镜蛇粗毒,经平板法和自动电位滴定法测定各峰的PLA2活性,得到具有PLA：活性的组分Ⅰ（命名为DEAE Ⅰ）,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）和MALDI-TOF鉴定其纯度并测定分子量。（2）通过自动电位滴定法测定DEAE Ⅰ的最适温度、最适pH及热稳定性。并通过动物急性毒性实验,研究DEAE Ⅰ的LD5o。（3）通过MTT实验研究DEAE Ⅰ对正常成人肝细胞（HL-7702）和肝癌细胞（SMMC-7721）的细胞毒性,并用倒置相差显微镜观察细胞形态的改变。（4）利用扫描电镜观察DEAE Ⅰ对细胞形态学改变的影响。（5）采用流式细胞术,用Annexin Ⅴ/PI双染色法检测细胞凋亡,用PI染色法检测细胞周期,观察PLA2对细胞凋亡及周期的影响,进一步推测其作用机制。结果（1）通过凝胶过滤层析法和离子交换层析法,分离得到具有PLA2活性的组分Ⅰ（即DEAE Ⅰ）,自动电位滴定法测DEAE Ⅰ的PLA2活力为66.12μmol/（mg*min）;经SDS-PAGE,得出该组分的分子量约为14.4KD,且基本达电泳纯。该组分经HPLC-TSK2000凝胶柱鉴定,仅有单一峰,且基本对称,说明该组分基本达90%以上。经MALDI-TOF鉴定的分子量为13282.02Da。（2）自动电位法测得DEAE Ⅰ的最适温度约为50℃,最适pH在6.0附近,且具有良好的热稳定性。急性毒性实验结果显示,DEAE Ⅰ对昆明小鼠的半数致死剂量（LD50）为13.86±0.057mg/Kg,表明对动物的毒性较小。（3）将DEAE Ⅰ作用于HL-7702及SMMC-7721,通过其对细胞的剂量依赖性和时间依赖性的筛选,确定DEAE Ⅰ的最佳作用浓度为200μg/ml,最佳最用时间为48h。将200μg/ml的DEAE Ⅰ作用于细胞,发现其对HL-7702细胞的抑制率为66.34±12.62%：对SMMC-7721的抑制率为77.82±9.70%。统计分析表明,DEAE Ⅰ对细胞的抑制率与10μg/ml的CDDP对细胞的抑制率差别无统计学意义（p>0.05）；与粗毒（3μg/ml）、G50Ⅰ （40μg/ml）和CM Ⅰ （80μg/ml）比较,p<0.05,表明DEAE Ⅰ与之差别有统计学意义。将DEAE Ⅰ对SMMC-7721的抑制率与HL-7702比较,发现其对SMMC-7721的抑制作用稍强（p<0.05）。（4）细胞形态学的扫描电镜结果显示,DEAE Ⅰ作用24h能使少部分HL-7702和SMMC-7721形成有膜包围的含有核和细胞质碎片的大小不一的凋亡小体状结构,且细胞死亡较少；作用48h,两株细胞均见到明显的凋亡小体样结构,但HL-7702坏死较多。（5）流式细胞仪检测凋亡结果显示,DEAE Ⅰ作用24h后,HL-7702和SMMC-7721无明显的凋亡发生。延长作用时间至48h,DEAE Ⅰ作用于SMMC-7721诱导出现明显的凋亡,凋亡率为33.03%；而作用于HL-7702细胞的凋亡率仅为5.62%,但细胞碎片比较大增；而CDDP对两株细胞的抑制率分别为41.92%和87.37%。（6）细胞周期结果显示,DEAE Ⅰ作用24h后,HL-7702细胞S期值略增高,其他时相均有所下降；而SMMC-7721的细胞周期G0/G1期增加；而CDDP作用与两株细胞24h后,均见凋亡峰。作用48h后,DEAE Ⅰ可使两株细胞的G0/G1期数值均增加,CDDP可使HL-7702出现大量坏死。结论（1）分离得到的组分DEAE Ⅰ具有磷脂酶A：的酶活力,经SDS-PAGE和MALDI-TOF鉴定其分子量为13282.02Da。（2）电位滴定法测得的DEAE Ⅰ的最适温度在50℃左右,最适pH约为6.0,并具有良好的热稳定性。动物急性毒性实验表明DEAE Ⅰ对小鼠的毒性较小。（3）MTT结果显示200μg/ml的DEAE Ⅰ对细胞的作用与10μg/ml的CDDP相当；将DEAE Ⅰ对SMMC-7721的抑制率与HL-7702比较,发现其对SMMC-7721的抑制率稍强。（4）细胞形态学的电镜观察,DEAE Ⅰ能诱导SMMC-7721的凋亡,但对HL-7702的诱导作用稍弱。（5）采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,发现DEAE Ⅰ作用两株细胞48h均能诱导凋亡,但对HL-7702的诱导作用稍弱；并能使两细胞的G0/G1期增加。
