一、免疫途径及载体对乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究(摘要)（论文文献综述）
周子超[1]（2019）在《生长抑素DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）对于育肥猪的生产性试验研究》文中进行了进一步梳理前期研究表明,基因免疫生长抑素可以促使动物产生抗生长抑素（SS）抗体并中和内源性的生长抑素,阻断生长抑素与其受体作用,促进生长激素、胰岛素样因子-1等多种激素的分泌释放,从而促进动物的生长,改善动物的生产性能。本实验室已构建荷载pVGS/2SS-asd的减毒猪霍乱沙门氏菌活载体非抗性DNA疫苗,具备制备成本低、操作方法易、安全性好等优点,并在多种动物的临床试验中取得较好的促生长效果。对肉猪的临床试验,已完成小试与中试研究,亟需开展生产性试验,为申请转基因生物安全评定和新兽药申报及生产应用提供科学依据。本研究将实验室所保存鉴定正确的pVGS/2SS-asd电转化至ΔasdΔcrp双缺失减毒猪霍乱沙门氏菌C500株制备荷载pVGS/2SS-asd减毒猪霍乱沙门氏菌活载体DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）（以下简称生长抑素DNA疫苗）并鉴定其稳定性,筛选得到最佳代次的基因工程菌作为疫苗用于免疫接种育肥猪。随后重点观察受试动物免疫应答反应、日增重、背膘厚度和背最长肌肉质,并进行抗体水平与相关性状的关联分析,从促生长和改善肉质角度综合评价疫苗的效果。此外,检测接种疫苗后猪的体温变化、猪舍周边环境中工程菌的扩散情况及出栏屠宰后组织中外源基因的整合情况和组织病理学变化,旨在评价疫苗的安全性。主要研究内容和结果如下:1.生长抑素DNA疫苗工程菌的扩大培养与稳定性将实验室保存的pVGS/2SS-asd质粒,扩增后经双酶切和测序鉴定后,电转化至ΔasdΔcrp双缺失减毒猪霍乱沙门氏菌C500株,制备生长抑素DNA疫苗工程菌C500（pVGS/2SS-asd）。将制备正确的工程菌连续培养10、20、30、40、50与60代后,用PCR方法检测疫苗工程菌的关键基因,发现连续培养60代的工程菌中关键基因GS/2SS、Δasd、invA与Δcrp均稳定存在,提示疫苗工程菌在培养过程中具备良好的遗传稳定性,质粒不丢失,具备侵染性,毒力不返强。用LB培养基恒温振荡培养各代疫苗菌24h,每隔1h取样测定OD 600吸光值并绘制各代疫苗菌生长曲线,发现各代疫苗菌生长至第5h开始进入对数期,第10h进入稳定期,12h达到最大值,菌量显着高于其他代次疫苗菌（P<0.05）。提示第20、30代疫苗菌长势均优于其他代次疫苗菌,是疫苗发酵制备的最佳代次。2.生长抑素DNA疫苗免疫育肥猪的免疫应答反应选择50日龄DLY三元杂交猪147头,分为4组,在65日龄时分别接种（鼻饲）高(4.5×1010,n=39)、中（4.5×109CFU,n=35）、低（4.5×108CFU,n=35）剂量的生长抑素DNA疫苗工程菌和PBS（n=38,阴性对照）。鼻饲接种每日两次,连续三日;45d后加强免疫一次。收集血液,分离血清后采用ELISA方法测定抗SS抗体、相关激素和免疫细胞因子水平。结果显示:三种免疫剂量均能诱导机体产生抗体,首次免疫后高、中、低剂量组的抗体阳性率分别为30.77%、37.14%、40.0%;出栏时上述各组的抗体阳性率分别为20.51%、14.29%和20.0%。与抗体阴性组相比,抗体阳性组血中GH、IGF-1、IL-4和IFN-γ含量升高,但统计差异不显着（P>0.05）。3.生长抑素DNA疫苗免疫育肥猪的促生长效果各组试验猪分别在首次免疫后45d（110日龄）和出栏时（185日龄）逐头称重,结果显示;免疫组全期平均日增重（0.72±0.01 kg/d）显着（P<0.05）高于对照组（0.69±0.01 kg/d）。分析不同时间段的促生长效果,发现在50110日龄期间,免疫组平均日增重（0.73±0.01 kd/d）显着（P<0.05）高于对照组（0.69±0.01 kd/d）,但在110185日龄期间,免疫组的平均日增重（0.72±0.01 kg/d）虽然高于对照组（0.69±0.01kg/d）,但统计差异不显着（P>0.05）。比较剂量关系,发现低剂量组在实验全期的平均日增重（0.73±0.01 kg/d）最高。分析抗体阳性组的促生长效果及抗体水平与促生长的关系,发现抗体阳性组各期平均日增重均显着高于抗体阴性组（P<0.05）,抗体阳性组在50110日龄的平均日增重提高15.14%,在110185日龄期间提高4.33%,全期增重提升9.75%。全期平均日增重与各时期抗体水平呈显着正相关（r=0.396,r=0.446）。4.生长抑素DNA疫苗免疫育肥猪对肉质的改善在185日龄逐头测定背膘厚度,发现抗体阳性组背膘厚度与110日龄抗体水平呈显着负相关（r=-0.406）。屠宰后分析背最长肌肉质,发现抗体阳性猪肌内脂肪显着低于抗体阴性组（P<0.05）,其他肉质指标与抗体阴性组无统计差异（P>0.05）。5.生长抑素DNA疫苗的安全性评定分别于疫苗接种后第1、3、5、7、10、12、15d测定各试验猪体温并观察行为反应,发现接种前后体温无明显变化（P>0.05）;试验猪的精神、采食和排便等情况也无异常变化。在接种后第3、5、7、10、15、30d,分别采集试验畜舍东西南北1、3、5m和通风口7m处土样,及试验栏内水样、粪样进行DNA疫苗融合片段GS/2SS PCR扩增,发现在第5日水样与第3和5日粪样中检测到重组片段,但在第5日后的样品中均未再次检测到重组片段。屠宰后采集所有试验猪的血液样品和抗体阳性个体的肌肉、肺、肝组织样品,提取基因组DNA后进行DNA疫苗融合片段GS/2SS的扩增,结果显示在PCR灵敏度范围内所有样品中均未检测到目的基因条带。对抗体阳性个体肌肉、肺、肝组织样品制作HE组织学切片并进行观察,并未发现病理学变化。
杜玮[2]（2018）在《Myostatin DNA疫苗及前肽蛋白免疫动物对肌肉生长的影响》文中研究指明Myostatin,肌肉生长抑制素,是肌肉生长发育的抑制因子。本研究针对Myostatin前肽和成熟肽分别制备拮抗剂与疫苗,从细胞和动物个体水平验证这两种生物制剂对绵羊骨骼肌发育的影响。主要研究内容及结果如下:1.绵羊Myostatin前肽对成肌细胞分化的作用。构建和包装Myostatin前肽过表达慢病毒载体,制备慢病毒,分别用慢病毒感染C2C12细胞,检测Myostatin前肽对C2C12细胞分化的影响。结果对照组和试验组肌管融合率分别为5.62%和9.38%,试验组的肌管融合率显着高于对照组（P<0.05）。结果表明Myostatin前肽基因的过表达可能抑制了Myostatin,从而促进了肌管的形成。2.Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中的表达。根据毕赤酵母密码子的偏嗜性及Myostatin前肽蛋白特定位点突变后生物学活性增强的特性,完成对羊Myostatin前肽基因序列的密码子优化,并将第76位的天冬氨酸（Asp）突变成丙氨酸（Ala）。将修饰后的Myostatin前肽基因克隆至酵母表达载体pPIC9K,构建酵母表达重组质粒pPIC9K-Msp。用电转化把重组质粒转入毕赤酵母GS115中,通过G418的抗性加压筛选得到高拷贝的转化子,经甲醇诱导、SDS-PAGE及Western-bolt分析,证实Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中获得了表达,产物大小约28KD,与预期大小相符。3.Myostatin前肽蛋白在大肠杆菌中的表达。设计含有SalⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物,扩增密码子优化且第76位天冬氨酸突变为丙氨酸的Myostatin前肽基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,测序后经SalⅠ和BamHⅠ双酶切,将目的片段插入到原核表达质粒pMAL/c5x的多克隆位点,构建麦芽糖结合蛋白（MBP）与突变型Myostatin前肽基因的融合表达质粒pMAL/c5x-sMSTNProM。将重组表达质粒转化DH5α感受态细胞,筛选并鉴定的阳性重组菌经IPTG诱导表达了可溶性的融合蛋白,SDS-PAGE电泳结果表明该重组目的蛋白大小约为75KD,与预期大小相符。该蛋白的成功表达为后续的动物试验奠定了基础。4.Myostatin前肽蛋白对羔羊肌肉生长的影响,由于Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中的表达量低,无法满足动物试验要求,因此本次免疫中选择在大肠杆菌中大量表达突变型Myostatin前肽蛋白免疫绵羊。选择7日龄左右的阿勒泰羔羊10只,随机分为2个组（试验组和对照组各5只）,试验羔羊平均体重经过统计分析差异不显着,试验组注射突变型Myostatin前肽蛋白,注射剂量为0.5ml/只（Myostatin前肽蛋白浓度800μg/ml）,对照组注射相同剂量的PBS,自试验羔羊7日龄开始进行肌肉注射,整个试验期共注射三次,每次间隔一周,试验期间测定试验羔羊生长发育,饲喂至4月龄进行屠宰,取腓肠肌样品进行H&E染色,观察肌纤维的直径大小,Realtime-PCR检测Myostatin信号通路相关基因的表达。结果试验组羔羊体重、腿围、优质肉块重量（股二头肌、腓肠肌、半腱肌、股外侧肌）与对照组相比均无显着性差异;试验组平均单个肌束肌纤维细胞横断面积为1163.01μM2,显着大于对照组的845.09μM2（P<0.05）;试验组Myostatin、Smad3、p21表达量均低于对照组,而Myf5、MyoD、Myogenin的表达量均高于对照组,其中MyoD的表达量显着高于对照组（P<0.05）。实验结果表明Myostatin前肽蛋白对Myostatin起到了抑制作用,促进了肌肉生长。5.Myostatin成熟肽核酸疫苗的制备及对小鼠肌肉生长的影响。利用人工合成DNA的方法获得了密码子优化的乙肝表面抗原（HBsAg S）基因和羊Myostatin成熟肽的融合基因片段SM,将该融合基因SM克隆至基因疫苗专用载体pVAX1中,构建pV-SM重组质粒,并在BALB/c小鼠进行动物试验。选择出生20天左右、体重13-15g的雌性BALB/c小鼠20只,随机分成2个组（试验组和对照组各1个）试验组免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗,共计免疫三次,每次免疫间隔一周,每次免疫剂量25μl（Myostatin成熟肽核酸疫苗浓度800μg/ml）,对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水。试验期间测定试验小鼠体重,饲喂75天取腓肠肌样品进行H&E染色,测定肌纤维直径以及抗体水平,并利用Realtime-PCR检测Myostatin信号通路下游及相关基因的表达。结果显示:试验组小鼠平均胴体重10.82±0.55g,显着高于对照组的8.28±0.29g（P<0.05）;试验组平均单个肌纤维横断面面积为1257.43±58.48μM2,极显着的大于对照组的988.48±44.97μM2（P<0.01）;试验组Myf5、MyoD、Myogenin的表达量均显着高于对照组（P<0.05）,Myostatin、Smad3表达量低于对照组,但经过统计分析,差异不显着（P>0.05）。6.Myostatin成熟肽核酸疫苗对羔羊肌肉生长的影响。