一、结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达（论文文献综述）
王海宁[1]（2021）在《结核分枝杆菌Rv0927c基因缺失株的构建及其生物学特性鉴定》文中指出结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC）感染引起的一种人兽共患传染病,具有较高的发病率和死亡率,严重威胁人类健康和社会经济发展。基于全球对结核病的关注以及对有效疫苗的迫切需要,基因敲除技术为结核分枝杆菌（Mycobacterium tubeberculosis,MTB）的研究提供了巨大便利。本研究以MTB H37Ra为宿主菌,Rv0927c基因为研究对象,利用特异性转导技术构建基因缺失株,并鉴定其生物学特性,同时建立了 MTB基因缺失的技术平台,完善MTB的基因缺失方法,以期能深入理解MTB的致病机理。应用温敏型噬菌体介导的特异性转导技术,首先扩增目的基因上下游同源臂,并与pYUB004S质粒的目的片段连接,构建重组pYUB004S质粒。其次,将重组质粒与载体phAE159进行连接。成功连接的产物通过噬菌体包装,转化至耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,MS）mc2155中获得能在30℃增殖的温敏性重组噬菌体。随后在37℃条件下进行噬菌体侵染实验,通过含75μg/mL的潮霉素B（Hygromycin B,Hyg）抗性平板筛选阳性突变株。最后对获得的突变株进行PCR和测序鉴定。成功构建Rv0927c基因缺失株,同时使用pMV261载体成功构建Rv0927c基因回补株。Rv0927c基因缺失对H37Ra的生长速率、菌落形态和细菌长度无显着影响。在胁迫条件下,相较于野生株和回补株,缺失株耐受过氧化物及表面活性物质SDS的能力有所提高（P<0.05）。在生物被膜实验中,缺失株具有较弱的生物被膜形成能力,但基因缺失并未改变H37Ra的耐药表型。在体外细胞实验中,NF-κB通路活化检测结果显示,Rv0927c基因能够促进NF-κB通路活化（P<0.05）。此外,Rv0927c基因未影响牛外周血单核细胞细胞因子TNF-α、IL-2的表达。胞内增殖实验结果显示,缺失株在细胞内的细菌数始终低于野生株及回补株,在36 h时差异极显着（P<0.0001）,表明Rv0927c基因有利于MTB在巨噬细胞内的存活。本研究成功构建了 H37Ra Rv0927c基因缺失株,为深入探究结核分枝杆菌基因功能提供思路。
罗西子[2]（2021）在《结核分枝杆菌细胞壁合成基因网络模块定位及功能分析》文中指出结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,TB）引起的结核病从古至今一直是全球的健康挑战之一。20世纪50年代以来,异烟肼,利福平,乙胺丁醇等一线抗结核药物的不断发现,有效地提高了结核病患者的治愈率与存活率。但是多种形式的耐药菌株的出现,包括异烟肼（INH）利福平（XDR）的单一耐药菌株,多药耐药（XDR）菌株以及广泛耐药菌株,使结核病又成为了全球每年150万人死亡的主要原因。同时HIV病毒与结核病的协同感染,加重了治愈结核的难度。如今,新型有效抗结核药物靶点的攻克迫在眉睫。结核病难以攻克的重要原因在于结核分枝杆菌细胞壁与其他细菌大不相同。TB的细胞壁结构特殊,对TB在宿主体内侵袭,生存,繁殖极为重要。TB药物难以研发的主要原因也是TB具有坚硬的细胞壁以及极低的渗透性。TB的耐药也与其细胞壁相关。TB多重耐药菌株和易感菌株相比,与细胞壁合成相关基因Drra,Drrb在抗生素耐药过程中起重要作用。利福平耐药TB可以通过细胞壁脂质变化重新诱导巨噬细胞代谢过程。由此可见,TB的细胞壁是研发新型抗结核药物的重要靶点。在本研究中我们首先基于生物信息学的方法筛选出细胞壁中的关键基因群,使用Biocarta,美国国家癌症研究所通路相互作用数据库（NCI-PID）,Human Cyc和Reactome对结核分枝杆菌进行了高通量全基因组筛选。其次,使用实验室已建立数据库（DOOR）对结核分枝杆菌细胞壁合成基因的操纵子进行分类;使用GO,KEGG对细菌细胞壁基因进行功能分析;通过蛋白互作网络筛选出关键子网。最后,使用Cytoscape可视化结果。共鉴定了893个结核分枝杆菌H37Rv细胞壁合成基因,分布在20条通路中,涉及与细胞壁合成相关的46种不同功能;确定了细胞壁合成途径中的重要关键基因和以ID6951为首包含全部细胞壁合成基因的多个操纵子。此外,我们发现了五个参与肽聚糖生物合成,膜转运蛋白合成和其他细胞壁过程的分子复合物的共表达网络模块,并且筛选出细胞壁关键基因ftsW用于功能分析。PCR扩增耻垢分枝杆菌ftsW基因,通过无缝克隆方法将目的基因整合到线性化载体p MV361-Rtet R（整合型载体）上,抽提质粒并测序验证,获得的阳性质粒通过电转化方法转入耻垢分枝杆菌中,获得过表达菌株。构建同源交换位点,将其整合到分枝杆菌噬菌体基因组,获得噬菌粒;将噬菌粒导入耻垢分枝杆菌,获得整合有同源交换位点的重组噬菌体,经体外扩增获得高滴度的重组噬菌体,对基因过表达耻垢分枝杆菌进行转染;将转染后的耻垢分枝杆菌涂布进行抗性筛选,挑取单克隆菌株,通过PCR等方式进行验证。ftsW敲低菌株构建成功后,PCR验证发现,不添加无水四环素时,菌株表现出ftsW过表达。加入3ug/ml无水四环素时,菌株表现为Fsw表达量降低。随后,我们对野生株,过表达株和敲低株检测了生长速率,菌落观察,电镜下细胞壁形态观察,外界压力条件下细菌存活率。结果表明,ftsW基因表达量变化时,细菌生长速率减慢。并且ftsW基因表达量降低会造成细菌生物膜形成障碍,细胞壁形态发生改变,菌落形态变化,提示基因ftsW可能与细菌细胞壁组分相关。面对极端环境压力时,ftsW敲低株表现出明显的生长优势。综上所述,本研究首先基于大数据,通过生物信息学方法靶向筛选结核分枝杆菌细胞壁关键基因,并选取ftsW基因做后续研究。我们发现ftsW基因与结核分枝杆菌细胞壁成分相关,并在结核分枝杆菌生长生存中起关键作用。
杨航,努尔塞力克·努素甫,杨亚军,姬祥,马忠臣,张萍,曹旭东,陈创夫[3]（2021）在《结核分枝杆菌rv1985c、rv3807c、rv1981c基因编码蛋白生物信息学分析以及间接ELISA方法的建立》文中指出目的探究Rv1985c、rv3807c、rv1981c基因编码蛋白的生物学特征,建立间接ELISA方法并对其诊断效能进行分析和评价。方法从NCBI数据库中获取rv1985c、rv3807c、rv1981c的全基因序列;应用生物信息学分析软件SOPMA预测蛋白的二级结构;采用SWISS-MODEL建立rv1985c、rv3807c和rv1981c 3个蛋白的3D模型;采用TMHMM Server v.2.0分别预测并分析蛋白的跨膜结构;采用IEDB在线软件预测分析蛋白质线性B细胞抗原表位。以H37RV标准株基因组为模版,PCR扩增目的基因序列并克隆至表达载体中,经IPTG诱导表达后采用Ni柱纯化得到高纯度的目的蛋白,方阵滴定法确定其在间接ELISA中的最佳反应条件。结果 rv1985c、Rv1981c为亲水性蛋白且无跨膜结构域,rv3807c为疏水性蛋白且存在3次跨膜结构,3个蛋白均无信号肽,Rv1985c、Rv1985c的不稳定系数高于rv3807c,通过B细胞表位分析各筛选出3个优势表位区。成功构建3个重组表达载体,亲和层析纯化后Western blot验证3个蛋白均能与结核病患者血清反应,具有良好的反应原性,3个蛋白间接ELISA检测血清中IgM敏感性分别为37.20%、54.70%、40.60%,特异性分别为63.70%、71.30%、67.50%,检测IgG时敏感性为:47.60%、61.60%、46.50%,特异性分别为49.70%、74.80%、74.30%。结论生物信息学分析rv1985c、rv3807c、rv1981c均含优势B细胞表位,原核表达的3个蛋白均具有作为ELISA诊断抗原的潜力,为结核病快速诊断候选抗原筛选提供了理论基础。
钟燕霄,刘丽莎,刘敏,潘勤,章晓联,罗凤玲[4]（2021）在《结核分枝杆菌RD区蛋白EspK的表达及对巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生的影响》文中研究说明目的:构建结核分枝杆菌Rv3879c基因的原核表达质粒并进行体外表达,研究Rv3879c基因编码蛋白EspK的生物学功能。方法:将Rv3879c基因克隆至原核表达载体pET-28a中,诱导表达后采用亲和层析纯化重组蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定后,用纯化的蛋白免疫小鼠制备血清多克隆抗体,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;体外实验检测EspK蛋白对巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生的影响;pulldown实验和质谱筛选宿主细胞内与EspK相互作用的蛋白;运用生物信息学软件ProtParam对蛋白进行理化性质和亲疏水性分析,TMHMM和SignalP 5.0 server预测蛋白的跨膜区和信号肽,NPS@SOPMA预测蛋白的二级结构,Scansite 4.0预测蛋白模体结构。结果:成功构建Rv3879c的重组原核表达质粒;SDS-PAGE和Western Blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得分子质量为74 kU的EspK蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度可达1∶409 600;EspK蛋白能促进小鼠巨噬细胞Ⅰ型干扰素的表达;成功筛选到4种与EspK相互作用的蛋白;生物信息学分析结果显示EspK蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽结构;EspK的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,有两个Erk1模体结构,可能参与多种生物学过程。结论:成功表达并纯化出重组蛋白EspK,EspK蛋白可促进巨噬细胞Ⅰ型干扰素的表达,利用生物信息学分析蛋白的结构及性质,为进一步研究EspK蛋白在结核病发生发展中的作用奠定了基础。