杜国俊[9]（2011）在《中介蝮（G.intermedius）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及生物活性研究》文中指出蛇毒磷脂酶A2 （Snake venom phospholipase A2,svPLA2）是蛇毒中毒性最强的组分,除具有酶活性外,还可能具有多种毒理学活性,具有潜在的利用价值。同一种毒蛇的蛇毒中可能存在多种PLA2,虽然它们的氨基酸序列和空间结构相似,一级结构差异不大,但功能上却差异明显,因此是研究蛋白质结构和功能的极好模型,也是蛇毒研究领域的一个热点。中介蝮（Gloydius intermedius）为蝰科蝮亚科（Crotalinae）毒蛇,广泛分布于我国西北、华北地区,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种,其PLA2的结构及作用的分子机制有待阐明,而分离获得PLA2是解决这些问题的前提。本研究的内容及结果：1.中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化（1）以中介蝮粗毒为原料,用Sephacryl-200HR凝胶过滤层析柱进行初步分离,用50mmol/L醋酸铵缓冲液洗脱,分离得到8个蛋白峰（Peak1-8）。以获得的峰组分1mL腹腔注射昆明小鼠,观察急性毒性效应,并采用SDS-PAGE分析组分的蛋白纯度。结果表明,Peak1和Peak8蛋白含量甚微,无致死活性。Peak2、Peak6和Peak7虽然有小鼠致死活性,但是没有引起偏瘫和呼吸衰竭,而且有出血,推测可能为出血毒素。Peak3、Peak4、Peak5有致死活性,且能引起偏瘫及呼吸衰竭,可能为神经毒素。SDS-PAGE分析发现这3个组分都非单一条带,因此需要进一步分离。（2）用HiTrap Q阴离子交换层析对具有神经毒性的Peak3、4、5进一步的分离纯化,上样后以A液（50 mmol/L醋酸铵缓冲液,pH7.8）洗脱未结合的组分,之后从A液到100%B液（50mmol/L醋酸铵缓冲液,0.5mol/L NaCl pH7.8）进行线性梯度洗脱。收集各洗脱峰及穿透峰,然后取各组分1mL腹腔注射昆明小鼠,根据急性毒性结果判定神经毒素活性,用SDS-PAGE分析组分纯度。结果表明,Peak3-1、Peak4-1和Peak5-2有致死活性,且局部有出血,其可能为出血毒素。Peak3-2、Peak4-2、Peak5-1均有致死活性,且可导致偏瘫及呼吸衰竭,为神经毒素,由于SDS-PAGE分析发现不是单一条带。（3）最后,利用HiTrap SP|阳离子交换柱对有PLA2神经毒活性的3个峰组分（Peak 3-2、Peak 4-2、Peak1 5-1）进行了分离,上样后以A液（50 mmol/L醋酸铵缓冲液,pH5.5）为起始洗脱液,之后从A液到100% B液（50 mmol/L醋酸铵缓冲液,0.5mol/L NaCl pH5.5）进行线性梯度洗脱,收集各洗脱峰。腹腔注射昆明小鼠,观察急性毒性效应,同步用SDS-PAGE分析组分纯度,卵磷脂琼脂平板法检测致死毒性组分的PLA2活性。结果表明,Peak3-2-2、Peak4-2-1、Peak4-2-2和Peak5-1-2无致死活性,Peak3-2-1和Peak5-1-1均有致死活性,Peak3-2-1分子量在14kDa左右,纯度接近单一条带,Peak5-1-1仍有三个条带,不纯。Peak3-2-1、Peak5-1-1都具有磷脂酶A2活性,其中Peak3-2-1的PLA2活性最高。2.生物活性初步检测：（1）酶活性检测：以中介蝮蛇粗毒做阳性对照,卵磷脂琼脂平板法检测了Peak3-2-1组分的PLA2酶活性,结果显示Peak3-2-1比粗毒的透明圈大。（2）抑菌活性检测：以大肠杆菌为对象,粗毒为阳性对照,PBS为阴性对照,检测Peak3-2-1组分的24h抑菌效应,粗毒组出现的抑菌圈明显,而Peak3-2-1组分的抑菌活性不高。（3）溶血活性检测：以粗毒为阳性对照,红细胞血红蛋白释放法测定毒素的溶血活性,发现Peak3-2-1组分可以引起溶血,但活性比粗毒低。（4）以SD大鼠的膈神经-肌肉接头标本为模型,电生理学方法检测了Peak3-2-1的突触阻断效应,发现Peak3-2-1 20min后就可以抑制间接刺激诱发的膈肌收缩,60 min后膈肌收缩下降到只有正常幅度的10%左右。而且Peak3-2-1对间接刺激诱发的大鼠膈肌收缩有抑制作用,但不影响直接刺激膈肌引起的肌肉收缩,说明它抑制的是神经-肌肉接头的传递,而对肌肉组织本身无明显影响,其作用部位在突触间隙,因此属于神经毒素。结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术,从中介蝮蛇粗毒中筛选分离得到了一种具有神经毒性的PLA2,其分子量大约为14 kDa,该PLA2具有溶血活性、无抑菌活性。本工作为下一步研究中介蝮PLA2的分子进化及作用机理奠定了基础。