将7日龄阿勒泰母羔羊20只随机分为2个组,试验组和对照组各10只,试验组平均体重7.75±0.52kg,对照组7.88±0.63kg,经过统计分析差异不显着（P>0.05）。试验组免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗,共免疫三次,每次免疫间隔一周,每次免疫剂量0.5ml（Myostatin成熟肽核酸疫苗浓度800μg/ml）,对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水。试验期间测定试验羔羊体重,饲喂155日龄进行屠宰,取腓肠肌样品进行H&E染色,测定肌纤维直径及抗体水平,并利用Realtime-PCR检测Myostatin信号通路下游及相关基因的表达。结果显示:羔羊饲喂至155日龄时,试验组平均体重高于对照组,但经过统计分析差异不显着（P>0.05）;试验组平均胴体重为12.94±0.67kg,显着高于对照组的10.55±0.84kg（P<0.05）;试验组平均单个肌纤维横断面积为815.00±12.67μM2,极显着高于对照组469.61±8.05μM2（P<0.01）;试验组Myostatin的表达量极显着低于对照组（P<0.01）;试验组Smad3的表达量显着低于对照组（P<0.05）;试验组MyoD的表达量显着高于对照组（P<0.05）;试验组其他各项指标Myf5、Myogenin、p21的表达量均高于对照组,但统计分析差异不显着（P>0.05）。结论:成功制备了突变型Myostatin前肽蛋白和Myostatin成熟肽核酸疫苗,并完成细胞分化和动物试验,证实了Myostatin前肽蛋白和Myostatin成熟肽核酸疫苗能抑制Myostatin的功能,具有促进动物肌肉生长的作用或趋势。
霍春玲[3]（2017）在《肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究》文中提出手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）是一种严重危害婴幼儿健康的重要传染病,主要由肠道病毒感染引起。流行病学研究证实,引起婴幼儿手足口的肠道病毒主要包括肠道病毒71（enterovirus 71,EV71）和柯萨奇病毒A16（coxsackievirus A16,CA16）两种亚型。两种亚型毒株同时感染可能诱发严重的并发症甚至死亡。EV71和CA16共存在或共感染时可导致重组毒株出现,引起爆发流行,是严重的公共卫生问题之一。因此,研制抗EV71和CA16疫苗对于有效防控HFMD疫情的暴发流行至关重要。近年来,病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）疫苗因其展示抗原和安全性高等优点成为新型疫苗的发展方向之一,人乳头瘤病毒和乙肝病毒等的病毒样颗粒疫苗已成功上市。嵌合多抗原表位的VLPs疫苗研发正在取得积极进展。本论文基于乙型肝炎病毒核心（HBc）的自组装能力,制备了以HBc为载体蛋白展示了 EV71和CA16的多个保守抗原表位的嵌合病毒样颗粒（VLPs）。以小鼠为模型,对VLPs的免疫原性、抗EV71或CA16感染的保护进行评价;基于EV71 P1和3CD在杆状病毒表达系统中共表达可自主切割包装成病毒样颗粒,设计了一种新型重组嵌合肠病毒VLPs,分别将CA16的单个或多个主要抗原表位替换EV71对应区域,研究了EV71和CA16抗原表位的嵌合表达及对VLPs自组装特性的影响,后续将评价嵌合VLPs诱导的抗EV71和CA16感染的免疫保护。主要研究结果包括:1.以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白（tHBc）为载体蛋白,将EV71的保守抗原表位SP70和CA16 VP1蛋白保守中和表位PEP91融合片段插入HBc肽段的Asn75与Ser81残基之间,获得了融合片段tHBc/SP;然后将EV71编码VP2蛋白的CD4+ T细胞优势抗原表位A3融合在tHBc/SP的C端,获得了融合片段tHBc/SPA;以未插入外源基因的tHBc作为对照,将tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc三种基因片段分别克隆到大肠杆菌表达载体pET28中,构建重组表达质粒ptHBc/SP、ptHBc/SPA和ptHBc。转化大肠杆菌,筛选用于病毒样颗粒疫苗生产的工程菌株;经优化条件,高效表达了融合蛋白tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc。通过分离变性包涵体、亲和层析纯化融合蛋白和体外复性等实验,制备了高纯度的VLPs。2.以BALB/c小鼠为动物模型,对两种嵌合病毒样颗粒tHBc/SPA和tHBc/SP诱导的免疫应答和抗病毒感染免疫效力进行评估。结果显示,tHBc/SPA和tHBc/SP两种VLPs免疫小鼠均可诱导针对EV71和CA16的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。与灭活EV71相比,嵌合VLPs诱导Th1细胞因子显着升高,Th2细胞因子降低。用嵌合VLPs免疫母鼠诱导针对子代新生小鼠抗EV71致死感染的完全免疫保护效应和抗CA16致死感染的部分保护。共表达CD4+ T细胞表位没能提高嵌合VLPs在小鼠中的抗病毒效力。3.对杆状病毒表达系统进行优化改造,将巨细胞病毒（CMV）的启动子替换转移质粒pFBDM中的p10启动子驱动3CD基因、降低3CD的表达,减少p10控制3CD表达时与pH启动子驱动的P1表达存在的竞争以提高VLPs产量,获得重组转移质粒pFBDM P1-C3CD。将CA16 SP70单独替换EV71对应片段,构建重组转移pFBDM P1/SP70-C3CD;通过将CA16-SP70、VP2136-150、VP3176-190和VP448-62 同时替换EV71 相应片段,构建重组转移质粒pFBDM P1/4M-C3CD。转化宿主大肠杆菌DH1OMultiBac使四种重组转移质粒发生转座,提取同源重组产生的杆状病毒基因组Bacmid,分别转染昆虫细胞Sf9拯救重组杆状病毒 BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD 和 BacP1/4M-C3CD。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组嵌合目的均高效表达;利用昆虫细胞大量培养和重组病毒接种,表达目的蛋白,经过超速离心、凝胶过滤层析和超滤纯化浓缩,制备了高纯度组分。经电镜观察三种重组杆状病毒感染Sf9细胞均生产VLPs。后续将进行嵌合VLPs疫苗的抗EV71和CA16致死感染的免疫效力评价。我们的研究成果为研制抗EV71和CA16感染的VLPs的新型疫苗奠定了重要基础。
刘青[4]（2016）在《抑制素基因疫苗免疫杂交水牛的方法学和安全性研究》文中进行了进一步梳理前期研究表明,抑制素基因免疫通过中和内源性抑制素,可促进FSH的分泌,进而促进卵泡发育和排卵,提高动物繁殖性能。本实验室构建了以减毒沙门氏菌为载体的抑制素基因疫苗C501（pVAX-asd-IS）,其制备简便,便于扩大生产。在免疫小鼠后,提高了其大卵泡的数量和产仔数。且该疫苗没有抗生素抗性基因,不会造成抗生素危害,有利于在大动物上的推广应用。但在不同的物种中,抑制素基因免疫的效果也受到免疫接种途径、免疫剂量和免疫次数等因素的影响。且在临床应用和环境释放的安全性方面,特别是在水牛临床试验的安全性方面尚未研究。因此,本研究分别分析了抑制素基因疫苗肌注免疫的剂量和鼻饲免疫的天数,对杂交水牛在繁殖季节的卵泡发育、发情排卵和受胎的影响。挑选出免疫效果最佳的免疫剂量和天数,再比较以上两种免疫途径对杂交水牛在非繁殖季节的卵泡发育、发情排卵和受胎的影响。分析抑制素基因疫苗在繁殖季节和非繁殖季节应用于杂交水牛的促卵泡生长发育和排卵的效果,并从水牛临床应用和环境释放角度,分析抑制素基因疫苗的安全性,为促进抑制素基因疫苗的推广应用和优化提高杂交水牛繁殖性能的新技术奠定了基础,主要研究内容与结果如下:1.抑制素基因疫苗肌肉注射剂量对杂交水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响选择158头杂交水牛分为四组,其中免疫组T1（n=41）、T2（n=37）和T3（n=37）分别注射1010、109和108 CFU/ml的抑制素重组菌C501（pVAX-asd-IS）,10ml/头,对照组（n=43）注射PBS,初次免疫为第0天,加强免疫在第14天。所有牛只在第28天肌肉注射孕马血清促性腺激素（PMSG）1000IU,第30天注射氯前列腺素（PGF2ɑ）0.5mg,48小时后注射200μg促性腺激素释放激素（GnRH）。进行B超检测,记录卵泡发育和排卵情况。结果显示肌肉注射免疫抑制素重组菌C501（pVAX-asd-IS）后,各免疫组杂交水牛均能产生抗抑制素IgG抗体,以1010 CFU/ml剂量组的抗体水平最高。1010 CFU/ml剂量组的大卵泡（≥10mm）和排卵卵泡的数量与直径显着（P<0.05）高于对照组,且优势卵泡的生长速度显着高于108 CFU/ml剂量和对照组（P<0.05）。抗体阳性组的发情、排卵和受胎率显着高于抗体阴性组。以上结果说明以1010 CFU/ml的抑制素重组基因疫苗C501（pVAX-asd-IS）肌肉注射免疫杂交水牛,能显着促进卵泡的生长发育,促进杂交水牛的发情和排卵,提高其繁殖性能。2.抑制素基因疫苗鼻饲免疫天数对杂交水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响选择134头杂交水牛分为4组:免疫5天组（n=34）、免疫3天组（n=35）和免疫1天组（n=31）分别用1010 CFU/ml C501（pVAX-asd-IS）疫苗连续鼻饲免疫5、3和1天,10ml/头,每天喷鼻两次。对照组（n=34）使用10ml PBS鼻饲免疫5天。所有牛只初次免疫为第0天,加强免疫在第14天。且在第28天注射促性腺激素释放激素（GnRH）200μg,第35天注射氯前列腺素（PGF2α）0.5mg,第37天再次注射促性腺激素释放激素（GnRH）200μg,在之后的18和24小时进行人工授精。B超检测记录卵泡发育和排卵情况。结果显示在初次免疫后的14和28天,鼻饲免疫C501（pVAX-asd-IS）能引起显着的免疫反应,免疫5天组的抗抑制素IgG抗体水平显着高于免疫1天组（P<0.01）。且加强免疫后抗体水平有上升的趋势。在二次注射GnRH后,免疫5天组的优势卵泡增长速度显着快于对照组和免疫1天组,且免疫5天组的大卵泡（≥10mm）和排卵卵泡的数量和直径高于其他各组,使得免疫5天组有较高的发情、排卵和受胎率。结果表明,以抑制素重组基因疫苗C501（pVAX-asd-IS）鼻饲免疫5天,能显着促进水牛的卵泡生长和发情排卵,与Ovsynch-TAI相结合,可提高杂交水牛在繁殖季节的受胎率。3.抑制素基因疫苗两种免疫途径对杂交水牛在非繁殖季节的卵泡发育和发情排卵及受胎的影响选取81头经产杂交水牛随机分为三组:肌肉注射组（n=29）肌注1010 CFU/ml抑制素重组菌苗C501（pVAX-asd-IS）,10ml/头,每天一次,免疫3天;鼻饲免疫组（n=27）鼻饲1010 CFU/ml抑制素重组菌苗C501（pVAX-asd-IS）,10ml/头,每天两次,免疫5天;对照组C（n=25）每头肌肉注射10ml PBS,每天一次,共注射5天。初次免疫为第0天,加强免疫在第14天。