崔佳[5]（2020）在《ASAP1介导巨噬细胞和中性粒细胞迁移参与宿主抗结核分枝杆菌感染的研究》文中研究说明结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）是引起人畜重大慢性传染性疾病-结核病（Tuberculosis,TB）的单一病原菌。研究表明,宿主本身遗传特质影响结核病易感性,在俄罗斯人群和中国人群中全基因组关联分析（Genome Wide Association Study,GWAS）表明ASAP1（Arf GAP with SH3 domain,ankyrin repeat and PH domain 1）多态性与结核病易感性显着相关,然而ASAP1如何影响结核病易感性还未有报道。本文从反式遗传学的角度在斑马鱼模型和巨噬细胞系THP1和Raw264.7中敲除或敲低ASAP1后分析宿主对于结核病易感性的变化,并进一步从吞噬细胞生理功能的角度探究了ASAP1影响宿主对结核病易感性的机制。主要研究结果如下:1.asap1基因敲除斑马鱼模型的构建斑马鱼现已成为研究结核病的常见模式生物。本项目首先利用生物信息学分析了斑马鱼asap1a和asap1b基因,将斑马鱼asap1a和asap1b与人类ASAP1、小鼠的Asap1进行了染色体基因位点连锁性分析,并对斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白与人类、小鼠和大鼠的ASAP1蛋白进行了多重序列比对,通过进化树分析确定了斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白的进化位置。q RT-PCR方法检测发现斑马鱼asap1a和asap1b基因均系母性遗传控制,原位杂交显示两基因在斑马鱼体内通体表达,无组织特异性。应用基因编辑CRISPR/Cas9技术建立asap1a和asap1b基因敲除的斑马鱼,得到asap1a敲除突变斑马鱼3个品系,得到asap1b敲除突变斑马鱼3个品系,得到asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼1个品系,得到asap1a和asap1b双敲除突变且中性粒细胞荧光标记的斑马鱼1个品系。通过存活率分析发现,asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼在1-3天胚胎期死亡率明显增高,而asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼则无明显死亡率下降现象。通过q RT-PCR检测发现,asap1a单敲除突变斑马鱼中asap1b基因的表达量升高,在asap1b单敲除突变斑马鱼中未见asap1a基因的表达量有补偿性升高。另外,应用morpholino对斑马鱼asap1a和asap1b基因进行敲低,q RT-PCR和western blotting证实两基因共敲低。第一部分结果表明通过morpholino和基因编辑的手段在斑马鱼中成功建立了asap1a和asap1b敲低或敲除的突变体。2.应用斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型探讨Asap1影响巨噬细胞和中性粒细胞迁移能力进而影响宿主对结核病易感性关系海鱼分枝杆菌（Mycobacterium marinum,Mm）与结核分枝杆菌具有高度的同源性,是引起斑马鱼结核病的病原菌。斑马鱼的发育早期通体透明,能够通过应用荧光蛋白表达示踪细胞行为,所以在研究固有免疫相关吞噬细胞如巨噬细胞（macrophage,MΦ）和中性粒细胞（neutrophil）方面具有独特的可视化优势。本章首先在斑马鱼模型上系统研究Asap1对海鱼分枝杆菌易感性的影响,发现asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼对海鱼分枝杆菌易感性与野生型相比无明显的差异性,但asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼较野生型斑马鱼对海鱼分枝杆菌的感染能力增强。此结论与用morpholino敲低的asap1a和asap1b斑马鱼研究结果一致。在asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼中我们还发现,无论是尾部创口还是海鱼分枝杆菌感染后的定向趋化,巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力较之于野生型斑马鱼明显减弱。3.利用人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7研究ASAP1与结核分枝杆菌易感性的关系通过在人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7中建立敲低ASAP1的细胞模型,并经q RT-PCR与western blotting验证敲低效率。其次在THP1和Raw264.7中发现敲低ASAP1的细胞较野生型细胞感染结核分枝杆菌的能力增强。Transwell实验表明敲低ASAP1引起了THP1和Raw264.7细胞对于结核分枝杆菌的迁移能力减慢,进一步验证了在斑马鱼中得到的Asap1可能影响结核病易感性的机制结论。在细胞模型中,我们还进一步探究了敲低ASAP1后细胞骨架发生的重塑现象,其中actin puncta数量明显增加,并且相应的黏着斑蛋白Vinculin与桩蛋白Paxillin的聚合状态也发生了改变,这些都为解释ASAP1影响宿主抗结核分枝杆菌的机制提供了可能性。综合发现,降低ASAP1表达水平增强了宿主对于结核分枝杆菌的感染程度,并且影响了巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力,推测这可能是ASAP1影响宿主结核病易感性的生物学机制。此课题的实施和完成将丰富宿主遗传基因影响结核病易感性的认识,对结核病的预防、早前筛查或培育抗结核病家畜具有一定科学意义和应用价值。
杨航[6]（2020）在《牛结核病诊断技术的建立与初步应用》文中指出牛结核是由牛分枝杆菌引起的人类和动物的人畜共患传染病,OIE将牛结核病分为B类人畜共患疾病在中国为II类人畜共患疾病。牛结核病每年给畜牧业带来的经济损失不可估量,不仅如此,牛结核病给人类的安全带来重大的隐患,因此对于牛结核病的防控至关重要,本研究希望通过探寻作为快速诊断的靶基因以及抗原蛋白,以免疫酶联吸附试验（ELISA）和实时荧光定量PCR技术为基础,建立针对牛结核病的诊断方法,为结核病的防控提供新的技术手段进行以下研究:（1）通过生物信息学分析的手段,对本试验室前期研究的16种结核特异性蛋白进行分析,通过理化特性、不稳定性指数、亲水性、蛋白质二级结构、跨膜域以及B细胞表位的分布预测为后续试验提供理论数据支持;将16株表达菌经表达纯化,经蛋白免疫印迹试验（Western-Blotting）验证均能与牛结核病阳性的牛血清进行反应,具有良好的反应源性;最终用爱德士牛结核病抗体检测试剂盒对本试验涉及的所有蛋白进行初步筛选,结果显示MPT70和MPT83在牛结核病的间接ELISA检测中具备优秀的诊断效能,可以作为诊断抗原进一步研究。（2）以MPT70蛋白、MPT83蛋白、MPT70-83融合蛋白、MPT70预测的抗原表位肽（M1）、MPT83预测的抗原表位肽（M2）分别为包被抗原建立间接ELISA检测方法,通过方阵滴定,确定其最佳包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及血清、二抗和显色的最佳反应时间,在各种最佳反应条件下对牛结核阳性的血清和牛结核阴性的血清进行检测,确定其阳性符合率以及阴性符合率。结果显示M1和MPT70的阴阳性符合率以及M2和MPT83的阴阳性符合率相当,可以以抗原多肽代替全蛋白作为诊断抗原。（3）建立一种基于Mpt83基因的实时荧光定量pcr的结核分枝杆菌核酸检测的方法,根据Mpt83基因设计一对特异性引物,以培养的H37RV标准株为模版扩增目的基因并连接T载体,构建标准重组质粒以检测所建方法的有效性。经反应条件的优化建立SYBR Green I实时荧光定量检测方法,结果显示所建立的方法线性关系良好,融解曲线波峰单一,具有很强的特异性与常见致病菌无交叉反应,最低检出下限为10copies/reaction,是常规PCR的100倍,对牛乳模拟标本的检测可达到10 CFU/10m L,可用于病菌的检测及定量分析。本试验通过生物信息学分析以及酶联免疫吸附试验对16种结核特异性蛋白进行初步的筛选,筛选出MPT70、MPT83两种对于牛结核病血清学诊断最具价值的抗原蛋白;分别以MPT70和MPT83两种蛋白和MPT70预测的抗原表位肽（M1）、MPT83预测的抗原表位肽（M2）以及MPT70-83融合蛋白建立间接ELISA检测方法,通过临床样本检测的结果显示两种蛋白的优势抗原表位段均能代替两种蛋白的全蛋白作为诊断抗原;以M PT83为靶基因的建立荧光定量PCR的检测方法,经检测所建立的方法具有良好的特异性,其检出下限可达10copies/reaction,对牛乳模拟标本的检测可达到10 CFU/10m L,可用于定量分析。为牛结核病的快速诊断提供一种新的技术方法。