邓疆渝[10]（2011）在《白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究》文中认为白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）属于蝮亚科（Crotalinae）竹叶青属（Trimeresurus）,为剧毒蛇,是我国特有的毒蛇,主要分布于重庆、云南、四川、贵州、福建、海南、广东、广西和台湾等地区。蝮亚科毒蛇的蛇毒中含有多种可以影响血液系统的酶类,其中磷脂酶A2受到广泛的关注。磷脂酶A2在哺乳动物胰脏和蛇毒毒液中含量较丰富,它能专一催化3-Sn-甘油磷脂2位酰脂键的水解反应,生成溶血磷脂和脂肪酸,还表现出多种药理性质,例如,出血毒性、溶血活性、肌肉毒性、抗凝和诱导水肿等作用。正是由于其特殊的结构和丰富的生物活性,有些蛇毒的磷脂酶A2已经成为蛋白质结构和功能研究的重要模型。国内外先后对五步蛇（Agkistrodom. acutus）、蝮蛇（Agkistrodom. halys Pallas）、竹叶青（Trimeresurus Stejnegeri）、烙铁头（T. mucrosquamatus）等多种蛇毒的磷脂酶A2进行过报道,而对中国产白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A2的研究未见报道。本研究以中国产白唇竹叶青蛇毒为研究对象,从中分离纯化一种磷脂酶A2,并对其性质进行研究,主要研究工作包括以下几个方面:1.利用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析,Sephadex G-75凝胶层析和Q-Sepharose FF预装柱三步色谱法进行分离纯化,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出一种分子量约为17.2 KDa的磷脂酶A2。电泳结果显示该酶在还原性和非还原性条件下均为单一条带,表明磷脂酶A2是仅由单一肽链组成的蛋白分子。2.对分离纯化出来的磷脂酶A2的性质进行了分析研究。测得该酶的比活力为4.625×104U/mg,酶的最适作用温度为50℃左右,最适pH值为8.0左右,热稳定性较好;Ca2+、K+、Na+对其酶活性具有增强作用,而Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+则对其酶活性具有明显的抑制作用;EDTA和EGTA对酶活性具有抑制作用,而DTT、PMSF和β-巯基乙醇对酶活性稍有影响,但是影响不大;无蛋白水解活性、精氨酸酯酶活性和类凝血酶活性;有一定的抗胰蛋白酶活性和间接溶血活性;动物实验显示没有水肿活性。
二、蛇毒磷脂酶A_2的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛇毒磷脂酶A_2的研究（论文提纲范文）
（1）717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩写词注释表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 717 解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床研究 |
| 第一节 资料与方法 |
| 1 病例纳入 |
| 2 研究方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 1 一般资料分析 |
| 2 试验结果分析 |
| 第三节 讨论 |
| 1 中医学对蝮蛇咬伤的认识 |
| 2 现代医学对蝮蛇咬伤的认识 |
| 3 717 解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的机制探讨 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 蝮蛇伤大鼠创面组织差异蛋白组学初步研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 屏障环境下蝮蛇毒对动物致毒作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 717 解毒合剂抗蝮蛇毒作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三章 不足与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新 |
| 3 不足与展望 |
| 附录一:试验相关表格 717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤临床试验病例观察表 |
| 附录二:综述 蛇毒的中毒机制与植物药干预研究综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（2）中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中主要酶类活性的抑制作用（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 1.2.1血清对蛇毒中磷脂酶A2活性的影响 |
| 1.2.2血清对蛇毒中透明质酸酶活性的影响 |