全体牛只在第28天肌肉注射孕马血清促性腺激素（PMSG）1000IU,第30天注射氯前列腺素（PGF2ɑ）0.5mg,48小时后注射200μg促性腺激素释放激素（GnRH）。B超检测记录卵泡发育和排卵情况。研究结果显示以肌肉注射和鼻饲免疫杂交水牛,均能诱导机体产生抗抑制素抗体,且两种免疫方式的抗体水平差异不显着。但肌肉注射组的抗体阳性率高于鼻饲免疫组（82.8%vs.74.1%）。两种免疫方式均能增加大卵泡和排卵卵泡的数量和直径,以肌肉注射的效果较强。在非繁殖季节,肌肉注射组杂交水牛的发情、排卵和受胎率均高于鼻饲免疫组和对照组,且与繁殖季节的发情、排卵和受胎率相当。抗体阳性牛的受胎率也显着高于抗体阴性牛（56.8%vs.27.0%;P<0.01）。结果表明,以肌肉注射和鼻饲免疫抑制素基因疫苗C501（pVAX-asd-IS）均能诱导良好的免疫反应,但以肌肉注射的免疫效果更优,能显着增加成熟卵泡的数量和直径,提高杂交水牛在非繁殖季节的发情,排卵和受胎率。4.抑制素基因疫苗的生物安全性评价选用81头经产杂交水牛随机分为三组:肌肉注射组（n=29）肌注1010 CFU/ml抑制素重组菌苗C501（pVAX-asd-IS）,10ml/头,每天一次,免疫3天;鼻饲免疫组（n=27）鼻饲1010 CFU/ml抑制素重组菌苗C501（pVAX-asd-IS）,10ml/头,每天两次,免疫5天;对照组C（n=25）每头肌肉注射10ml PBS,每天一次,共注射5天。初次免疫为第0天,加强免疫在第14天。对免疫后杂交水牛的体温和心率进行监测,并对粪便、水和土壤样本进行采集,用PCR方法检测inv A基因。结果表明各组杂交水牛在免疫后未出现临床症状,其体温和心率正常。在粪便、水和土壤样本中均未检测到inv A目的基因。说明以肌肉注射和鼻饲免疫抑制素重组菌苗,在杂交水牛上的运用是安全的,且重组菌苗不会通过牛体向外界传播,对环境不会产生不利影响。
李文芳[5]（2016）在《C.sinensis与HBV相互作用及EBOV的DNA疫苗免疫保护作用研究》文中进行了进一步梳理I.华支睾吸虫与乙型肝炎病毒感染的相互作用华支睾吸虫病（Clonorchiasis）是由华支睾吸虫（Clonorchis sinensis,C.sinensis）寄生于人体肝胆管内所引起的人兽共患病,是我国重要的食源性寄生虫病,人因食入含有华支睾吸虫活囊蚴而感染,全球约有3500万人感染华支睾吸虫,其中约1249万人分布在中国。华支睾吸虫的感染可导致胆囊炎、胆管炎、肝纤维化甚至肝胆管癌和原发性肝细胞癌,相关的研究显示华支睾吸虫是原发性肝细胞癌的发生过程中不可忽略的诱发因素之一。乙型肝炎病毒感染呈全球性分布,是世界范围内重要的公共健康问题,尽管现在乙肝疫苗较为普及,全球约有3.5亿人是乙肝病毒携带者,其中我国近1亿人为无症状表面抗原携带者,人在感染乙肝病毒后,30%-50%发展成为慢性乙肝,进而发展成肝硬化,甚至肝癌。这两种疾病都会对肝脏造成损伤,最终有可能发展成肝细胞癌。相关流行病学调查显示在华支睾吸虫病高度流行区域的HBs Ag表面抗原阳性率远远高于华支睾吸虫病非流行区域,但是目前关于华支睾吸虫感染与乙型肝炎病毒感染的相互关系尚不明确。因此本研究首先分析合并华支睾吸虫与乙肝病毒感染患者与单纯乙肝病毒感染患者及单纯华支睾吸虫病感染患者在肝脏受损程度上是否在差异,并分析合并华支睾吸虫感染对乙肝患者抗病毒治疗的影响,以及初步探讨华支睾吸虫合并乙型病毒感染致肝脏损伤的原因。研究目的华支睾吸虫感染合并乙型肝炎病毒感染致肝脏损伤原因的初步探讨研究方法与结果1.病例选择的标准首先通过对2014年7月至2015年2月期间于中山大学附属第三医院就诊的门诊及住院患者的病例按照以下3项标准纳入单纯乙肝患者病例组:1)年龄:满18周岁,男女不限;2)血清学HBs Ag阳性;3)血清学HBV DNA拷贝数≥20IU/ml;在以上3项标准的基础上,在粪检中检出华支睾吸虫虫卵的患者纳入合并华支睾吸虫与乙肝病毒感染患者病例组;并且,以在粪检中检出华支睾吸虫虫卵及血清学HBs Ag阴性患者为单纯华支睾吸虫患者组;同时,以未在粪检中检出华支睾吸虫虫卵及血清学HBs Ag阴性的正常人作为对照组;除此以外,按照以下四项标准排除其余病例:1)合并HIV、HAV、HCV、HDV等其他肝炎病毒感染患者;2)酒精肝性患者;3)自身免疫性疾病患者;4)合并其他蠕虫及原虫感染患者;5)一、二型糖尿病患者;6)妊娠或者哺乳期女性。2.合并感染患者与单纯乙肝患者的肝功能的比较由于两种疾病都最终作用于肝脏,因此通过比较肝功能来分析合并华支睾吸虫感染对乙肝患者的影响。评价肝功能主要观察指标为血清学为谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）和总胆红素（TB）（其中ALT和AST均采用赖氏法,正常值分别为3-35U/L和15-40U/L,TB正常值为4.0-23.9umol/L）,ALT和AST>2倍正常上限值,TB>3倍正常上限值视为肝功能损害。同时比较血清中HBV DNA的含量差异（正常值为阴性）。根据纳入标准一共有701例病人被纳入分析,其中520例病人为单纯乙肝患者,51例病人为合并感染患者,53例病例为单穿华支睾吸虫感染患者,并且随机选取77例正常人作为对照组。其中男性合并感染患者的人数远远高于女性感染患者。合并感染患者血清中ALT,AST,TB和HBV DNA水平明显高于单纯乙肝患者以及单纯华支睾吸虫感染患者组,提示合并感染患者的肝功能损伤严重及合并华支睾吸虫感染会加剧病程的发展。3.华支睾吸虫感染度与HBV DNA拷贝数的关系华支睾吸虫感染程度由粪检中检测到虫卵数所决定,而合并感染患者呈现高HBV DNA拷贝数,进一步分析华支睾吸虫感染程度是否与HBV DNA复制量有关系。本研究所收集到的合并感染患者都是轻度感染华支睾吸虫,在轻度感染时,HBV DNA的复制量并没有随虫卵数的增加而增加;然而HBV DNA复制量小于106次方时在粪检中虫卵的数量要明显高于复制量大于106次方时,说明HBV DNA高复制量有可能会抑制虫卵从机体中排出。4.合并华支睾吸虫感染对抗病毒治疗的影响选取合并感染患者,按照接受恩替卡韦（ETV）抗病毒治疗的基础上是否接受吡喹酮（PZQ）驱虫治疗分为联合治疗和单纯抗病毒治疗组,比较两组病人在接受一个疗程的治疗后的肝功能相关指标以及HBV DNA水平。结果显示合并感染患者在接受一个疗程的治疗后,接受驱虫和抗病毒联合治疗的合并感染患者的TB和HBV DNA水平明显低于单一抗病毒治疗组,然而ALT与AST水平在两组之间没有统计学差异,提示合并华支睾吸虫感染可能会减弱抗病毒治疗的疗效。5.华支睾吸虫ESP对乙肝病毒复制的影响用含有2x106 HBV DNA的乙肝患者血清与华支睾吸虫ESP（20ug/ml）共同孵育感染正常人外周血单个核细胞,以乙肝患者血清单独感染为对照组,感染48小时后检测细胞培养上清中HBV DNA拷贝数。结果显示培养48小时后,混合感染组的HBV DNA拷贝数明显高于单纯乙肝患者血清组,提示ESP有可能会增强乙肝病毒在外周血单个核细胞中的复制。6.华支睾吸虫ESP对宿主细胞因子表达的影响用华支睾吸虫ESP与乙肝患者血清共同孵育感染外周血单个核细胞,培养48小时后Real Time PCR法和ELISA法分别检测细胞中和细胞上清中细胞因子的表达,以正常培养的细胞做对照组。Real-Time PCR结果显示单纯乙肝患者血清实验组和单独华支睾吸虫ESP实验组都能诱导PBMC表达Th1型和Th2型细胞因子,ESP实验组以Th2型细胞因子为主;并且相对单纯乙肝患者血清实验组而言,ESP与乙肝患者血清混合物实验组的Th2型细胞因子包括IL-4,IL-6和IL-10水平明显增高,然而在Th1型细胞因子包括IL-2和IFN-γ在两组之间没有统计学差异。ELISA结果显示与乙肝患者血清刺激PBMC相比,用ESP与乙肝患者血清混合刺激PBMC分泌的IFN-γ水平明显降低,但是IL-4,IL-6和IL-10的表达水平是明显增高,上述结果提示华支睾吸虫ESP存在的前提下,细胞因子的表达可能由Th1型转向Th2型,提示合并华支睾吸虫感染时会加剧机体Th1/Th2细胞因子失衡的状态。7.感染患者血清学中细胞因子表达的变化收集合并感染患者、乙肝患者和华支睾吸虫患者接受治疗前的血清,分析相关细胞因子在三者血清学上的表达变化,以正常健康人作为对照组。结果显示,华支睾吸虫感染患者血清学中主要以Th2型细胞因子为主,而乙肝患者的IFN-γ在合并感染患者中的表达水平都要比乙肝患者和华支睾吸虫感染患者低,而细胞因子IL-2和IL-4在合并感染患者中要比乙型肝炎患者低,但并不具有统计学差异。而IL-10和IL-6在合并感染患者中的表达水平要比乙肝患者要明显增高,并具有统计学意义。8.研究结论在乙肝病毒感染时合并华支睾吸虫感染会加剧肝脏损伤进而影响肝功能,而且会削弱抗病毒治疗疗效;华支睾吸虫的ESP有助于乙肝病毒的复制;合并华支睾吸虫与乙肝病毒感染时会加剧机体Th1/Th2细胞因子失衡,并且可能以Th2型细胞免疫应答为主从而影响病毒的清除。II.EBOV的DNA疫苗免疫保护作用研究埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）是单股负链RNA病毒,与马尔堡病毒同属丝状病毒科,该病毒是埃博拉出血热（Ebola hemorrhagic fever,EHF）的病原体,能引起人类和非人类灵长类动物的一种急性出血性传染病,感染后死亡率高达90%。EBOV于1967年被首次发现,目前全世界仍然缺乏有效的治疗性或者预防性EBOV疫苗,其被列为生物安全等级四级（BSL-4）病毒,具有作为生化武器的潜力。目前,我国尚未发现该病,但随着世界经济的发展,EBOV也有传入我国的潜在危险,因此,对EBOV疫苗的相关研究具有重大的意义。EBOV含有7个基因,其基因组能编码8种蛋白;其中EBOV的第四个基因GP基因具有两个阅读编码框,未经m RNA编辑的GP基因主要编码s GP蛋白,含量约为80%;由于m RNA的编辑作用编码产生GP蛋白（Glycoprotein,GP）,GP糖蛋白是由于在m RNA编辑位点处插入一个腺苷残基,从而导致编码框移从而产生GP糖蛋白,含量约为20%。大量的研究表明作为埃博拉病毒表面唯一的跨膜蛋白GP是诱导机体产生保护性中和抗体的主要蛋白,然而关于s GP在病毒感染过程中的具体功能还未有详细的研究。关于其他病毒的分泌性糖蛋白s GP的相关研究表明其有可能结合特异性中和抗体从而逃避宿主的免疫攻击以及干扰抗体介导的病毒清除,然而还未有足够的研究关于EBOV的分泌性糖蛋白s GP的相关功能。研究目的探讨埃博拉病毒分泌型s GP蛋白在病毒感染中的相关机制方法和结论1.埃博拉病毒GP基因编辑位点点突变免疫原性分析通过利用PCR定点突变技术对扎伊尔型埃博拉病毒的GP基因的m RNA编辑位点7个连续的腺苷后插入一个腺苷从而获得连续8个腺苷获得GP-8A,主要表达GP1,2;为了消除转录过程中由于聚合酶的滑移作用的影响,在7个连续腺苷处进行了沉默点突变由A突变为G获得s GP1,2 Edit,其完全表达s GP蛋白;同样在GP-8A基因的基础上也进行沉默点突变由A变为G获得GP1,2Edit完全表达GP1,2蛋白;再将上述基因克隆至真核p CAGGs载体并测序鉴定。随后,我们将真核质粒转染Hela细胞,24小时后收集上清和细胞,利用Western blot方法检测到s GP蛋白和GP蛋白的表达,结果表明在编辑位点处进行点突变有助于蛋白表达的增加。随后,我们用上述获得的真核表达质粒以肌肉注射的途径免疫小鼠,收集免疫后小鼠血清,利用ELISA检测血清中特异性抗体的滴度,结果显示s GP Edit和GP-7A诱导小鼠产生特异性s GP抗体水平要明显高于EBO-GP1.2 Edit和GP-8A,而EBO-GP1.2 Edit和GP-8A诱导小鼠产生特异性GP抗体水平要明显高于s GP Edit和GP-7A。