马衡[7]（2020）在《基于GlnR和RegX3介导的耻垢分枝杆菌胆固醇代谢调控机制研究》文中指出结核分枝杆菌仍然是巨大的公共卫生威胁。胆固醇作为结核分枝杆菌特征性碳源,对在其宿主巨噬细胞中的生存至关重要。GlnR作为氮代谢全局性调控因子,在响应环境氮源信号调控氮代谢的同时,也能调控碳、磷等营养元素的代谢。此外SenX3/RegX3作为磷源感知双组分调控系统在调控磷代谢的同时,也能协调调控碳源代谢。因此,氮、碳和磷在维持机体正常生理功能及提供能量外,它们彼此之间存在着复杂而又精巧的协同调控作用。胆固醇是结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活和保持毒力的关键碳源,而分枝杆菌中胆固醇代谢机制仍未被彻底了解。在这里我们基于课题组的前期探索研究为基础,以GlnR和RegX3为媒介,进一步深入解析分枝杆菌中碳、氮、磷等营养元素的协同调控机制。具体研究内容如下:（1）GlnR介导的环境氮信号对耻垢分枝杆菌中胆固醇代谢的调控机制研究。我们通过生物信息学分析在kstR的启动子区域发现了一个典型的GlnR结合基序（CCGAC-AACAGT-GACAC）,然后进行了电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）分析以确定体外结合。然后进行了实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）以分析与野生型（WT）,glnR缺失的突变体（ΔglnR）和glnR补充性（ΔglnR::glnR）菌株在氮限制条件下与胆固醇降解相关的基因的差异表达。巨噬细胞ATP测试表明,GlnR-KstR的协同调节显着减少了耻垢分枝杆菌的侵袭。结果表明,参与胆固醇分解代谢的许多基因都通过KstR受到响应环境氮水平GlnR的调控,进而影响了耻垢分枝杆菌的入侵。（2）RegX3响应磷源信号对耻垢分枝杆菌中胆固醇转运的调控机制研究。首先采用生物信息学技术对RegX3蛋白的结构、功能及其结合motif进行预测分析,然后通过,EMSA实验初步证实RegX3可以直接结合mce4基因簇上游调控区的特征motif。然后进行了RT-qPCR实验分析了,与野生型（WT）,regX3敲低的突变体（i regX3）和regX3过表达菌株（OE regX3）在磷限制条件下胆固醇转运mce4基因簇转录表达差异。生长曲线及刃天青表型实验表明,RegX3促进了耻垢分枝杆菌的生长与存活。结果表明,胆固醇转运子mce4基因簇许多基因都受到响应环境磷水平RegX3的调控,从而影响了耻垢分枝杆菌的生长和存活。通过以上研究,我们揭示了耻垢分枝杆菌响应环境氮、磷信号对胆固醇转运、代谢的调控机制,这为分枝杆菌在宿主细胞内的生存控制提供了新的策略。
刘丽婷[8]（2020）在《结核分枝杆菌脂蛋白LPQH对小鼠Ana-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活作用研究》文中研究说明目的:对目的蛋白LPQH进行生物信息学分析和原核表达及纯化,将获得的目的蛋白作用于小鼠Ana-1巨噬细胞,检测其对体外细胞NLRP3炎症小体激活作用和细胞死亡的影响,以了解结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）脂蛋白LPQH在宿主巨噬细胞免疫-MTB感染相互关系中的作用,为进一步开发以LPQH为靶点的治疗方法或新型疫苗奠定理论基础。方法:首先利用NCBI Genbank、Expasy子软件Proteparam、Pro Scale、Signal P5.0 Server、TMpred Server、PHYRE2等数据库和在线分析工具对LPQH蛋白进行理化性质、亲疏水性氨基酸残基分布、信号肽、跨膜情况、蛋白质结构的分析。接着构建重组质粒pET-28a-LPQH,转化至大肠埃希菌BL-21中并诱导表达以获得目的蛋白LPQH,western blot分析其免疫反应性,镍离子亲和层析柱进行重组蛋白的纯化。再将不同浓度纯化LPQH蛋白直接作用于小鼠Ana-1巨噬细胞,在作用不同时间段后用western blot方法检测NLRP3炎症小体的主要成分NLRP3、ASC、caspase-1p20蛋白表达量的变化;ELISA方法检测细胞IL-1β分泌量及LDH试剂盒检测细胞LDH释放量;结合Hoechst33342/PI染色试剂盒和流式细胞仪检测细胞死亡情况。结果:生物信息学分析结果显示LPQH蛋白有159个氨基酸残基,为疏水性蛋白,性质比较稳定;预测有两次跨膜及有信号肽;蛋白二级结构中含有47%无规则卷曲、53%β-折叠和3%α-螺旋;三级结构可见空间构象比较疏松。成功诱导表达并纯化目的蛋白LPQH,浓度可达1mg/m L;western blot证实蛋白有良好免疫反应性。LPQH纯化蛋白作用于小鼠Ana-1巨噬细胞后,caspase-1p20蛋白表达量增加（P<0.01）,caspase-1p20的表达量与LPQH蛋白作用浓度成正相关。LPS+LPQH纯化蛋白作用于小鼠Ana-1巨噬细胞中,升高细胞NLRP3炎症小体主要成分NLRP3、ASC、caspase-1p20蛋白表达量（P<0.01）,同时使细胞IL-1β分泌量增加（P<0.01）。在加入高浓度KCl抑制细胞内钾离子外流,再加入LPQH纯化蛋白作用小鼠Ana-1巨噬细胞,细胞中NLRP3、ASC、caspase-1p20蛋白表达量皆有下降。LPQH纯化蛋白单独作用于小鼠Ana-1巨噬细胞后,与对照组相比,细胞IL-1β分泌量无差异（P>0.05）。LPQH及LPS+LPQH实验组与对照组相比,细胞LDH释放量无明显变化（P>0.05）。流式检测LPS+LPQH作用细胞不引起明显细胞坏死（P>0.05）,也无明显细胞凋亡出现（P>0.05）。结论:通过生物信息学初步分析了解了LPQH蛋白的相关特性。成功克隆表达纯化出目的蛋白LPQH,且经western blot鉴定该蛋白免疫反应性较好。LPQH纯化蛋白（实验浓度0.1～1.0μg/m L）作用小鼠Ana-1巨噬细胞可通过钾离子外流途径激活细胞NLRP3炎症小体,但不引起细胞凋亡和细胞坏死。
张露[9]（2020）在《基于血浆低丰度蛋白质组学的结核病新型生物标志物筛选及其评估》文中研究表明背景结核病是一种古老的疾病,考古学家从新石器时代人类的骨化石和埃及4500年前的木乃伊上就发现了脊柱结核。据世界卫生组织报道,目前全球范围内,结核病仍是十大死亡原因之一,也是主要的单一传染源。2018年,全世界估计有1000万人患有结核病,其中男性570万,女性320万,儿童110万,共有150万人死于结核病。结核病的防控与治疗对于全球的健康卫生体系仍旧是一个具有挑战性的突出问题,亟待提出新方法、新思路来解决。目前临床上迫切需要一种能够高效、准确并快速锁定结核病患者的诊断方法。目的通过结核病患者和健康对照的血浆低丰度蛋白组学分析鉴定,寻找一个结核病诊断生物标志物或者一组生物标志物组合。方法（1）对18例肺结核患者和18例健康对照的血浆去除高丰度蛋白后,使用TMT标记定量蛋白组学技术分析差异表达蛋白;（2）依靠生物信息学方法对差异表达蛋白进行蛋白注释、功能富集分析和蛋白互作网络分析;（3）根据平行反应监测（PRM）靶向蛋白组学技术特性选取适合的差异表达蛋白进行验证,通过受试者工作特征（ROC）曲线分析和留一法交叉验证（LOOCV）两种方法分别对单独生物标志物及标志物组合进行分析;（4）使用酶联免疫吸附测定（ELISA）验证方法对潜在的生物标志物做进一步验证,使用ROC曲线分析和LOOCV方法分别对单独生物标志物及标志物组合进行分析。结果（1）TMT标记蛋白质组学分析显示,在P<0.05,倍数变化>1.2或<0.8333的条件下,结核组与健康组相比,有43个上调蛋白和71个下调蛋白。在生物信息学分析中,最具有显着性的是hsa04610补体和凝血级联通路,富集了 16个差异表达蛋白。（2）使用PRM靶向质谱验证了一组具有结核病诊断潜力的7个差异表达蛋白,分别是A2M、APOA4、CFH、CFHR5、FGB、FGG和MBL2。采用ROC曲线分析和LOOCV方法对每种蛋白以及每种组合的表现进行验证。ROC分析中,CFHR5+FGB+FGG+MBL2是最优生物标志物组合,ROC曲线下面积（AUC）为0.868,敏感性为0.733,特异性为0.889。LOOCV方法分析得到最优标志物组合A（A2M+APOA4+CFHR5+FGB+FGG）有80%正确分类的原始已分组个案,70%正确分类的交叉验证已分组个案,80%正确分类的原始已分组结核个案和66.7%正确分类的交叉验证已分组结核个案。综合两种分析方法,最有潜力的候选蛋白生物标志物有A2M、APOA4、CFHR5、FGB、FGG和MBL2。（3）ELISA验证实验涉及到9个蛋白,分别是:C4d、C5a、C9、CFH、FBG（由两组 FGA、FGB、FGG 多肽链组成）、IP-10、MBL2、SAA2和SERPINA1,采用ROC曲线分析和LOOCV两种方法对9个蛋白的单独表现以及组合进行了分析验证。ROC分析结果中,MBL2和C5a在结核组与非结核组相比具有显着差异性,同时曲线下面积AUC>0.7,MBL2的诊断敏感性是0.579,特异性是0.828,C5a的诊断敏感性是0.833,特异性是0.615。在LOOCV分析中,表现最为靠前的单独分析的生物标志物仍是MBL2,有73.7%正确分类的原始已分组个案和73.7%正确分类的交叉验证已分组个案;标志物组合 1（C4d+C5a+CFH+FBG+IP-10+MBL2+SAA2+SERPINA1）是分析后综合分数最高的标志物组合,有61.4%正确分类的原始已分组个案和89.5%正确分类的交叉验证已分组个案,89.5%正确分类的原始已分组结核个案和78.9%正确分类的交叉验证已分组结核个案;标志物组合 2（C4d+C5a+C9+CFH+FBG+IP-10+MBL2+SAA2）的正确分类的交叉验证已分组个案和正确分类的交叉验证已分组结核个案是所有组合方案中得分最高的,分别是93%和84.2%。综合两种分析方法,最有潜力的候选蛋白生物标志物有C4d、C5a、C9、CFH、FBG、IP-10、MBL2、SAA2、SERPINA1。结论（1）基于TMT标记的定量蛋白质组学技术,对结核组和健康对照组的血浆低丰度蛋白进行分析,鉴定到结核组差异表达蛋白114个,其中上调蛋白43个,下调蛋白71个。（2）运用PRM靶向蛋白组学验证得到,最有潜力的结核生物标志物候选蛋白有A2M、APOA4、CFHR5、FGB、FGG和MBL2;最优的结核生物标志物组合是CFHR5+FGB+FGG+MBL2,ROC曲线下面积（AUC）为0.868,敏感性为0.733,特异性为0.889。（3）通过ELISA实验对可能的生物标志物做进一步验证得到,最有潜力的标志物候选蛋白有C4d、C5a、C9、CFH、FBG、IP-10、MBL2、SAA2 和 SERPINA1;鉴定出 2 组较为理想的结核标志物组合,分别是生物标志物组合1（C4d+C5a+CFH+FBG+IP-10+MBL2+SAA2+SERPINA1）和生物标志物组合 2（C4d+C5a+C9+CFH+FBG+IP-10+MBL2+SAA2）。（4）本论文中通过PRM靶向蛋白组学技术和ELISA两种验证方法均证实MBL2是具有显着性差异的结核生物标志物,为后续的功能探究及疾病进展研究提供了有力支持。