| 1.2.3血清对蛇毒中5′-核苷酸酶活性的影响 |
| 1.2.4血清对蛇毒中乙酰胆碱酯酶活性的影响 |
| 1.2.5血清对蛇毒中L-氨基酸氧化酶酶活性的影响 |
| 1.3数据分析 |
| 2结果 |
| 2.1中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中磷脂酶A2活性的影响 |
| 2.2中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中透明质酸酶活性的影响 |
| 2.3中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中5′-核苷酸酶活性的影响 |
| 2.4中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中乙酰胆碱酯酶活性的影响 |
| 2.5中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中L-氨基酸氧化酶活性的影响 |
| 3讨论 |
（3）磷脂酶A1和C的固定化及其在联合脱胶中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 磷脂酶研究 |
| 1.1.1 磷脂酶 A_1 |
| 1.1.2 磷脂酶 A_2 |
| 1.1.3 磷脂酶C |
| 1.1.4 磷脂酶D |
| 1.2 磷脂酶的固定化 |
| 1.2.1 磷脂酶A_1的固定化 |
| 1.2.2 磷脂酶A_2的固定化 |
| 1.2.3 磷脂酶C的固定化 |
| 1.2.4 磷脂酶D的固定化 |
| 1.3 酶法脱胶 |
| 1.3.1 磷脂酶A_1脱胶的研究 |
| 1.3.2 磷脂酶A_2脱胶的研究 |
| 1.3.3 磷脂酶C脱胶的研究 |
| 1.4 研究的目的与内容 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.4 论文的技术框架线路图 |
| 第二章 大孔树脂固定化磷脂酶C的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 大孔树脂的筛选 |
| 2.2.4 载体的预处理 |
| 2.2.5 固定化酶的制备 |
| 2.2.6 载体蛋白吸附量的测定 |
| 2.2.7 固定化磷脂酶活力的测定 |
| 2.2.8 相对酶活的测定 |
| 2.2.9 磷脂酶C最优固定化条件的确定 |
| 2.2.10 固定化酶贮藏稳定性的研究 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 固定化载体的选择 |
| 2.3.2 磷脂酶C最佳固定化条件的确定 |
| 2.3.3 固定化磷脂酶的酶学特性 |
| 2.3.4 固定化酶贮藏稳定性的研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 磁性Fe_3O_4 纳米粒子固定化磷脂酶A1的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 固定化磷脂酶A_1流程图 |
| 3.2.4 Fe_3O_4-SiO_2 磁性复合载体的制备 |
| 3.2.5 磷脂酶A_1的固定化 |
| 3.2.6 固定化载体的表征 |
| 3.2.7 固定化磷脂酶A_1酶活力的测定 |
| 3.2.8 酶活回收率和蛋白固载率的计算 |
| 3.2.9 磷脂酶A_1最优固定化条件的确定 |
| 3.2.10 固定化磷脂酶的酶学特性 |
| 3.2.11 操作稳定性 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 磷脂酶A1固定化单因素试验 |
| 3.3.2 响应面试验结果与分析 |
| 3.3.3 磁性固定化磷脂酶A1的表征分析 |
| 3.3.4 固定化磷脂酶的酶学特性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 固定化磷脂酶C和固定化磷脂酶A_1联合脱胶的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 固定化磷脂酶A_1和固定化磷脂酶C联合脱胶工艺流程 |
| 4.2.4 固定化酶法联合脱胶 |
| 4.2.5 磷含量的标准曲线 |
| 4.2.6 固定化磷脂酶C脱胶条件的确定 |
| 4.2.7 固定化磷脂酶A_1脱胶条件的确定 |
| 4.2.8 不同脱胶工艺的对比 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 固定化磷脂酶C脱胶条件的确定 |
| 4.3.2 固定化磷脂酶A_1脱胶条件的确定 |