2.s GP可以与GP蛋白竞争结合由s GP免疫诱导产生的GP抗体由于s GP和GP1.2都可以诱导小鼠产生s GP抗体和GP抗体,我们利用western blot技术进一步分析GP1.2和s GP诱导产生的抗体所针对的抗原表位是否一致,结果显示s GP免疫血清识别s GP蛋白的能力要明显强于GP蛋白,而GP免疫血清识别GP蛋白的能力要明显强于s GP蛋白,表明GP1.2诱导产生的GP抗体所针对抗原表位并不存在于s GP上。接着我们利用竞争性ELISA方法检测s GP蛋白与GP蛋白竞争结合GP抗体的能力,结果显示s GP蛋白能够与GP蛋白竞争结合s GP免疫诱导产生的GP抗体,然而不能竞争结合GP免疫诱导产生的GP抗体,提示GP免疫诱导产生的GP抗体所针对的抗原表位只特定存在于GP蛋白上,而s GP免疫诱导产生的GP抗体所针对的抗原表位是s GP与GP共享的抗原表位。3.抗体中和能力分析中和抗体是抗病毒免疫和评价疫苗免疫治疗效果的重要检测指标之一,我们利用假病毒中和实验体系检测s GP和GP诱导产生中和抗体的区别,首先我们用p SG3?env质粒与埃博拉病毒膜蛋白的GP质粒共同转染293T细胞包装形成埃博拉假病毒,然后用不同稀释倍数的免疫组血清与500pfu/ml的假病毒共同孵育1小时后感染TZM-bl细胞,48小时通过检测细胞内荧光素酶的表达,结果显示s GP和GP诱导产生的抗体均具有中和假病毒的能力,而且GP免疫组所产生的中和抗体活性高于s GP免疫组。接着,我们通过竞争性中和实验进一步检测s GP蛋白干扰抗体中和病毒的能力,结果显示s GP蛋白能够完全减弱s GP Edit免疫组抗体中和假病毒的活性,并且这种能力随着s GP蛋白浓度的增加而增强;然而,s GP蛋白干扰抗体的中和活性并没有在GP Edit免疫组有所体现。4.小鼠的免疫及攻毒实验为了探讨s GP和GP1,2在保护小鼠抵抗致死剂量埃博拉病毒攻击感染上是否存在差异,我们用s GP和GP1,2以肌肉注射的途径免疫小鼠,初免4周后以同样的剂量及方式行加强免疫一次,加强免疫四周后,其中两组予以交叉免疫即s GP免疫组予以GP加强免疫,而GP免疫组予以s GP交叉免疫,另两组分别予以相同的抗原再次加强免疫一次,还有两组不再加强免疫。免疫12周后小鼠经腹腔注射含有1000pfu的同源鼠适应埃博拉病毒进行攻毒。首先检测免疫后抗体滴度的变化,ELISA结果显示3次GP免疫后均可提高GP抗体产生水平且明显高于GP-s GP交叉免疫组,3次s GP免疫后均可提高s GP抗体产生水平且明显高于s GP-GP交叉免疫组,并且在两组交叉免疫组能明显增加s GP抗体水平。接着,中和实验结果显示2次同源免疫诱导产生的抗体均具有中和假病毒的活性,3次s GP和3次GP免疫组的抗体中和活性有明显增加,但是交叉免疫组的抗体中和活性并没有增加。最后,攻毒实验显示2次s GP免疫组只有1只老鼠存活,3只小鼠和1只小鼠分别在攻毒第5天和第8天死亡,其余免疫组除对照组外均存活;然而,只有在3次GP免疫组和GP-s GP免疫组的小鼠仍保持健康状态外其余免疫组小鼠伴有10-15%的体重下降以及疾病状态。5.研究结论在GP基因的m RNA编辑位点处获得GP1.2和s GP,进行点突变可明显增加s GP和GP蛋白的表达水平,并且s GP和GP分别诱导机体产生特异性GP和s GP抗体水平,并且s GP和GP诱导产生的抗体具有中和假病毒的活性,高水平的特异性GP抗体是保护小鼠抵抗致死剂量埃博拉病毒攻击的关键。
裴增林[6]（2015）在《以减毒沙门氏菌为载体的H5N1流感疫苗及乙肝基因治疗药物研究》文中指出由于减毒肠道细菌如沙门氏菌,具有通过口服并入侵宿主细胞的特性,减毒沙门氏菌作为核酸疫苗传递载体非常具有应用前景。在本研究中,我们构建了一株新型减毒沙门氏菌SL368,并将其作为载体传递和表达高致病性H5N1流感病毒的血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因,即沙门氏菌流感疫苗Sal-HA-NA。结果表明,我们构建的减毒沙门氏菌SL368表现出较高的基因传递效率以及对小鼠的低细胞毒性和低致病性。以BALB/c小鼠作为动物模型,我们研究了Sal-HA-NA的免疫效果。结果显示,通过口服免疫接种,Sal-HA-NA诱导小鼠产生了抗HA血清IgG、粘膜IgA以及分泌干扰素γ的T细胞。同时口服接种表达病毒HA和NA蛋白沙门氏菌流感疫苗的小鼠经过高致病性H5N1流感病毒以及H1N1流感病毒攻毒后全部存活下来,而口服接种携带空载质粒的沙门氏菌的小鼠全部死亡。这些结果表明Sal-HA-NA诱导机体产生了强烈的特异性体液和细胞免疫反应,并使机体获得了抵抗多种流感病毒的能力。此外,我们的研究还表明发展以减毒沙门氏菌为载体的新型口服疫苗抵抗流感病毒具有可行性。肝脏特异性的miR-122已被证实能够通过碱基配对的方式与乙肝病毒高度保守的前基因组RNA序列结合,进而抑制乙肝病毒基因的表达和复制。然而,在哺乳动物细胞中,miR-122的瞬间沉默效应和细胞毒性限制了其在治疗乙肝病毒感染方面的应用潜力。在本研究中,我们基于在细胞内指导合成siRNA样转录体的pSuper basic载体构建pSB-miR-122质粒,来持续表达miR-122延长抑制HBV基因表达的时间。同时用一种新型减毒沙门氏菌将pSB-miR-122质粒高效地带入肝脏细胞,大量表达miR-122,并且对小鼠无副作用。此外,口服接种表达miR-122沙门氏菌药物的小鼠体内乙肝病毒基因的表达受到了抑制。这些结果表明,表达miR-122的沙门氏菌药物介导的基因疗法可以抑制体内乙肝病毒基因的表达。
梁爱心[7]（2009）在《非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的构建和免疫效力及安全性研究》文中提出本研究应用基因克隆、细胞培养、蛋白表达、共聚焦显微观察、酶联免疫测定、RT-PCR、石蜡切片等技术,在生长抑素DNA疫苗pGM-CSF/SS的基础上引入平衡致死系统,构建非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pVGS/2SS-asd,并电转化至缺失asd和crp基因的减毒猪霍乱沙门氏菌,将重组菌口服或肌注免疫小鼠后,旨在①探讨其免疫效力及影响因素;②评估其安全性,包括基因整合与毒性分析,为开发安全、高效的促生长DNA疫苗,加快其临床应用奠定基础。1.非抗性筛选生长抑素真核表达质粒的构建与鉴定以质粒pGM-CSF/SS为模板扩增生长抑素融合基因片段GS/2SS,之后亚克隆到无抗性真核表达载体pVAX-asd,构建非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pVGS/2SS-asd,同时将表达增强型绿色荧光蛋白基因（M4GFP）插入到pVGS/2SS-asd质粒的下游,构建带有绿色荧光蛋白基因的非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-M4GFP-asd。酶切、测序鉴定结果表明,基因的插入位点、方向、序列完全正确。荧光显微观察结果表明,pGS/2SS-M4GFP-asd质粒转染细胞48h后荧光最强烈,且融合蛋白GS/2SS-M4GFP定位于细胞质中。RT-PCR结果表明,pVGS/2SS-asd和pGS/2SS-M4GFP-asd质粒转染细胞48h后均能检测到转录产物。ELISA结果显示,重组质粒表达的融合蛋白均具有SS免疫学活性,表明构建的2种质粒均可在哺乳动物细胞中表达具有生长抑素免疫学活性的融合蛋白。2.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗体外和体内的稳定性将上述构建的质粒pVGS/2SS-asd电转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500,获得非抗性筛选生长抑素DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）。将重组菌体外传代培养50次后,质粒酶切鉴定结果显示,质粒在传代过程中没有丢失。将重组菌口服和肌注接种小鼠,免疫后2d在肺、脾、肝组织中可检测到重组菌,且重组菌中均可扩增出目的质粒,免疫后14d则检测不到重组菌。由此可见,以减毒沙门氏菌为载体的非抗性筛选生长抑素DNA疫苗在体内和体外均具有良好的稳定性。3.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的免疫应答及其影响因素为优化非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的免疫程序,本研究设计三个免疫剂量(0.2×1010 CFU/只,0.2×109 CFU/只,0.2×108 CFU/只)、两种免疫次数（1次,2次）、两种免疫间隔（4w,6w）口服免疫昆明雌鼠。ELISA结果显示,试验组小鼠均可以检测到抗SS抗体,且随免疫时间的延长,呈现升高的趋势。总体比较而言,高剂量免疫一次组取得了较高的抗体水平。小鼠体增重结果显示,高剂量免疫一次组取得了相对较好的增重效果。为探讨非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的免疫应答类型,将重组菌C500（pvGS/2SS-asd）口服和肌注免疫Balb/C雌鼠,免疫剂量为0.2×1010 CFU/只。采用间接ELISA法检测血浆IgG、IgGl、IgG2a、IgA抗体水平。结果显示,口服免疫和肌注免疫均能诱导产生IgG、IgGl、IgG2a、IgA抗体,且肌注免疫诱导的抗体水平要优于口服免疫。从抗体亚型来看,不论是口服免疫还是肌注免疫产生的IgG1抗体水平均高于IgG2a,表明免疫后均可同时激发Th1型和Th2型免疫应答,但更倾向于Th2型的体液免疫应答。4.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗在小鼠体内的表达分布将Balb/C雌鼠口服和肌注免疫重组菌C500（pVGS/2SS-asd）,剂量为0.2×1010CFU/只,分别于免疫后2d,5d,10d,20d,30d,60d,每组取4只小鼠（含1只对照）无菌采集脑、心、肝、脾、肺、肾、肠、肌肉、卵巢组织,采用RT-PCR方法检测质粒在组织内的表达时相及分布。结果显示,口服免疫后2d可以在心、肝、脾、肺、肾、肠组织中检测到目的基因,第5d时除了卵巢和脑组织之外,其它组织均可扩增到目的基因,第10d仅在肝脏中检测到靶基因。肌注免疫后2d可以在心、肝、脾、肺、肾、肌肉组织中检测到目的基因,与口服组相似的是第5d时除了卵巢和脑组织之外,其它组织均可扩增到目的条带,第10d时除了肝脏、肌肉和脾脏,其它组织均检测不到靶基因。免疫后20d两个免疫组的各个器官均检测不到目的质粒。此研究结果提示非抗性筛选生长抑素DNA疫苗在小鼠体内持续表达时间较短,且有短暂的较高水平表达之后较快被降解。5.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗对小鼠的毒性研究将昆明小鼠口服和肌注免疫重组菌C500（pVGS/2SS-asd）,剂量为0.4×1010 CFU/只、0.4×1011 CFU/只、0.4×1012 CFU/只。免疫后4h、24h、1w、6w采血送检血常规。免疫后1w和6w采集小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、卵巢（睾丸）、肌肉组织,制备石蜡切片,观察组织是否发生病理变化。血常规检测结果显示,口服和肌注DNA疫苗后,未发现试验组和空菌对照组之间有显着性差异（p＞0.05）,石蜡切片结果显示,各个组织器官均正常,提示该疫苗没有引起小鼠毒性反应。将第3部分的试验末期Balb/C雌鼠处死后,采集心、肝、脾、肺、肾、肠、卵巢、脑、肌肉组织,提取基因组,PCR法检测质粒DNA的染色体整合情况,结果表明,在PCR的最大灵敏度（10拷贝/μg基因组）范围之内,没有发现质粒整合至基因组,提示如果发生整合突变,那么发生频率低于自发突变至少两个数量级。