王颖[10]（2020）在《鸭疫里氏杆菌PhoP/PhoR双组份系统对基因表达的调控及基因岛整合酶功能研究》文中认为鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）引起的急性、接触性、败血性传染病,该病主要发生在1-8周龄的鸭,尤其是2-3周龄的雏鸭最易感。该病以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为特征,是目前危害养鸭业最为严重的细菌性传染病之一。当前已报道的RA血清型至少有21种,各个血清型之间缺乏有效的交叉保护,患病鸭因死亡率高、生长迟缓、品质下降、饲料报酬率低和治疗费用增加等,给养鸭业造成了巨大的经济损失。本课题组前期经生物信息学分析,预测RAYM＿RS09735和RAYM＿RS09740为鸭疫里氏杆菌的一对经典双组份系统（Two component system,TCS）,构建了一株鸭疫里氏杆菌YMΔRS09735/RS09740双基因缺失突变株,与亲本株相比,YMΔRS09735/RS09740突变株对雏鸭的毒力显着降低。但是该TCS对鸭疫里氏杆菌毒力的调控机制仍然不清楚。本研究的主要内容与结果如下:1. RAYM＿RS09735/RAYM＿RS09740基因缺失突变株转录组学分析及其对鸭疫里氏杆菌RA-YM株基因表达的影响转录组测序结果显示在该双组份缺失株中有112个基因上调,693个基因下调。随机挑选10个差异基因,利用荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证,结果显示荧光定量PCR结果与转录组测序结果相符,确认了RNA＿seq数据的准确性。GO富集分析表明差异表达的基因主要涉及生物过程、细胞成分和分子功能等方面。KEGG通路分析显示RAYM＿RS09740为PhoP蛋白,RAYM＿RS09735为PhoR蛋白,这表明RAYM＿RS09735和RAYM＿RS09740组成了PhoP/PhoR双组份系统,该双组份系统为革兰阴性菌中首次报道的一对新双组份系统。转录组数据分析发现缺失株中肽聚糖水解酶Nlp/P60基因的表达显着下调。利用原核表达纯化的PhoP蛋白,通过凝胶迁移实验发现PhoP蛋白在体外可以与Nlp/P60基因启动子序列结合,说明PhoP蛋白能直接调控Nlp/P60基因的表达。构建了Nlp/P60基因缺失株,雏鸭感染实验结果表明其毒力与亲本株相比下降了约1.33倍,说明Nlp/P60基因为鸭疫里氏杆菌的毒力相关基因。2. 鸭疫里氏杆菌RA-YM株phoP、phoR基因缺失突变株的构建及其对鸭疫里氏杆菌基因表达的影响采用接合转移的方法分别构建了ΔphoP、ΔphoR基因缺失突变株,二者与RA-YM亲本株在液体培养基中的生长速度无显着性差异。毒力测定结果显示亲本株RA-YM、ΔphoP、ΔphoR基因缺失株的LD50分别为3.98×104CFU、1.88×109CFU和4.22×109CFU。ΔphoP、ΔphoR基因缺失株的毒力分别较亲本株下降了约4.7×104倍和1.0×105倍。组织器官载菌量测定结果显示ΔphoP、ΔphoR基因缺失株的载菌量均较亲本株显着降低,ΔphoP、ΔphoR基因缺失株感染雏鸭后均未见明显的组织病变,说明phoP、phoR基因均与RA-YM株的毒力密切相关。通过对RA-YM株和ΔphoP、ΔphoR基因缺失株转录组差异基因比较分析,结果显示phoP基因缺失株与亲本株RA-YM相比表达差异在2倍或2倍以上的基因共186个,其中表达上调基因126个,表达下调基因60个;phoR基因缺失株与亲本株RA-YM相比表达差异在2倍或2倍以上的基因共243个,其中表达上调基因97个,表达下调基因146个。3. RAP44噬菌体整合酶介导的鸭疫里氏杆菌50K基因岛整合研究通过转录组学生物信息分析发现双基因缺失株有78个连续基因差异表达,该78个连续基因位于50Kb的基因簇区域,两端含有19bp直接重复序列,且位于t RNA-Ser下游,将该段基因簇命名为50K基因岛。通过全基因组序列比对发现鸭疫里氏杆菌RA-YM、HXb、Yb2、RA-GD、ATCC 11845、CH-3、CH-1等强毒株中均含有部分或者完整的该基因岛,且该基因岛来源于鸭疫里氏杆菌烈性噬菌体RAP44。研究发现该基因岛具有整合和外切的功能,能形成中间环化分子,其整合酶与Cre酶结构相似。利用其整合特性,构建了重组自杀整合质粒p RE112-Spec-int,通过接合转移导入鸭疫里氏杆菌,发现该整合酶介导了精确的位点特异性整合。4. 介导鸭疫里氏杆菌10K基因岛精确整合和切除整合酶的鉴定通过生物信息学分析发现鸭疫里氏杆菌标准菌株ATCC 11845除了有50K基因岛外,还存在另一个10K基因岛,但RA-YM菌株不含有该基因岛。利用10K基因岛整合酶的整合特性,通过接合转移导入RA-YM菌株构建了稳定的整合菌株,应用PCR检测发现该整合酶介导了精确的整合和外切。进一步利用该特性构建了稳定表达e GFP蛋白的鸭疫里氏杆菌RA-YM重组菌株。综上所述,本研究首次阐明了PhoP/PhoR TCS在调控鸭疫里氏杆菌基因表达中的作用,为深入研究该TCS调控鸭疫里氏杆菌毒力的机制提供了新的视角。研究并利用基因岛整合酶功能建立了鸭疫里氏杆菌稳定的遗传操作系统,为外源基因的表达和互补菌株的构建提供了新的方法,同时为鸭疫里氏杆菌基因组的水平转移和进化提供了依据。
二、结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达（论文提纲范文）
（1）结核分枝杆菌Rv0927c基因缺失株的构建及其生物学特性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 结核分枝杆菌基因敲除技术的研究进展 |
| 1 结核分枝杆菌的病原学及其致病机制 |
| 2 基因敲除技术 |
| 2.1 特异性转导法 |
| 2.2 线性DNA片段法 |
| 2.3 反选择标记法 |
| 2.4 CRISPR基因敲除法 |
| 2.5 ORBIT 法 |
| 3 结语 |
| 研究目的及意义 |
| 第一章 结核分枝杆菌Rv0927c基因缺失株的构建与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 Rv0927c基因序列的生物信息学分析 |
| 1.3 引物的设计与合成 |
| 1.4 结核分枝杆菌基因组DNA的提取 |
| 1.5 同源重组载体的构建与鉴定 |
| 1.6 Rv0927c重组噬菌体的制备与鉴定 |
| 1.7 Rv0927c基因缺失株的构建与鉴定 |
| 1.8 H37Ra△Rv0927c基因回补株的构建与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 Rv0927c基因序列的生物信息学分析 |
| 2.2 同源重组载体的鉴定 |
| 2.3 Rv0927c重组噬菌体的鉴定 |
| 2.4 Rv0927c基因缺失株的鉴定 |
| 2.5 H37Ra△Rv0927c基因回补株的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第二章 结核分枝杆菌Rv0927c基因缺失株生物学特性鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 结核分枝杆菌△Rv0927c生长曲线检测 |
| 1.3 结核分枝杆菌△Rv0927c形态学观察 |
| 1.4 结核分枝杆菌△Rv0927c抗逆性检测 |
| 1.5 结核分枝杆菌△Rv0927c生物被膜检测 |
| 1.6 结核分枝杆菌△Rv0927c药物敏感性检测 |
| 1.7 结核分枝杆菌△Rv0927c NF-κB信号通路检测 |
| 1.8 结核分枝杆菌△Rv0927c胞内存活检测 |
| 1.9 流式细胞因子表达量检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核分枝杆菌△Rv0927c的生长曲线 |
| 2.2 结核分枝杆菌△Rv0927c形态学观察 |
| 2.3 结核分枝杆菌△Rv0927c抗逆性检测结果 |
| 2.4 结核分枝杆菌△Rv0927c生物被膜特性 |
| 2.5 结核分枝杆菌△Rv0927c药物敏感性检测结果 |
| 2.6 结核分枝杆菌△Rv0927c NF-κB通路检测结果 |
| 2.7 结核分枝杆菌△Rv0927c的胞内存活 |
| 2.8 流式细胞因子表达量检测结果 |
| 3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）结核分枝杆菌细胞壁合成基因网络模块定位及功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 结核病概述 |
| 1.1.1 结核病背景与流行病学现状 |
| 1.1.2 结核病防控中面临的难题 |
| 1.1.3 结核分枝杆菌细胞壁与结核耐药的关系 |
| 1.2 结核分枝杆菌细胞壁的研究情况 |
| 1.2.1 结核分枝杆菌细胞壁的组成 |
| 1.2.2 结核分枝杆菌肽聚糖的合成 |
| 1.2.3 结核分枝杆菌阿拉伯半乳聚糖的合成 |
| 1.2.4 结核分枝杆菌,脂甘露聚糖,磷脂酰甘露糖苷和脂阿拉伯甘露聚糖的生物合成 |
| 1.2.5 结核分枝杆菌分枝菌酸的生物合成 |
| 第2章 基于生物信息学高通量筛选结核分枝杆菌细胞壁合成模块 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 结核分枝杆菌H37Rv细胞壁的合成基因数据 |
| 2.1.2 序列比对 |
| 2.1.3 结核分枝杆菌细胞壁基因必须基因筛查 |
| 2.1.4 操纵子集合筛查 |
| 2.1.5 GO富集和KEGG途径分析 |
| 2.1.6 目的基因调控网络的构建 |
| 2.1.7 ftsW基因保守性分析 |
| 2.2 数据分析结果 |
| 2.2.1 结核分枝杆菌细胞壁合成基因所在操纵子分布情况 |