| 4.3.3 不同脱胶工艺的对比 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 |
（4）中介蝮蛇毒PLA2神经毒素Gintexin的神经肌肉效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒 |
| 1.2 蛇毒磷脂酶A2概述 |
| 1.3 蛇毒磷脂酶A2的分类 |
| 1.4 蛇毒磷脂酶A2功能的研究 |
| 1.4.1 酶活性 |
| 1.4.2 毒理药理活性 |
| 1.5 蛇毒磷脂酶A2复合物 |
| 1.5.1 共价复合物 |
| 1.5.2 非共价复合物 |
| 1.6 蛇毒突触前神经毒素PLA2的作用机制 |
| 1.6.1 蛇毒突触前毒素PLA2的催化活性和神经毒性间联系 |
| 1.6.2 蛇毒突触前神经毒素PLA2阻断神经肌肉传递 |
| 1.6.3 蛇毒神经毒素PLA2对神经末梢的作用 |
| 1.6.4 蛇毒神经毒素PLA2对神经细胞的作用 |
| 1.7 蛇毒神经毒素磷脂酶A2研究的方法 |
| 1.7.1 蛇毒磷脂酶A2分离 |
| 1.7.2 酶活性测定方法 |
| 1.7.3 神经毒性的判断方法 |
| 1.7.4 肌肉损伤研究 |
| 1.8 蛇毒磷脂酶A2的进化 |
| 1.9 蛇毒磷脂酶A2研究中存在的问题 |
| 1.10 本文工作 |
| 第2章 中介蝮神经毒素磷脂酶A2的分离纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 中介蝮粗毒的采集 |
| 2.4.2 Bradford法测定蛋白含量 |
| 2.4.3 凝胶过滤层析 |
| 2.4.4 测定蛋白质分子质量(SDS-PAGE) |
| 2.4.5 NOB测定PLA2活性 |
| 2.4.6 小鼠急性毒性试验 |
| 2.4.7 透析除盐 |
| 2.4.8 RP-HPLC及质谱分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 粗毒溶液浓度测定 |
| 2.5.2 凝胶过滤层析 |
| 2.5.3 蛋白质分子质量的测定 |
| 2.5.4 RP-HPLC及质谱分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 Gintexin的神经-肌肉接头效应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及试剂 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 张力信号进行定标处理 |
| 3.4.2 大鼠膈神经-膈肌标本的制备 |
| 3.4.3 大鼠膈神经-膈肌神经肌肉传递阻断实验 |
| 3.4.4 小鸡颈二腹肌标本的制备 |
| 3.4.5 小鸡颈二腹肌神经肌肉传递阻断实验 |
| 3.4.6 组织化学石蜡切片 |
| 3.4.7 免疫组织化学 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 大鼠膈神经-膈肌标本与小鸡颈二腹肌标本的对照 |
| 3.5.2 不同浓度Gintexin对小鸡颈二腹肌标本神经肌肉阻断作用 |
| 3.5.3 免疫组化结果 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 肌肉损伤 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及试剂 |
| 4.3 实验仪器及器材 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 组织化学石蜡切片 |
| 4.4.2 HE染色法 |
| 4.4.3 Masson染色法 |
| 4.4.4 肌酸激酶测定 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 组织损伤结果 |
| 4.5.2 肌酸激酶的测定 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
（5）乌苏里蝮蛇磷脂酶A2的分离、纯化及性质测定（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒研究进展 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 蛇毒的毒性成分及毒理作用 |
| 1.2 磷脂酶 A_2 |
| 1.2.1 磷脂酶 A_2的一般性质 |
| 1.2.2 磷脂酶 A_2的来源分布 |
| 1.3 蛇毒磷脂酶 A_27 |
| 1.3.1 蛇毒磷脂酶 A_2的理化性质 |
| 1.3.2 蛇毒磷脂酶 A_2的分类 |
| 1.3.3 蛇毒磷脂酶 A_2的结构特征 |
| 1.3.4 蛇毒磷脂酶 A_2的酶活性 |