宋小凯[8]（2008）在《柔嫩艾美耳球虫免疫调节型多价DNA疫苗的构建及免疫效果观察》文中研究表明对柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的免疫剂量进行筛选。设计了200μg、100μg、50μg、25μg四个剂量组以及非免疫攻虫和非免疫非攻虫两个对照组。按照相应的免疫剂量,实验组14日龄腿部肌肉注射DNA疫苗pcDNA-TA4-IL-2,21日龄加强免疫,对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,25μg和50μg组的ACI分别为196.45和182.67,免疫保护效果明显;100μg组的ACI为172.16,免疫保护效果一般;200μg组的ACI为157,无免疫保护效果。对柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的免疫途径进行筛选。设计了皮下注射、口服、静脉注射、肌肉注射、滴鼻滴眼五个实验组以及非免疫攻虫和非免疫非攻虫两个对照组。14日龄,实验组每只鸡按相对应的途径免疫接种25μg DNA疫苗,21日龄加强免疫,对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,所有实验组的ACI都大于160。静脉注射组、皮下注射组和滴鼻、滴眼组的ACI分别为173.38、171.44、168.17,免疫保护效果一般。口服组的ACI为180.17,免疫保护效果明显。腿部肌肉注射组ACI最高,达到193.97,免疫保护效果最好。对DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的首免日龄和免疫次数进行筛选。设计了一周龄首免不加强免疫、一周龄首免二周龄加强免疫、二周龄首免不加强免疫、二周龄首免三周龄加强免疫四个实验组以及非免疫攻虫和非免疫非攻虫两个对照组。按照相应的免疫日龄与次数,实验组每只鸡经腿部肌肉注射25μg DNA疫苗,对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,所有实验组的ACI都大于160,其中一周龄首免组比二周龄首免效果好;加强免疫组比非加强组效果差别不大;一周龄首免,二周龄加强免疫组效果最好。对DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的稳定性进行了研究。DNA疫苗在不同的温度（即-20℃、4℃和室温）下保存分别保存了1个月、3个月、6个月。分别用这些在不同条件保存过的DNA疫苗腿部肌肉注射免疫7日龄鸡,14日龄加强免疫。对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,所有实验组的ACI都大于160,说明在本实验中所有DNA疫苗都有免疫保护效果。随着保存期的延长,疫苗的免疫保护效果稍有下降。随着保存温度的不同,疫苗的保护效果稍有变化。说明DNA疫苗在6个月内受温度和保存期影响小。对DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的交叉免疫保护行进行了研究。7日龄雏鸡经腿部肌肉注射DNA疫苗DNA25μg/羽,14日龄加强免疫.对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余分别经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2对毒害艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫感染有部分交叉免疫保护作用,对巨型艾美耳球虫感染没有交叉免疫保护作用。利用DNAstar软件对柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段抗原基因SO7和第二代裂殖子阶段抗原基因MZ5-7进行表位分析,选定T细胞表位比较集中的片断。结果显示,ml为MZ5-7基因的第115位到第435位的321个核苷酸,编码107个氨基酸;m2为MZS-7基因的第547位到第897位的351个核苷酸,编码117个氨基酸;s1为SO7基因的第7位到第291位的285个核苷酸,编码95个氨基酸;s2为SO7基因的第370位到第609位的240个核苷酸,编码80个氨基酸。根据所构建的重组质粒对酶切位点以及对阅读框的不同要求,利用软件primer premier5.0设计若干对特异性引物,分别以pMD18-T-SO7和pMD18-T-MZ5-7为模板,PCR扩增得到m1、m2、s1和s2,分别连入pMD18-T载体。鉴定结果显示,各个片断成功克隆到pMD18-T载体中。把s1、s2、m1和m2,以不同的组合克隆到pVAX1载体中,构建了多价表位DNA疫苗:pVAX1-m1-m2-s1-s2、pVAX1-m1-s1、pVAX1-m1-s2、pVAX1-m2-s1、pVAX1-m2-s2;表位DNA疫苗:pVAX1-m1、pVAX1-m2、pVAX1-s1和pVAX1-s2。分别连接chIFN-γ和chIL-2作为基因佐剂构建了免疫调节型多价表位DNA疫苗:pVAX1-m1-m2-s1-s2-IFN□、pVAX1-m1-m2-s1-s2-IL2、pVAX1-m1-s1-IFN□、pVAX1-m1-s1-IL2、pVAX1-m1-s2-IFN□、pVAX1-m1-s2-IL2、pVAX1-m2-s1-IFN□、pVAX1-m2-s1-IL2、pVAX1-m2-s2-IFN□和pVAX1-m2-s2-IL2。酶切鉴定正确后,分别用重组质粒免疫7日龄鸡,1周后取注射部位、非注射部位肌肉组织,用RT-PCR,Western-blot检测保护性抗原的表达情况。结果表明,目的基因片段均能在注射部位肌肉里成功表达。对已构建好的19种重组质粒进行动物免疫保护性实验.设计了10个免疫调节型多价表位DNA疫苗组:pVAX1-m1-m2-s1-s2-IFN□、pVAX1-m1-m2-s1-s2-IL2、pVAX1-m1-s1-IFN□、pVAX1-m1-s1-IL2、pVAX1-m1-s2-IFN□、pVAX1-m1-s2-IL2、pVAX1-m2-s1-IFN□、pVAX1-m2-s1-IL2、pVAX1-m2-s2-IFN□、pVAX1-m2-s2-IL2;5个多价表位DNA疫苗组:pVAX1-m1-m2-s1-s2、pVAX1-m1-s1、pvAX1-m1-s2、pVAX1-m2-s1、pVAX1-m2-s2;4个表位DNA疫苗组:pVAX1-m1、pVAX1-m2、pVAX1-s1、pVAX1-s2;3个对照组:pVAX1空载体、非免疫非攻虫和非免疫攻虫对照组。用这19种重组质粒经腿部肌肉分别于14、21日龄两次免疫雏鸡（100μg/只）,空载体对照组注射pVAX1,另两个对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余鸡均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/羽。一周后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果表明,所构建的免疫调节型DNA疫苗对感染球虫鸡具有良好的保护效果。多价表位DNA疫苗诱导的免疫保护效果比单一阶段的DNA疫苗诱导免疫保护效果好,并且含有的表位越多,其免疫保护效果也越好。串联有细胞因子的免疫调节型多表位DNA疫苗的免疫保护效果比没有串连细胞因子的多表位DNA疫苗的免疫保护效果好,连接IFN□的DNA疫苗的免疫保护效果比连接IL-2的DNA疫苗的免疫保护效果好。其中以pVAX1-m1-m2-s1-s2-IFN□的免疫保护效果最好。
张国广[9]（2007）在《禽流感病毒M2重组多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究》文中研究指明禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）能感染几乎所有的野生及饲养禽类，引起禽类尤其是饲养禽类的死亡，AIV的流行给养禽业造成了严重的经济损失。1997年在香港发现H5N1亚型禽流感病毒突破生物屏障直接感染人，使人们认识到AIV对于人类公共卫生的重要性。疫苗接种是预防和控制AIV流行的主要措施之一，但AIV突变频率高、亚型多，给疫苗的研制带来困难。AIV的M2蛋白是病毒囊膜上的蛋白之一，具有亚型间高度的保守性，是理想的交叉保护性疫苗的候选抗原。AIV主要是经过动物呼吸道等粘膜系统传染，具有诱导机体粘膜和系统应答能力的疫苗对于禽流感的防治具有重要的意义。大肠杆菌不耐热肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）是目前研究较多的粘膜佐剂之一，尤其是其B亚单位不具有LT的肠毒素毒性，但仍然保持较好的粘膜佐剂活性。本研究基于M2基因及其M2e表位与大分子载体HBcAg（Heptitis B core antigen，HBcAg）构建融合基因，利用融合基因制备多肽和DNA疫苗，并对疫苗免疫效果进行了研究，同时研究了LTB亚基对多肽和DNA疫苗的佐剂效应。主要结果如下：1)利用RT-PCR从一株福建分离的AIV H5N1病毒株中克隆了其M基因，序列比对结果表明与人源分离株遗传距离较远，从M基因上扩增得到完整的M2基因，利用OE-PCR（Overlap extension PCR）得到缺失跨膜区的△M2，将△M2进行原核表达。利用OE-PCR分别将M2e表位融合到大分子载体HBcAg的N端和主要免疫优势区（Maior immunodominant region，MIR），构建融合基因M2eHBc和M2eHBc+，进行了原核表达。上述原核表达蛋白具有抗原性、亚型间交叉识别能力、M2eHBc和M2eHBc+还具有体外自主包装成VLP（Virus-like particles，VLP）颗粒的能力，肌肉注射免疫小鼠后均能诱导小鼠产生M2特异性抗体，其中M2eHBc+蛋白免疫效果显着优于其它免疫组；2)从大肠杆菌195毒株中克隆出LT基因，并对其B亚基进行了原核表达，表达的重组LTB蛋白具有抗原性和体外GM1结合活性。将LTB基因与M2eHBc+融合进行了原核表达，表达出的LBM2eHBc+蛋白能与M2蛋白抗体发生免疫识别，能自主包装成VLP颗粒，具有体外GM1结合活性；3)动物免疫试验表明，与阴性对照比M2eHBc+蛋白通过粘膜途径免疫小鼠能诱导一定的系统和粘膜应答，表达的LTB蛋白与M2eHBc+蛋白混合通过粘膜途径免疫小鼠能显着增强机体的血清IgG应答，诱导较强的粘膜IgA应答，表明所表达的LTB蛋白具有很强的粘膜佐剂活性。表达的LBM2eHBc+融合蛋白通过粘膜途径免疫小鼠引起的机体免疫系统应答水平与M2eHBc+混合LTB免疫组相似，且对粘膜IgA的诱导能力优于混合组；4)将M2eHBc+与pCDNA3载体连接构建pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗，转染293细胞，能表达出抗原蛋白且该蛋白具有抗原性，DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠后能诱导机体产生较强的抗原特异性抗体和T细胞增殖应答；5)LTB质粒与pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗等量混合，或LTB基因与pCDNA3-M2eHBc+融合构建的DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，与单独pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗肌肉注射组比，能显着增强DNA疫苗的细胞免疫应答，对体液IgG应答的佐剂效应不明显；通过滴鼻途径免疫时能显着刺激机体粘膜IgA分泌；6)研究了DNA疫苗和蛋白疫苗的初免／加强策略，结果表明在DNA疫苗两次免疫后用一次相同抗原的蛋白疫苗加强免疫，可以显着增强机体系统IgG应答，且对DNA疫苗诱导的T细胞应答影响不显着；7)将LBM2eHBc+融合基因构建酵母表达载体pPIC9K-LBM2eHBc+，转化GS115表达菌，筛选出能分泌表达LBM2eHBc+蛋白的转基因酵母株，WesternBlotting分析该蛋白具有抗原性。