| 2.2.2 结核分枝杆菌细胞壁合成基因中必须基因筛查 |
| 2.2.3 结核分枝杆菌细胞壁相关基因GO KEGG富集分析 |
| 2.2.4 结核分枝杆菌细胞壁相关基因PPI网络的建立与关键基因的筛查 |
| 2.2.5 ftsW基因生物信息学分析 |
| 2.2.6 ftsW基因保守性分析 |
| 第3章 细胞壁基因ftsW基因敲低株建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 培养方法及保存 |
| 3.2.2 过表达质粒构建 |
| 3.2.3 制备M.smegmatis mc2155感受态细胞 |
| 3.2.4 电击转化M.smegmatis mc2155感受态细胞 |
| 3.2.5 p0004s-AES质粒构建 |
| 3.2.6 phAE159-AES质粒构建 |
| 3.2.7 噬菌体制备 |
| 3.2.8 噬菌体裂解液转染待敲除菌株 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 构建四环素调控(tet-off系统)的ftsW基因过表达菌株 |
| 3.3.2 目的基因的扩增和鉴定 |
| 3.3.3 构建大肠杆菌表达菌株 |
| 3.3.4 耻垢分枝杆菌ftsW基因敲减菌株的构建 |
| 第4章 耻垢分枝杆菌基因ftsW敲低对细菌细胞壁的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 耻垢分枝杆菌ftsW敲低株,过表达株构建成功 |
| 4.2.2 耻垢分枝杆菌ftsW基因敲低株过表达株电镜观察 |
| 4.2.3 ftsW敲低后,会造成耻垢分枝杆菌生物膜形成障碍 |
| 4.2.4 ftsW敲低后,耻垢分枝杆菌菌落形态发生变化 |
| 4.2.5 ftsW表达量变化后,耻垢分枝杆菌的生长速率缓慢 |
| 4.2.6 ftsW敲低后,增强耻垢分枝杆菌在低PH下的存活能力 |
| 4.2.7 ftsW敲低后,增强耻垢分枝杆菌对SDS的耐受 |
| 4.2.8 ftsW敲低后,增强耻垢分枝杆菌对氧化压力的耐受 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）结核分枝杆菌rv1985c、rv3807c、rv1981c基因编码蛋白生物信息学分析以及间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体及菌株 |
| 1.2 样品 |
| 1.3 在线分析软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 rv1985c、rv3807c、rv1981c生物信息学分析 |
| 2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3 表达载体和表达菌株的构建 |
| 2.4 目的蛋白的诱导表达及Western blot验证 |
| 2.5 间接ELISA方法的建立 |
| 2.5.1 最佳反应条件的确定 |
| 2.5.2 阴、阳性样本临界值(cut off值)的确定 |
| 2.5.3 待检血清的检测 |
| 结 果 |
| 1 rv1985c、rv3807c和rv1981c蛋白生物信息学分析 |
| 1.1 二级结构、稳定性、跨膜结构预测及同源建模 |
| 1.2 细胞表位分析 |
| 2 目的蛋白的表达 |
| 2.1 目的基因的克隆 |
| 2.2 表达载体的构建及双酶切验证 |
| 2.3 蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.4 纯化蛋白的Western blot验证 |
| 3 间接ELISA方法的建立 |
| 3.1 最佳反应条件 |
| 3.2 阴、阳性样本临界值(cut off值) |
| 3.3 3种蛋白抗原ELISA的敏感性与特异性比较 |
| 讨 论 |
（4）结核分枝杆菌RD区蛋白EspK的表达及对巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.2.1 |
| 1.2.2 |
| 1.2.3 |
| 1.2.4 |
| 1.2.5 蛋白提取与纯化相关试剂 |
| 1.2.6 Western Blot试剂及抗体 |
| 1.2.7 制备多克隆抗体及抗体滴度 |
| 1.2.8 蛋白刺激小鼠巨噬细胞 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 引物的设计与合成 |
| 1.3.2 Rv3879c基因扩增及产物纯化 |
| 1.3.3 克隆载体构建与鉴定 |
| 1.3.4 重组蛋白的表达鉴定及纯化 |
| 1.3.5 小鼠免疫制备多克隆抗体 |
| 1.3.6 ELISA检测免疫小鼠抗体滴度 |
| 1.3.7 小鼠巨噬细胞的来源及培养方法 |
| 1.3.8 Esp K蛋白刺激小鼠巨噬细胞对Ⅰ型干扰素产生的影响 |
| 1.3.9 Pulldown实验和蛋白质谱分析Esp K蛋白相互作用蛋白 |
| 1.3.10 Esp K蛋白生物学信息学分析 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒p ET-28a-Rv3879c的鉴定 |
| 2.2 重组融合蛋白的表达及纯化 |
| 2.3 Esp K蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度检测 |
| 2.4 Esp K蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的验证 |
| 2.5 Esp K蛋白对小鼠巨噬细胞中Ⅰ型干扰素产生的影响 |
| 2.6 Esp K蛋白相互作用蛋白分析 |
| 2.7 Esp K蛋白的生物信息学分析 |
| 2.7.1 理化性质分析 |
| 2.7.2 跨膜区和信号肽分析 |
| 2.7.3 蛋白质结构分析 |
| 2.7.4 Esp K蛋白模体结构分析 |
| 3 讨论 |
（5）ASAP1介导巨噬细胞和中性粒细胞迁移参与宿主抗结核分枝杆菌感染的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 论文综述 |
| 1 结核病流行现状与疫苗预防研究进展 |
| 1.1 结核病流行现状 |
| 1.2 结核病疫苗预防研究进展 |
| 1.3 结核分枝杆菌与巨噬细胞和中性粒细胞的相互作用 |
| 2 ASAP1基因与结核病易感性的研究进展 |
| 2.1 ASAP1基因在人群中与结核病易感性的研究进展 |
| 2.2 ASAP1基因 |
| 2.3 ASAP1及其相关基因抗结核免疫应答的机制研究进展 |
| 3 斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型研究结核病易感性的研究进展 |
| 3.1 斑马鱼作为模式动物的优点 |
| 3.2 海鱼分枝杆菌 |
| 3.3 斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型研究结核病易感性的研究进展 |
| 4 本课题的研究背景及目的意义 |
| 5 论文技术路线 |
| 第二章 asap1基因敲除斑马鱼模型的构建 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 斑马鱼 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 应用q RT-PCR技术检测斑马鱼胚胎在不同发育时期的表达 |
| 2.2.2 原位杂交 |
| 2.2.3 斑马鱼asap1a与asap1b基因的生物信息学分析 |
| 2.2.4 斑马鱼asap1a与 asap1b基因的克隆 |
| 2.2.5 斑马鱼asap1a与 asap1b基因敲除载体的构建 |
| 2.2.6 斑马鱼asap1a与asap1b基因敲除突变体F0代的建立 |
| 2.2.7 斑马鱼asap1a与 asap1b基因敲除杂合突变体和纯合突变体的筛选 |
| 2.2.8 Tg(mpx:GFP;asap1a-/-;asap1b-/-)转基因斑马鱼品系的构建 |
| 2.2.9 应用斑马鱼morpholino对asap1a与asap1b基因敲低 |
| 2.2.10 Western blotting检测morpholino对斑马鱼asap1a与asap1b基因敲低效率 |
| 2.2.11 斑马鱼各突变体生存情况与表型统计 |
| 2.2.12 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 斑马鱼asap1a与 asap1b的生物信息学分析 |
| 3.2 斑马鱼asap1a与 asap1b的时空表达 |
| 3.3 CRISPR/Cas9 基因编辑中斑马鱼asap1a-g RNA与 asap1b-g RNA敲除效率检测 |
| 3.4 CRISPR/Cas9 基因编辑构建斑马鱼asap1a和 asap1b敲除突变体 |
| 3.5 斑马鱼各突变体生存情况与表型统计结果 |
| 3.6 单敲除突变体中asap1a与 asap1b基因的补偿现象 |
| 3.7 应用斑马鱼morpholino对 asap1a与 asap1b基因敲低 |
| 3.8 斑马鱼asap1a morphants,asap1b morphants和 asap1a/1b morphants的表型分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 应用斑马鱼模型探讨Asap1介导巨噬细胞、中性粒细胞迁移反应与结核病易感性关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 动物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 荧光海鱼分枝杆菌的制备 |