| 1.3.5 蛇毒磷脂酶 A_2的药理活性 |
| 1.3.6 蛋白质的分离纯化 |
| 1.3.7 蛇毒磷脂酶 A_2的酶活性检测方法 |
| 1.3.8 蛇毒磷脂酶 A_2的分离方法的进展 |
| 1.4 本论文的立题依据 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器与设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 分离纯化条件摸索 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Gloydius-PLA_2的分离纯化 |
| 2.2.2 Gloydius-PLA_2的相对分子量测定 |
| 2.2.3 Gloydius-PLA_2的浓度测定 |
| 2.2.4 Gloydius-PLA_2的磷脂水解活性测定方法一 |
| 2.2.5 Gloydius-PLA_2的磷脂水解活性测定方法二 |
| 2.2.6 Gloydius-PLA_2纤维蛋白原水解活性测定 |
| 2.2.7 Gloydius-PLA_2的最适 pH 测定 |
| 2.2.8 Gloydius-PLA_2致水肿活性测定 |
| 2.2.9 Gloydius-PLA_2出血毒活性检测 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 醇溶蛇毒蛋白经两次 Sephadex G-50 凝胶过滤色谱结果 |
| 3.2 Gloydius-PLA_2的电泳图谱及相对分子质量测定 |
| 3.3 Gloydius-PLA_2的蛋白浓度测定 |
| 3.4 Gloydius-PLA_2的磷脂水解活性测定一 |
| 3.5 Gloydius-PLA_2的磷脂水解活性测定二 |
| 3.6 Gloydius-PLA_2纤维蛋白原溶解活性测定 |
| 3.7 Gloydius-PLA_2磷脂水解活性最适 pH 测定 |
| 3.8 Gloydius-PLA_2致水肿活性测定 |
| 3.9 Gloydius-PLA_2出血毒活性测定 |
| 3.10 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP的部分理化性质测定（论文提纲范文）
| 1 材 料 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 柱色谱纯化 |
| 2.1.1 离子交换色谱 |
| 2.1.2 反相色谱 |
| 2.2 质谱分析 |
| 2.3 N端氨基酸序列测定 |
| 2.4 磷脂酶A2活性测定 |
| 2.5 小鼠急性毒性试验 |
| 3 讨 论 |
（7）中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒磷脂酶A2神经毒素的分离纯化及生物学活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒 |
| 1.2 蛇毒磷脂酶A_2 |
| 1.3 蛇毒磷脂酶A_2分类 |
| 1.4 蛇毒磷脂酶A_2结构特征 |
| 1.5 蛇毒磷脂酶A_2功能 |
| 1.5.1 酶活性 |
| 1.5.2 毒理药理活性 |
| 1.6 蛇毒神经毒素 |
| 1.6.1 突触前神经毒素 |
| 1.6.2 突触后神经毒素 |
| 1.7 蛇毒磷脂酶A_2突触前神经毒素作用机理 |
| 1.7.1 磷脂酶A_2受体分子 |
| 1.7.2 胞内分子事件 |
| 1.8 蛇毒磷脂酶A_2分离方法研究进展 |
| 1.9 本文工作 |
| 第2章 中介蝮蛇毒磷脂酶A_2神经毒素的分离纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 中介蝮粗毒的采集 |
| 2.4.2 凝胶过滤层析 |
| 2.4.3 DEAE sepharose Fast Flow阴离子交换层析 |
| 2.4.4 CM sepharose Fast Flow阳离子交换层析 |
| 2.4.5 蛋白含量的测定 |
| 2.4.6 蛋白质分子质量的测定(SDS-PAGE) |
| 2.4.7 NOB测定PLA_2活性 |
| 2.4.8 小鼠急性毒性试验 |
| 2.4.9 透析袋的处理 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 凝胶过滤层析 |
| 2.5.2 阴离子交换层析 |
| 2.5.3 阳离子交换层析 |
| 第3章 中介蝮蛇毒磷脂酶A_2神经毒素生物学活性鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂及实验材料 |
| 3.2.3 卵磷脂平板法测定PLA_2酶活性 |
| 3.2.4 P3-2-1组分与中介蝮粗毒PLA2活性的比较 |