胡慧[10]（2007）在《SARS-CoV DNA疫苗研究》文中研究说明严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）是由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的急性呼吸道传染病。虽然2002年爆发的SARS已被成功控制，但由于病毒的变异及其高度的传染性，SARS存在着再度复发的可能，因此SARS疫苗的研究成为非常紧迫的任务。本论文基于SARS-CoV感染所引起的机体的细胞免疫和体液免疫方面的变化特征，以及DNA疫苗能引起体液免疫和细胞免疫反应，且维持时间长的特点，用不同基因的DNA疫苗免疫小鼠，研究各基因所引起的免疫应答情况的差异；并从佐剂、免疫途径及粘膜免疫等方面入手，研究SARS-CoV DNA疫苗所引起的免疫学效应，为SARS-CoV的防制和免疫学机制的探讨奠定基础。第一章针对SARS及SARS-CoV的研究状况作了综述，主要对SARS免疫学和疫苗研究两个方面进行重点阐述；另外对DNA疫苗及其免疫佐剂和免疫途径的研究进展进行了综述。第二章探讨了SARS-CoV主要结构蛋白S、N、M和E的DNA疫苗免疫小鼠后，所引起的SARS-CoV抗原特异性体液免疫和细胞免疫反应。结果表明，4个结构蛋白的DNA疫苗免疫小鼠后均能产生特异性免疫应答反应，为SARS DNA疫苗的进一步临床试验提供实验依据。第三章探讨了IL-2作为基因佐剂对SARS N蛋白DNA疫苗的免疫调节作用。将SARS-CoV N蛋白DNA疫苗和重组IL-2质粒接种小鼠，利用ELISA法检测小鼠血清中的抗体水平；分别用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应，ELISPOT检测其分泌的IFN-γ和IL-4，FCM测定其T淋巴细胞亚型的变化。结果表明共同免疫IL-2基因增强了N蛋白特异性的抗体水平，增强了脾淋巴细胞的增殖反应，提高了其分泌IFN-γ和IL-4的水平。对于SARS-CoV N蛋白DNA疫苗而言，IL-2基因是一种很好的免疫佐剂。第四章探讨了IL-2作为基因佐剂对SARS-CoV S蛋白DNA疫苗的免疫调节作用。将IL-2和S基因的重组质粒共同免疫小鼠，检测其产生的体液免疫和细胞免疫反应。结果表明IL-2基因可以增强SARS-CoV S DNA疫苗的免疫效果。第五章将SARS-CoV N基因的DNA疫苗导入减毒鼠伤寒沙门氏菌CS022中，采用口服和滴鼻相结合的方法免疫BALB／c小鼠，检测其特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，评价以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的口服疫苗的免疫效果。结果表明该重组菌能诱导N特异性体液免疫应答；诱导了较高水平的淋巴细胞特异性增殖反应、CD8+T细胞和IFN-γ。提示减毒沙门氏菌可以有效运送N DNA疫苗并诱导产生特异性免疫应答，这为减毒细菌作为运送载体的研究提供了参考依据。第六章将pcDNA-S质粒分别以肌注、电转、以减毒沙门氏菌为载体的口服3种途径免疫BALB／c小鼠；检测其诱导的体液和细胞免疫反应，评价不同免疫途径的免疫效果。结果表明pcDNA-S DNA疫苗电转免疫组诱生了高水平IgG，口服免疫组仅诱生低水平的IgG，肌注组诱生的IgG介于电转和口服免疫之间；3种免疫途径免疫后均可引起特异性细胞免疫，其中口服免疫组诱导了较高水平的淋巴细胞特异性增殖反应、CD8+T细胞和IFN-γ，肌注组的细胞免疫反应次之，电转组诱导特异性细胞免疫应答在这3种免疫途径中是最弱的。提示把电转和以沙门氏菌为载体的口服免疫结合起来，可能会引起更强的免疫反应。
二、免疫途径及载体对乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究(摘要)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、免疫途径及载体对乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究(摘要)（论文提纲范文）
（1）生长抑素DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）对于育肥猪的生产性试验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 生长抑素基因免疫研究进展 |
| 1.1.1 生长抑素DNA疫苗的构建 |
| 1.1.2 生长抑素DNA疫苗的稳定性 |
| 1.1.3 生长抑素DNA疫苗的免疫效果 |
| 1.1.4 生长抑素DNA疫苗免疫程序的优化 |
| 1.2 生长抑素DNA疫苗安全性的研究进展 |
| 1.2.1 DNA整合 |
| 1.2.2 自身免疫反应 |
| 1.2.3 生殖毒性 |
| 1.2.4 免疫耐受 |
| 1.2.5 其他辅助因子的副作用 |
| 1.2.6 DNA疫苗环境安全 |
| 1.3 生产性试验的必要性 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 质粒与菌株 |
| 2.2 主要药品和试剂 |
| 2.3 试剂盒与工具酶 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 质粒的鉴定 |
| 3.1.1 质粒的酶切鉴定 |
| 3.1.2 质粒序列的测序比对 |
| 3.2 生长抑素DNA疫苗工程菌的制备 |
| 3.2.1 沙门氏菌感受态的制备 |
| 3.2.2 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 3.2.3 ΔasdΔcrp双缺失减毒猪霍乱沙门氏菌C500 株的电转化 |
| 3.3 生长抑素DNA疫苗工程菌稳定性检测 |
| 3.3.1 工程菌体外的传代培养 |
| 3.3.2 传代菌株关键基因稳定性检测 |
| 3.3.3 工程菌生长性能稳定性检测 |
| 3.4 生长抑素DNA疫苗工程菌对育肥猪生长性能及免疫应答的影响 |
| 3.4.1 疫苗的发酵制备 |
| 3.4.2 试验动物的挑选与饲养管理 |
| 3.4.3 免疫试验设计 |
| 3.4.4 试验猪称重与血液采集 |
| 3.4.5 相关抗体、激素和细胞因子检测 |
| 3.4.6 组织采集 |
| 3.4.7 肉质分析 |
| 3.5 生长抑素DNA疫苗的安全性评价 |
| 3.5.1 疫苗环境安全检测 |
| 3.5.2 基因整合检测 |
| 3.5.3 组织病理学变化观察 |
| 3.6 数据分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 生长抑素DNA疫苗的鉴定 |
| 4.1.1 质粒的鉴定 |
| 4.1.2 生长抑素DNA疫苗工程菌的鉴定 |
| 4.2 生长抑素DNA疫苗工程菌稳定性 |
| 4.2.1 生长抑素DNA疫苗工程菌关键基因的稳定性 |
| 4.2.2 生长抑素DNA疫苗工程菌生长性能的稳定性 |
| 4.3 生长抑素DNA疫苗促生长效果的整体表现 |
| 4.4 生长抑素DNA疫苗的免疫应答 |
| 4.4.1 生长抑素抗体效价与阳性率 |
| 4.4.2 血清IL-4与IFN-γ水平 |
| 4.4.3 血清GH与IGF-1水平 |
| 4.5 抗体阳性猪的体重变化及其与抗体水平的相关性分析 |
| 4.6 抗体阳性猪背膘厚度变化及其与抗体水平的相关分析 |
| 4.7 抗体阳性猪肉质分析 |
| 4.8 生长抑素DNA疫苗的安全性评价 |
| 4.8.1 生长抑素DNA疫苗接种后的体温反应 |
| 4.8.2 疫苗环境安全检测 |
| 4.8.3 DNA整合检测 |
| 4.8.4 组织病理学变化观察 |
| 5 讨论 |
| 5.1 生长抑素DNA疫苗的鉴定与稳定性 |
| 5.2 生长抑素DNA疫苗的免疫应答与促生长效果 |
| 5.3 生长抑素DNA疫苗对肉质的影响 |
| 5.4 生长抑素DNA疫苗的安全性 |
| 全文总结 |
| 创新与不足 |
| 创新之处 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）Myostatin DNA疫苗及前肽蛋白免疫动物对肌肉生长的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的与意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 Myostatin基因研究进展 |
| 2.1.1 Myostatin的发现与研究进展 |
| 2.1.2 Myostatin基因的分子结构及同源性 |
| 2.1.3 Myostatin蛋白的合成及生物学特性 |
| 2.1.4 Myostatin的信号通路 |
| 2.1.5 Myostatin基因的生物学功能 |
| 2.1.6 Myostatin拮抗剂的研究进展 |
| 2.1.7 Myostatin抗体的研究进展 |
| 2.2 疫苗研究进展 |
| 2.2.1 传统疫苗 |
| 2.2.2 核酸疫苗 |
| 2.2.3 核酸疫苗的免疫机理 |
| 2.2.4 乙肝表面抗原增强免疫原性的研究 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 绵羊Myostatin前肽对成肌细胞的分化作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 慢病毒载体、包装细胞和菌株 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 Myostatin前肽过表达慢病毒重组质粒的构建及制备 |
| 1.3.2 包装细胞株293T细胞的培养 |
| 1.3.3 Myostatin前肽过表达慢病毒的包装 |
| 1.3.4 滴度检测 |
| 1.3.5 C2C12细胞培养及转染 |
| 1.3.6 成肌细胞分化诱导及其指标测定 |
| 1.3.7 Westernblot检测蛋白表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 Myostatin前肽克隆 |