| 2.2.2 尾静脉注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.3 卵黄注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.4 中耳和后脑室注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.5 中性红染色法观察巨噬细胞的迁移反应 |
| 2.2.6 利用qPCR定量海鱼分枝杆菌细菌数的标准曲线建立 |
| 2.2.7 斑马鱼幼鱼RNA/DNA的共提取 |
| 2.2.8 斑马鱼结核病易感表型的回转实验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 荧光海鱼分枝杆菌 |
| 3.2 Morpholino敲低asap1 基因后鱼胚体内的细菌载量变化 |
| 3.3 Morpholino敲低asap1 基因后鱼存活率的变化 |
| 3.4 Morpholino敲低asap1 基因后巨噬细胞的迁移变化 |
| 3.5 CRISPR/Cas9敲除asap1基因后鱼胚体内的细菌载量变化 |
| 3.6 利用qPCR建立海鱼分枝杆菌细菌数定量方法 |
| 3.7 asap1敲除突变体感染海鱼分枝杆菌后的存活率分析 |
| 3.8 CRISPR/Cas9敲除asap1基因后中性粒细胞与巨噬细胞的迁移变化 |
| 3.9 细胞炎症因子的检测 |
| 4 小结与讨论 |
| 第四章 利用人单核巨噬细胞系THP1 和鼠巨噬细胞系Raw264.7 研究ASAP1 与结核病易感性的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 荧光结核分枝杆菌的制备 |
| 2.2.2 细胞培养与分化 |
| 2.2.3 Raw264.7和THP1感染结核分枝杆菌 |
| 2.2.4 ASAP1敲低的Raw264.7和THP1细胞建立 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 Western blotting |
| 2.2.7 巨噬细胞对于结核分枝杆菌的易感性分析实验 |
| 2.2.8 Transwell实验 |
| 2.2.9 免疫荧光检测细胞骨架和黏着斑变化 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 荧光结核分枝杆菌的制备 |
| 3.2 ASAP1参与Mtb感染的THP1和Raw264.7 细胞 |
| 3.3 ASAP1在THP1和Raw264.7细胞中的敲低 |
| 3.4 敲低ASAP1引起THP1和Raw264.7细胞感染Mtb后细菌载量变化 |
| 3.5 敲低ASAP1抑制巨噬细胞的迁移 |
| 3.6 敲低ASAP1 引起THP1 细胞骨架的改变 |
| 4 小结与讨论 |
| 第五章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略表 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
| 个人情况与联系方式 |
（6）牛结核病诊断技术的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文词缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛结核病简介 |
| 2 牛结核病流行病学 |
| 2.1 自然及生态因素的影响 |
| 2.2 牛结核病分子流行病学研究 |
| 3 牛结核病防控措施 |
| 4 结核病的诊断方法 |
| 4.1 结核特异性抗原蛋白研究进展 |
| 4.2 细菌学诊断方法 |
| 4.2.1 改良抗酸染色法 |
| 4.2.2 噬菌体生物扩增技术 |
| 4.2.3 分枝杆菌生长指标管 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 |
| 4.3.1 PCR检测方法 |
| 4.3.2 DNA探针检测 |
| 4.4 免疫学诊断方法 |
| 4.4.1 纯化的结核菌素皮内过敏试验 |
| 4.4.2 皮内比较过敏试验 |
| 4.4.3 IFN-测定 |
| 4.4.4 ELISA诊断方法 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 牛结核病血清学特异性诊断抗原的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 结核特异性蛋白基因在致病性分枝杆菌中的同源性分布 |
| 1.2.2 结核特异性蛋白理化分析 |
| 1.2.3 结核特异性蛋白二级结构分析 |
| 1.2.4 结核特异性蛋白跨膜结构域的预测 |
| 1.2.5 结核特异性蛋白B细胞表位预测 |
| 1.2.6 结核特异性蛋白表达菌株的复苏 |
| 1.2.7 结核特异性蛋白的表达及纯化 |
| 1.2.8 结核特异性蛋白浓度的测定 |
| 1.2.9 结核特异性蛋白Western Blot验证 |
| 1.2.10 结核特异性蛋白酶联免疫吸附试验初步筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核特异性基因在致病性分枝杆菌中的同源性分布 |
| 2.2 结核特异性蛋白理化分析 |
| 2.3 结核特异性蛋白二级结构分析 |
| 2.4 结核特异性蛋白跨膜结构域的预测 |
| 2.5 结核特异性蛋白B细胞表位分析 |
| 2.6 结核特异性蛋白的表达以及纯化 |
| 2.7 结核特异性蛋白浓度的测定 |
| 2.8 结核特异蛋白Western Blot验证 |
| 2.9 结核特异性蛋白酶联免疫吸附试验初步筛选 |
| 3 讨论 |
| 试验二 牛结核病间接ELISA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 血清来源 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计合成 |
| 1.2.2 目的基因的扩增 |
| 1.2.3 PCR产物的鉴定和纯化回收 |
| 1.2.4 目的基因与T载体的连接 |
| 1.2.5 阳性克隆菌落的PCR鉴定 |
| 1.2.6 质粒提取、T载体双酶切与片段回收 |
| 1.2.7 重组原核表达载体的构建 |
| 1.2.8 表达载体阳性克隆的菌液PCR鉴定与测序 |
| 1.2.9 重组蛋白的表达及最佳诱导时间的确定 |
| 1.2.10 蛋白的可溶性鉴定及纯化 |
| 1.2.11 纯化蛋白的浓度测定以及Western Blot验证 |
| 1.2.12 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.2.13 间接ELISA特异性和敏感性试验 |
| 1.2.14 间接 ELISA 检测临床血清样本检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核分枝杆菌基因的扩增 |
| 2.2 pMD-19T载体重组质粒构建 |
| 2.3 目的基因与原核表达载体重组构建 |
| 2.4 目的蛋白的表达及纯化 |
| 2.5 蛋白Western Blot分析 |
| 2.6 间接ELISA检测结核病抗体方法的建立 |
| 2.7 间接 ELISA 特异性试验 |
| 2.8 间接 ELISA 敏感性试验 |
| 2.9 间接 ELISA 检测牛结核病血清的阴阳性符合率 |
| 3 讨论 |
| 试验三 结核分枝杆菌实时荧光定量检测方法的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 仪器与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 菌株培养和DNA模版的制备 |
| 1.2.3 标准阳性模版的制备 |
| 1.2.4 建立SYBR Green I法实时荧光定量PCR标准曲线 |
| 1.2.5 特异性检测 |
| 1.2.6 灵敏性检测 |
| 1.2.7 模拟标本的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 引物的设计 |
| 2.2 目的基因的扩增以及重组质粒的构建 |
| 2.3 标准曲线的建立以及融解曲线的分析 |
| 2.4 荧光定量PCR的敏感性 |
| 2.5 荧光定量PCR的特异性检测 |
| 2.6 模拟样本的检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（7）基于GlnR和RegX3介导的耻垢分枝杆菌胆固醇代谢调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 分枝杆菌简介 |
| 1.1.1 分枝杆菌及其危害 |
| 1.1.2 分枝杆菌模式菌-耻垢分枝杆菌 |
| 1.2 分枝杆菌的胆固醇代谢及调控 |
| 1.2.1 胆固醇代谢 |
| 1.2.2 胆固醇转运基因簇mce4研究现状 |
| 1.3 分枝杆菌的氮代谢及其调控 |
| 1.3.1 氮源代谢同化途径及其关键酶 |
| 1.3.2 氮代谢调控 |
| 1.4 GlnR研究进展 |
| 1.4.1 GlnR简介 |
| 1.4.2 GlnR对氮代谢的调控 |
| 1.4.3 GlnR对碳代谢的调控作用 |
| 1.4.4 GlnR对磷代谢的调控作用 |
| 1.5 分枝杆菌磷代谢及其调控 |
| 1.5.1 磷源代谢同化 |
| 1.5.2 磷代谢调控 |
| 1.6 RegX3研究进展 |
| 1.6.1 RegX3简介 |
| 1.6.2 RegX3对磷代谢的调控作用 |
| 1.7 磷代谢与其他营养的交互作用 |
| 1.7.1 磷代谢与氮代谢的相互影响 |
| 1.7.2 磷代谢与碳代谢的相互影响 |
| 1.8 本论文研究的目的及意义 |
| 第2章 GlnR介导的环境氮信号对耻垢分枝杆菌中胆固醇代谢的调控机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验原理 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 菌种与质粒 |