| 3.2.5 温度对PLA_2酶活力的影响 |
| 3.2.6 pH对PLA_2酶活力的影响 |
| 3.2.7 底物浓度对PLA_2酶活力的影响 |
| 3.2.8 二价金属离子对PLA_2酶活力的影响 |
| 3.2.9 间接溶血活性 |
| 3.2.10 CK肌酸激酶测定 |
| 3.2.11 抑菌活性 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 卵磷脂平板法测定PLA_2酶活性 |
| 3.3.2 P3-2-1组分与中介蝮粗毒PLA_2活性的比较 |
| 3.3.3 温度对PLA_2酶活力的影响 |
| 3.3.4 pH对PLA_2酶活力的影响 |
| 3.3.5 底物浓度对PLA_2酶活力的影响 |
| 3.3.6 二价金属离子对PLA_2酶活力的影响 |
| 3.3.7 间接溶血活性 |
| 3.3.8 CK肌酸激酶测定 |
| 3.3.9 抑菌活性 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 分离纯化 |
| 4.2 活性检测 |
| 4.3 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
（8）广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1、广西眼镜蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化及理化性质究 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 2、蛇毒PLA_2对肝癌细胞生长的影响 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 3、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）中介蝮（G.intermedius）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒概述 |
| 1.2 蛇毒磷脂酶A_2 |
| 1.2.1 蛇毒PLA_2的理化性质 |
| 1.2.2 蛇毒PLA_2的分类 |
| 1.3 蛇毒PLA_2的结构与功能 |
| 1.3.1 蛇毒PLA_2的结构特征 |
| 1.3.2 蛇毒PLA_2的功能 |
| 1.3.3 结构与功能的关系 |
| 1.4 蛋白质的分离纯化 |
| 1.4.1 蛋白质的分离基质 |
| 1.4.2 生物大分子分离纯化模式 |
| 1.4.3 蛇毒PLA_2分离方法进展 |
| 1.5 PLA_2活性检测方法 |
| 1.5.1 体外检测方法 |
| 1.5.2 动物效应检测法 |
| 1.6 本文工作 |
| 第2章 中介蝮蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 蛇毒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 缓冲液与培养基 |
| 2.2 分离过程 |
| 2.2.1 凝胶过滤层析 |
| 2.2.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.2.3 阴离子交换层析 |
| 2.2.4 阳离子交换层析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 粗毒溶液浓度测定 |
| 2.3.2 凝胶过滤层析 |
| 2.3.3 HiTrap Q阴离子交换层析 |
| 2.3.4 HiTrap SP阳离子交换层析 |
| 第3章 中介蝮蛇毒磷脂酶A2生物学活性鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 PLA_2的酶活力检测 |
| 3.2.4 抑菌实验 |
| 3.2.5 溶血活性 |
| 3.2.6 PLA_2对神经-肌肉接头的阻断作用 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PLA_2的酶活力检测 |
| 3.3.2 抑菌试验 |
| 3.3.3 溶血活性 |
| 3.3.4 PLA_2对神经肌肉接头的阻断作用 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 分离纯化 |
| 4.2 活性检测 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
（10）白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写一览表 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 本研究的主要内容 |