| 2.2 Myostatin前肽过表达慢病毒载体的构建和鉴定 |
| 2.3 WB检测结果 |
| 2.4 滴度结果 |
| 2.5 过表达Myostatin前肽对成肌细胞的分化 |
| 2.5.1 免疫荧光检测结果 |
| 2.5.2 肌管融合率的测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二 Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 工具酶和生化试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Myostatin前肽蛋白密码子优化及突变 |
| 1.2.2 pPIC9K-Msp重组质粒的构建 |
| 1.2.3 电转化毕赤酵母GS115 |
| 1.2.4 压力筛选 |
| 1.2.5 重组酵母转化子的诱导表达 |
| 1.2.6 WesternBlot鉴定Myostatin前肽的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pPIC9K-Msp的构建及酶切鉴定 |
| 2.2 压力筛选 |
| 2.3 重组质粒pPIC9K-Msp的PCR鉴定 |
| 2.4 表达产物SDS-PAGE和Westernblot鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三 Myostatin前肽蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 工具酶和生化试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计 |
| 1.2.2 PCR扩增 |
| 1.2.3 PCR产物胶回收 |
| 1.2.4 克隆载体pMD18-M的构建 |
| 1.2.5 重组质粒的构建 |
| 1.2.6 目的蛋白表达 |
| 1.2.7 目的蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 绵羊突变型Myostatin前肽蛋白序列的扩增 |
| 2.3 蛋白表达产物的分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验四 Myostatin前肽蛋白对羔羊肌肉生长的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物选择 |
| 1.2 试验时间地点 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 实验设计 |
| 1.3.2 屠宰实验 |
| 1.3.3 测定指标 |
| 1.3.4 采集样品 |
| 1.3.5 HE染色切片制作程序 |
| 1.3.6 荧光定量PCR |
| 1.3.7 数据处理与统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 注射Myostatin前肽重组蛋白对羔羊肌肉生长的作用 |
| 2.2 利用Myostatin前肽重组蛋白动物模型,研究肌肉纤维增大的生理和分子机制 |
| 2.3 注射Myostatin前肽后对Myostatin信号通路下游及相关基因的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验五 Myostatin成熟肽核酸疫苗的制备及对小鼠肌肉生长的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 工具酶和生化试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细菌基因组DNA的提取 |
| 1.2.2 核酸疫苗pV-SM的构建 |
| 1.2.3 质粒的大量培养及抽提纯化 |
| 1.2.4 实验动物的选择 |
| 1.2.5 免疫方法 |
| 1.2.6 样品采集 |
| 1.2.7 组织切片 |
| 1.2.8 荧光定量PCR |
| 1.2.9 抗体检测 |
| 1.2.10 数据处理与统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 Myostatin成熟肽核酸疫苗的制备 |
| 2.2 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对实验小鼠体重的影响 |
| 2.3 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对实验小鼠肌纤维的影响 |
| 2.4 免疫小鼠抗血清的检测 |
| 2.5 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对小鼠Myostatin信号通路下游相关基因影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 对BALB/c小鼠肌肉生长的影响 |
| 3.2 Myostatin成熟肽核酸疫苗产生免疫应答的机制 |
| 4 小结 |
| 试验六 Myostatin成熟肽核酸疫苗对羔羊肌肉生长的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 试验动物的选择 |
| 1.2.2 免疫方法 |
| 1.2.3 屠宰实验 |
| 1.2.4 测定指标 |
| 1.2.5 采集样品 |
| 1.2.6 组织切片 |
| 1.2.7 荧光定量PCR |
| 1.2.8 抗体检测 |
| 1.2.9 数据处理与统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对实验羔羊体重的影响 |
| 2.2 免疫Myostatin核酸疫苗后对实验羔羊肌纤维的影响 |
| 2.3 免疫羔羊抗血清的检测 |
| 2.4 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对羔羊Myostatin信号通路下游相关基因影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 载体的选择 |
| 3.2 试验动物的选择 |
| 3.3 对羔羊肌肉生长的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 结论 |
| 第四章 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要仪器设备 |
| 附录2 溶液及培养基配置 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（3）肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 基因组结构及其编码蛋白质 |
| 1.4 肠道病毒感染与免疫 |
| 1.5 手足口病疫苗研究现状 |
| 1.5.1 减毒活疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 表位疫苗 |
| 1.5.4 亚单位疫苗 |
| 1.5.5 DNA疫苗 |
| 1.5.6 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.6 乙肝病毒core蛋白(HBc)与病毒样颗粒(VLPs) |
| 1.7 手足口病疫苗效力评价的相关动物模型 |
| 1.8 杆状病毒表达系统与重组疫苗的研究 |
| 1.9 本研究目的与意义 |
| 第二章 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备及其免疫原性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂及实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆方法 |
| 2.2.2 重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 2.2.3 细胞实验细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.2.4 动物实验 |
| 2.2.5 免疫检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备 |
| 2.3.2 嵌合病毒样颗粒诱导特异性体液免疫应答 |
| 2.3.3 嵌合病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫应答 |
| 2.3.4 EV71小鼠适应株(Mouse adapted virus,MAV) EV71的制备 |
| 2.3.5 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的主动免疫保护 |
| 2.3.6 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的被动免疫保护 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 研究总结 |
| 第三章 基于杆状病毒表达EV71和CA16重组抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备与鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 相关仪器 |
| 3.1.2 细胞细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂 |
| 3.1.3 培养基及溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 重组转移质粒的构建 |
| 3.2.3 重组转移质粒在DH10MultiBac中的同源重组 |
| 3.2.4 重组Bacmid的提取 |
| 3.2.5 重组Bacmid的转染和重组杆状病毒的拯救 |
| 3.2.6 重组杆状病毒的免疫荧光检测 |
| 3.2.7 重组杆状病毒基因组DNA的提取 |
| 3.2.8 重组杆状病毒的增殖 |
| 3.2.9 杆状病毒的滴度测定 |
| 3.2.10 重组嵌合蛋白蛋白表达与鉴定 |
| 3.2.11 重组嵌合蛋白纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组转移质粒pFBDM P1-C3CD、pFBDM P1/SP70-C3CD、pFBDMP1/4M-C3CD的构建与鉴定 |
| 3.3.2 杆状病毒BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD、BacP1/4M-C3CD的拯救与鉴定 |
| 3.3.3 VLPs P1-C3CD VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的表达与鉴定 |