| 2.3.2 试剂与耗材 |
| 2.3.3 实验仪器 |
| 2.3.4 培养基及溶液配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 调控蛋白靶基因预测 |
| 2.4.2 蛋白的表达与纯化 |
| 2.4.3 凝胶阻滞实验(EMSA) |
| 2.4.4 RT-qPCR实验步骤 |
| 2.4.5 ATP分析,细胞侵染实验 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 M.smegmatis GlnR直接结合kstR基因调控区 |
| 2.5.2 GlnR响应氮源信号激活kstR基因的转录表达 |
| 2.5.3 M.smegmatis GlnR通过促进kstR的表达影响胆固醇β-氧化 |
| 2.5.4 GlnR调节kstR影响巨噬细胞的生存能力 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 RegX3响应磷源信号对耻垢分枝杆菌中胆固醇转运的调控机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验原理 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 菌种与质粒 |
| 3.3.2 试剂与耗材 |
| 3.3.3 实验仪器 |
| 3.3.4 培养基及溶液配制 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 生物信息学分析 |
| 3.4.2 蛋白的表达与纯化 |
| 3.4.3 凝胶阻滞实验EMSA |
| 3.4.4 RT-PCR实验 |
| 3.4.5 生长曲线及刃天青实验 |
| 3.5 结果讨论 |
| 3.5.1 RegX3结构与功能预测 |
| 3.5.1.1 RegX3蛋白的性质分析 |
| 3.5.1.2 RegX3蛋白三级结构配体预测 |
| 3.5.1.3 RegX3蛋白氨基酸序列磷酸化位点预测 |
| 3.5.1.4 motif预测和KEGG/GO分析 |
| 3.5.2 RegX3 直接结合mce4 操纵子上游调控区 |
| 3.5.3 RegX3 响应磷源信号抑制mce4 操纵子的转录 |
| 3.5.4 RegX3是M.smegmatis利用胆固醇所必需的 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（8）结核分枝杆菌脂蛋白LPQH对小鼠Ana-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 结核分枝杆菌脂蛋白LPQH的生物信息学分析 |
| 1.1 实验方法 |
| 1.1.1 NCBI数据库基因组信息获取 |
| 1.1.2 LPQH蛋白结构和功能的生物信息学在线预测分析 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 LPQH蛋白基因组信息 |
| 1.2.2 LPQH蛋白相关理化性质分析 |
| 1.2.3 LPQH蛋白亲疏水性分析 |
| 1.2.4 LPQH蛋白跨膜及信号肽分析 |
| 1.2.5 LPQH蛋白结构分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 结核分枝杆菌脂蛋白LPQH原核表达及纯化鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及菌株 |
| 2.1.2 主要使用仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒pET-28a-LPQH的构建 |
| 2.2.2 重组质粒pET-28a-LPQH的转化 |
| 2.2.3 重组质粒pET-28a-LPQH的诱导表达 |
| 2.2.4 重组蛋白的western blot鉴定 |
| 2.2.5 重组质粒pET-28a-LPQH表达蛋白形式检测 |
| 2.2.6 包涵体重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 可溶性重组蛋白的纯化 |
| 2.2.8 重组蛋白的透析纯化 |
| 2.2.9 纯化蛋白去内毒素 |
| 2.2.10 纯化蛋白浓度检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组质粒构建检测 |
| 2.3.2 重组质粒表达检测 |
| 2.3.3 多克隆抗体的制备和效价测定 |
| 2.3.4 重组蛋白western blot检测 |
| 2.3.5 重组质粒表达蛋白形式 |
| 2.3.6 重组蛋白纯化 |
| 2.3.7 纯化重组蛋白浓度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 结核分枝杆菌脂蛋白LPQH对细胞炎症小体激活及细胞死亡的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要使用仪器和试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞处理 |
| 3.2.2 western blot检测NLRP3、ASC、caspase-1p20 蛋白表达 |
| 3.2.3 细胞IL-1β分泌量检测 |
| 3.2.4 细胞上清LDH释放量检测 |
| 3.2.5 小鼠Ana-1巨噬细胞的细胞死亡流式细胞仪检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LPQH蛋白作用小鼠Ana-1巨噬细胞对NLRP3、ASC、caspase-1p20蛋白表达的影响 |
| 3.3.2 LPQH蛋白对小鼠Ana-1巨噬细胞IL-1β分泌的影响 |
| 3.3.3 LPQH蛋白对小鼠Ana-1巨噬细胞LDH释放量的影响 |
| 3.3.4 LPQH蛋白对小鼠Ana-1巨噬细胞的细胞死亡方式影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 炎症小体在结核分枝杆菌感染中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文及成果 |
（9）基于血浆低丰度蛋白质组学的结核病新型生物标志物筛选及其评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 结核病的全球现状 |
| 1.2 我国结核病早期诊断价值及其影响 |
| 1.3 血浆低丰度蛋白在结核病中的诊断价值 |
| 2 TMT标记质谱鉴定结核血浆低丰度蛋白组学生物标志物 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样本采集标准 |
| 2.1.2 血浆样本收集 |
| 2.1.3 试剂和材料 |
| 2.1.4 去除高丰度蛋白 |
| 2.1.5 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.1.6 胰蛋白酶酶解 |
| 2.1.7 TMT标记 |
| 2.1.8 HPLC分级 |
| 2.1.9 液相色谱-质谱联用分析 |
| 2.1.10 数据库搜索 |
| 2.1.11 差异表达蛋白分析 |
| 2.1.12 生物信息学分析 |
| 2.2 结果和分析 |
| 2.2.1 血浆高丰度蛋白的去除及鉴定 |
| 2.2.2 质谱实验质量控制 |
| 2.2.3 样品重复性检验 |
| 2.2.4 差异表达蛋白分析 |
| 2.2.5 蛋白注释 |
| 2.2.6 差异表达蛋白功能富集分析 |
| 2.2.7 蛋白互作网络 |
| 2.3 讨论 |
| 3 使用PRM技术对初筛得到的生物标志物进行验证 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样本采集标准 |
| 3.1.2 血浆样本收集 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.1.4 去除高丰度蛋白及蛋白提取 |
| 3.1.5 胰蛋白酶酶解 |
| 3.1.6 PRM靶向蛋白组学 |
| 3.1.7 液相色谱-质谱联用分析 |
| 3.1.8 数据处理 |
| 3.1.9 统计分析 |
| 3.2 结果和分析 |
| 3.2.1 验证蛋白筛选 |
| 3.2.2 PRM靶向蛋白组学数据 |
| 3.2.3 LOOCV分析 |
| 3.2.4 ROC曲线分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 ELISA验证临床标本中生物标志物浓度 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 样本采集 |
| 4.1.2 临床样本收集及保存 |
| 4.1.3 试剂耗材 |
| 4.1.4 酶联免疫吸附测定 |
| 4.1.5 统计分析 |
| 4.2 结果和分析 |
| 4.2.1 筛选验证蛋白 |
| 4.2.2 ELISA实验结果 |
| 4.2.3 ROC曲线分析 |
| 4.2.4 LOOCV分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（10）鸭疫里氏杆菌PhoP/PhoR双组份系统对基因表达的调控及基因岛整合酶功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸭传染性浆膜炎概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 诊断与防治 |
| 2 鸭疫里氏杆菌毒力(相关)因子研究进展 |
| 3 双组份调控系统 |
| 3.1 PhoP/PhoQ双组份系统 |
| 3.2 PhoP/PhoR双组份系统 |
| 4 细菌基因岛研究进展 |
| 5 噬菌体与前噬菌体 |
| 6 目的和意义 |