| 1.2.1 粗毒的制备 |
| 1.2.2 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的分离纯化 |
| 1.2.3 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的性质研究 |
| 1.3 本技术的研究路线 |
| 2 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的分离纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器与设备 |
| 2.1.2 主要材料与试剂 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 层析结果 |
| 2.2.2 纯度鉴定及分子量测定 |
| 2.3 讨论 |
| 3 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器与设备 |
| 3.1.2 主要材料与试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 蛋白质含量测定 |
| 3.2.2 酶活力测定 |
| 3.2.3 不同温度对酶活力的影响 |
| 3.2.4 pH 对酶活力的影响 |
| 3.2.5 金属离子对酶活力的影响 |
| 3.2.6 抑制剂对酶活力的影响 |
| 3.2.7 热稳定性 |
| 3.2.8 精氨酸酯酶活力的测定 |
| 3.2.9 蛋白水解酶活性的测定 |
| 3.2.10 抗胰蛋白酶作用的测定 |
| 3.2.11 类凝血酶活性测定 |
| 3.2.12 溶血活性测定 |
| 3.2.13 水肿活性测定 |
| 3.3 讨论 |
| 4 全文小结 |
| 5 文献综述 |
| 5.1 磷脂酶A_2 的概述 |
| 5.2 磷脂酶A_2 的分类 |
| 5.3 磷脂酶A_2 的理化性质和结构特征 |
| 5.4 蛇毒磷脂酶A_2 的分类 |
| 5.5 蛇毒磷脂酶A_2 的理化性质 |
| 5.6 蛇毒磷脂酶A_2 的结构特征及催化机理 |
| 5.7 蛇毒磷脂酶A_2 的毒理作用及其机制 |
| 5.7.1 对血液循环系统的作用 |
| 5.7.2 肌毒性作用 |
| 5.7.3 诱导水肿形成作用 |
| 5.7.4 突触前神经毒性作用 |
| 5.7.5 其他作用 |
| 5.8 蛇毒磷脂酶A_2 生物信息学研究 |
| 5.9 蛇毒磷脂酶A_2 基因工程的研究 |
| 5.10 竹叶青属蛇毒中磷脂酶A_2 的研究进展 |
| 5.11 蛇毒磷脂酶A_2 的研究展望 |
| 参考文献 |
| 附：作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况 |
| 致谢 |
四、蛇毒磷脂酶A_2的研究（论文参考文献）
- [1]717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究[D]. 陈俊. 江西中医药大学, 2021(01)
- [2]中华眼镜蛇血清对自身蛇毒中主要酶类活性的抑制作用[J]. 王萍,李恒,和七一,胡先成,熊艳,彭建军,余晓东. 重庆师范大学学报(自然科学版), 2019(06)
- [3]磷脂酶A1和C的固定化及其在联合脱胶中的应用[D]. 李进红. 合肥工业大学, 2019(01)
- [4]中介蝮蛇毒PLA2神经毒素Gintexin的神经肌肉效应研究[D]. 郭倩. 陕西师范大学, 2014(02)
- [5]乌苏里蝮蛇磷脂酶A2的分离、纯化及性质测定[D]. 张慧. 吉林大学, 2013(08)
- [6]舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP的部分理化性质测定[J]. 黄立峰,俞昌喜. 中国生化药物杂志, 2012(06)
- [7]中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒磷脂酶A2神经毒素的分离纯化及生物学活性鉴定[D]. 马兆瑞. 陕西师范大学, 2012(03)
- [8]广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响[D]. 乔玉莉. 广西医科大学, 2012(09)
- [9]中介蝮（G.intermedius）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及生物活性研究[D]. 杜国俊. 陕西师范大学, 2011(11)
- [10]白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究[D]. 邓疆渝. 重庆师范大学, 2011(08)