| 第二章 RAYM_RS09735/RAYM_RS09740 基因缺失株转录组学分析及其对鸭疫里氏杆菌基因表达的影响 |
| 1 目的和意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 主要分子生物学及生化试剂 |
| 2.3 主要溶液的配制 |
| 2.3.1 抗生素类 |
| 2.3.2 培养基 |
| 2.3.3 其他缓冲液与试剂的配制 |
| 2.4 细菌的培养 |
| 2.5 实验动物 |
| 2.6 主要仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 鸭疫里氏杆菌转录组测序 |
| 3.1.1 鸭疫里氏杆菌RNA提取 |
| 3.1.2 构建转录组文库及测序分析 |
| 3.2 荧光定量PCR验证差异表达基因 |
| 3.2.1 cDNA的合成 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR |
| 3.3 鸭疫里氏杆菌转录因子phoP基因的克隆及蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.1 phoP基因的克隆 |
| 3.3.2 表达质粒pET28a-phoP的构建与鉴定 |
| 3.3.3 PhoP蛋白的诱导表达 |
| 3.3.4 SDS-PAGE |
| 3.3.5 PhoP蛋白的纯化 |
| 3.4 鸭疫里氏杆菌PhoP box序列的预测 |
| 3.5 凝胶迁移实验鉴定PhoP直接调控基因 |
| 3.5.1 生物素标记的启动子片段的扩增 |
| 3.5.2 凝胶迁移实验(EMSA) |
| 3.6 鸭疫里氏杆菌Nlp/P60基因缺失株的构建 |
| 3.6.1 引物设计 |
| 3.6.2 RA-YM Nlp/P60 基因左右臂的扩增 |
| 3.6.3 壮观霉素抗性基因(Spec)的扩增 |
| 3.6.4 Overlap PCR扩增连接 |
| 3.6.5 阳性克隆的鉴定 |
| 3.6.6 重组自杀性质粒p RE112-Nlp/P60-LSR的构建 |
| 3.6.7 Nlp/P60基因缺失株的构建 |
| 3.6.8 Nlp/P60基因缺失株及其筛选鉴定 |
| 3.7 Nlp/P60基因缺失株生物学特性的研究 |
| 3.7.1 Nlp/P60基因缺失株遗传稳定性分析 |
| 3.7.2 Nlp/P60基因缺失株生长曲线的测定 |
| 3.8 Nlp/P60 基因缺失株对雏鸭LD50的测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 差异表达基因的功能及GO富集分析 |
| 4.2 多种细菌PhoP/PhoR双组份系统进化分析 |
| 4.3 PhoP蛋白的表达与纯化 |
| 4.4 EMSA验证PhoP直接结合Nlp/P60 基因启动子 |
| 4.5 Spec基因、Nlp/P60 基因同源臂的扩增 |
| 4.6 △Nlp/P60基因缺失株的构建及鉴定 |
| 4.7 △Nlp/P60基因缺失株生长特性的研究 |
| 4.8 △Nlp/P60基因缺失株对雏鸭致病性的研究 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 phoP、phoR基因缺失株的构建及其对鸭疫里氏杆菌基因表达的影响 |
| 1.目的和意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 主要分子生物学及生化试剂 |
| 2.3 菌株、质粒和实验动物 |
| 2.4 细菌的培养 |
| 2.5 实验动物 |
| 2.6 主要仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 引物设计 |
| 3.2 phoP与 phoR基因缺失株自杀质粒的构建 |
| 3.2.1 RA-YM phoP与 phoR基因左右臂的扩增 |
| 3.2.2 壮观霉素抗性基因(Spec)的扩增 |
| 3.2.3 Overlap PCR扩增连接 |
| 3.2.4 重组自杀性质粒p RE112-LSR的构建 |
| 3.3 phoP和 phoR基因缺失株的构建及其筛选鉴定 |
| 3.3.1 phoP和 phoR基因缺失株的构建及其筛选 |
| 3.3.2 phoP和 phoR基因缺失株PCR鉴定 |
| 3.4 phoP和 phoR基因缺失株生物学特性的测定 |
| 3.4.1 phoP和 phoR基因缺失株遗传稳定性分析 |
| 3.4.2 phoP和 phoR基因缺失株生长曲线的测定 |
| 3.5 phoP和 phoR基因缺失株对雏鸭致病性分析 |
| 3.5.1 phoP和 phoR基因缺失株LD50的测定 |
| 3.5.2 感染雏鸭组织和血液载菌量测定 |
| 3.5.3 感染雏鸭病理切片制作 |
| 3.6 phoP和 phoR基因缺失株转录组测序分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 phoP和 phoR基因缺失株的构建 |
| 4.1.1 壮观霉素抗性基因、phoP和 phoR基因同源臂的扩增 |
| 4.1.2 RA-YM phoP和 phoR基因缺失质粒的构建与鉴定 |
| 4.1.3 phoP和 phoR基因缺失株的构建及鉴定 |
| 4.2 phoP和 phoR基因缺失株生长特性的研究 |
| 4.3 phoP和 phoR基因缺失株对雏鸭致病性的研究 |
| 4.3.1 phoP和 phoR基因缺失株LD50测定 |
| 4.3.2 phoP和 phoR基因缺失株血液组织载菌量的测定 |
| 4.3.3 phoP和 phoR基因缺失株病理切片观察 |
| 4.4 phoP和 phoR基因缺失株转录组学分析 |
| 4.4.1 转录组测序质量 |
| 4.4.2 phoP、phoR基因缺失株与亲本株差异表达基因 |
| 4.4.3 phoP和 phoR基因缺失株与亲本株差异表达基因分析 |
| 4.4.4 phoP和 phoR基因缺失株与亲本株差异基因GO富集分析 |
| 4.4.5 差异基因KEGG富集分析 |
| 5.讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 RAP44噬菌体整合酶介导的鸭疫里氏杆菌50K基因岛整合 |
| 1.目的和意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 主要分子生物学及生化试剂 |
| 2.3 主要溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 鸭疫里氏杆菌ATCC11845基因岛的预测 |
| 3.2 比较分析鸭疫里氏杆菌50K基因岛 |
| 3.3 50K基因岛整合与外切 |
| 3.4 自杀性重组质粒与R.anatipestifer的整合 |
| 4 结果 |
| 4.1 50K基因岛与RAP44噬菌体的比较分析 |
| 4.2 鸭疫里氏杆菌50K基因岛结构分析 |
| 4.3 50K基因岛整合与外切 |
| 4.4 噬菌体RAP44整合酶介导自杀载体在鸭疫里氏杆菌中整合 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 介导鸭疫里氏杆菌10K基因岛精确整合和切除整合酶的鉴定 |
| 1 目的和意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 主要分子生物学及生化试剂 |
| 2.3 主要溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 鸭疫里氏杆菌10KGI全基因组比较分析 |
| 3.2 PCR验证10K GI整合岛的整合与外切反应 |
| 3.3 包含整合酶与附着位点的自杀整合质粒的构建 |
| 3.4 重组自杀性载体与R.anatipestifer的整合 |
| 3.5 整合酶介导的eGFP在鸭疫里氏杆菌中的表达 |
| 4 结果 |
| 4.1 鸭疫里氏杆菌10K基因岛的分析 |
| 4.2 鸭疫里氏杆菌10KGI的整合与外切 |
| 4.3 10K基因岛整合酶介导的整合与外切 |
| 4.4 整合酶介导的鸭疫里氏杆菌RA-YM外源基因表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达（论文参考文献）
- [1]结核分枝杆菌Rv0927c基因缺失株的构建及其生物学特性鉴定[D]. 王海宁. 扬州大学, 2021(08)
- [2]结核分枝杆菌细胞壁合成基因网络模块定位及功能分析[D]. 罗西子. 吉林大学, 2021(01)
- [3]结核分枝杆菌rv1985c、rv3807c、rv1981c基因编码蛋白生物信息学分析以及间接ELISA方法的建立[J]. 杨航,努尔塞力克·努素甫,杨亚军,姬祥,马忠臣,张萍,曹旭东,陈创夫. 中国病原生物学杂志, 2021(02)
- [4]结核分枝杆菌RD区蛋白EspK的表达及对巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生的影响[J]. 钟燕霄,刘丽莎,刘敏,潘勤,章晓联,罗凤玲. 武汉大学学报(医学版), 2021(05)
- [5]ASAP1介导巨噬细胞和中性粒细胞迁移参与宿主抗结核分枝杆菌感染的研究[D]. 崔佳. 山西大学, 2020(03)
- [6]牛结核病诊断技术的建立与初步应用[D]. 杨航. 石河子大学, 2020(01)
- [7]基于GlnR和RegX3介导的耻垢分枝杆菌胆固醇代谢调控机制研究[D]. 马衡. 石河子大学, 2020(05)
- [8]结核分枝杆菌脂蛋白LPQH对小鼠Ana-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活作用研究[D]. 刘丽婷. 大理大学, 2020(05)
- [9]基于血浆低丰度蛋白质组学的结核病新型生物标志物筛选及其评估[D]. 张露. 武汉轻工大学, 2020(06)
- [10]鸭疫里氏杆菌PhoP/PhoR双组份系统对基因表达的调控及基因岛整合酶功能研究[D]. 王颖. 华中农业大学, 2020