| 3.3.4 VLPs P1-C3CD、 VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的纯化与电镜观察 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 研究总结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）抑制素基因疫苗免疫杂交水牛的方法学和安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 抑制素基因免疫研究进展 |
| 1.1 抑制素常规免疫 |
| 1.1.1 天然抑制素免疫 |
| 1.1.2 化学合成抑制素片段免疫 |
| 1.1.3 重组抑制素免疫 |
| 1.2 抑制素基因免疫 |
| 1.2.1 抑制素基因免疫的原理和优势 |
| 1.2.2 抑制素基因疫苗的研究进展 |
| 1.3 抑制素基因疫苗的安全性 |
| 1.3.1 基因整合 |
| 1.3.2 自身免疫性疾病 |
| 1.3.3 基因毒性和生殖毒性 |
| 2 水牛同期发情研究进展 |
| 2.1 水牛发情周期的生理学特性 |
| 2.2 同期发情技术在水牛上的应用 |
| 2.2.1 Ovsynch方案 |
| 2.2.2 Presych-Ovsynch和Double-Ovsynch方案 |
| 2.2.3 CIDR-Ovsynch方案 |
| 2.2.4 CIDR与PMSG/eCG联合方案 |
| 2.2.5 E2与其他激素的联合方案 |
| 3 研究的目的与意义 |
| 第二章 抑制素基因疫苗肌肉注射的剂量对杂交水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌苗和主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 ELISA相关溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗制备 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 血样采集 |
| 1.2.4 同期发情方案与B超检查 |
| 1.2.5 血清中抗抑制素IgG抗体水平的检测 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各免疫剂量组的抗抑制素IgG抗体水平 |
| 2.2 各免疫剂量组杂交水牛的发情、排卵及受胎率 |
| 2.3 各免疫剂量组杂交水牛的大卵泡数量和直径 |
| 2.4 各免疫剂量组杂交水牛的排卵反应 |
| 2.5 各免疫剂量组优势卵泡直径的生长速度 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 抑制素基因疫苗鼻饲免疫的天数对杂交水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 ELISA相关溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗制备 |
| 1.2.2 试验动物和免疫方案 |
| 1.2.3 血液采集 |
| 1.2.4 同期发情 |
| 1.2.5 B超检查 |
| 1.2.6 抗抑制素IgG抗体水平的检测 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各免疫天数组的抗抑制素IgG抗体水平 |
| 2.2 各免疫天数组杂交水牛发情，排卵和受胎的比例 |
| 2.3 各免疫天数组的大卵泡的数量和直径及排卵反应 |
| 2.4 各免疫天数组优势卵泡直径的生长速度 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 抑制素基因疫苗两种免疫途径对杂交水牛在非繁殖季节的卵泡发育和发情排卵及受胎的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌苗和主要试剂 |
| 1.1.2 ELISA相关溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗制备 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 血样采集 |
| 1.2.4 同期发情方案与B超检查 |
| 1.2.5 抗抑制素IgG抗体水平的检测 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同途径免疫的抗抑制素IgG抗体水平 |
| 2.2 不同途径免疫杂交水牛的发情、排卵及受胎比例 |
| 2.3 不同途径免疫杂交水牛的大卵泡数量和直径 |
| 2.4 不同途径免疫杂交水牛的排卵反应 |
| 2.5 繁殖季节与非繁殖季节杂交水牛的繁殖性状 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 抑制素基因疫苗的生物安全性评价 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗制备 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 牛临床反应的检测 |
| 1.2.4 环境采样与细菌鉴定 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫后杂交水牛临床反应的检测 |
| 2.2 疫苗菌株在外界环境中的存活情况检测 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 发表的论文 |
| 致谢 |
（5）C.sinensis与HBV相互作用及EBOV的DNA疫苗免疫保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 C.SINENSIS与HBV的相互作用 |
| 前言 |
| 第一章 华支睾吸虫合并乙型肝炎病毒感染临床数据分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 华支睾吸虫合并乙型感染病毒感染对细胞因子表达的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 EBOV的DNA疫苗免疫保护作用研究 |
| 前言 |
| 第三章 EBOV-SGP和EBOV-GP1,2 基因真核表达质粒的构建与生物功能的初步分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 GP和SGP对小鼠免疫保护效力的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录一 在读期间发表论文情况 |
| 附录二 主要英文词汇表 |
| 致谢 |
（6）以减毒沙门氏菌为载体的H5N1流感疫苗及乙肝基因治疗药物研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胞内菌作为活疫苗载体的研究概况 |
| 1.1.1 减毒活疫苗载体在预防感染性疾病和治疗癌症中的应用 |
| 1.1.2 沙门氏菌毒力与沙门氏菌免疫 |
| 1.1.3 沙门氏菌作为载体传递异源抗原 |
| 1.1.4 沙门氏菌作为活疫苗载体的应用 |
| 1.1.5 沙门氏菌载体在抗肿瘤治疗中的应用 |
| 1.2 流感病毒概述 |
| 1.2.1 A型流感病毒的宿主范围 |
| 1.2.2 A型流感病毒的进化 |
| 1.2.3 A型流感病毒的致病机理 |
| 1.2.4 流感病毒感染的社会影响和防治措施 |
| 1.2.5 流感疫苗 |
| 1.3 乙肝病毒概述 |
| 1.3.1 乙肝病毒感染引起的疾病及药物治疗 |
| 1.3.2 乙肝病毒感染的基因治疗 |
| 1.3.3 基因疗法抵御乙肝病毒的作用机理 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 实验材料和实验方法 |
| 2.1 生物材料 |
| 2.2 实验设备和仪器 |
| 2.3 实验材料和试剂 |
| 2.3.1 分子生物学相关实验材料和试剂 |
| 2.3.2 细胞生物学相关实验材料和试剂 |
| 2.3.3 蛋白质分析相关实验材料和试剂 |
| 2.3.4 病毒学与动物学相关实验材料和试剂 |
| 2.4 分子克隆实验 |
| 2.4.1 大肠杆菌DH5α化转感受态细胞的制备及使用 |
| 2.4.2 Red重组法构建沙门氏菌缺失突变株SL368和SL301 |
| 2.4.3 沙门氏菌电转感受态细胞的制备及使用 |
| 2.4.4 质粒的提取 |
| 2.4.5 抗生素的配制 |
| 2.4.6 限制性酶切和PCR实验 |
| 2.5 细胞水平相关实验 |
| 2.5.1 细胞传代培养 |
| 2.5.2 细胞转染(脂质体转染法) |
| 2.5.3 沙门氏菌感染细胞 |
| 2.5.4 收获细胞 |
| 2.5.5 RNA的提取 |
| 2.6 蛋白质水平实验 |
| 2.6.1 SDS-PAGE及Western-blot |
| 2.7 病毒学相关实验 |
| 2.7.1 流感病毒的增殖 |
| 2.7.2 流感病毒滴度测定 |
| 2.7.3 流感病毒的保存 |
| 2.8 动物学及免疫学相关实验 |
| 2.8.1 动物的免疫及攻毒 |
| 2.8.2 酶联免疫实验(ELISA) |
| 2.8.3 小鼠脾细胞分离 |
| 2.8.4 酶联免疫斑点实验(ELISPOT) |
| 2.8.5 血凝抑制实验 |
| 2.8.6 HE染色实验 |
| 2.8.7 免疫组化实验 |
| 第三章 以减毒沙门氏菌为载体的新型口服流感疫苗及其免疫效力的研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 沙门氏菌口服流感疫苗Sal-HA-NA的构建 |
| 3.2.2 Sal-HA-NA介导流感病毒抗原蛋白在细胞、小鼠体内传递和表达 |
| 3.2.3 Sal-HA-NA能够诱导机体产生特异性体液免疫应答和黏膜免疫应答 |
| 3.2.4 Sal-HA-NA能够有效增强小鼠特异性细胞免疫应答 |
| 3.2.5 Sal-HA-NA能够提高小鼠针对H5N1亚型和H1N1亚型流感病毒感染的免疫保护 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 以减毒沙门氏菌为载体的新型乙肝治疗药物的研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 miR-122在小鼠体内可有效抑制乙肝病毒基因的表达 |
| 4.2.2 以减毒沙门氏菌为载体的乙肝治疗药物Sal-miR122的构建 |
| 4.2.3 miR-122通过减毒沙门氏菌SL301介导在细胞内的传递和表达 |
| 4.2.4 Sal-miR122能够有效抑制小鼠体内乙肝病毒基因的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读博士期间的学术成果 |
| 致谢 |
（7）非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的构建和免疫效力及安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 研究目的与意义 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 生长抑素基因免疫及其研究进展 |
| 1.1 生长抑素的免疫调控 |
| 1.2 生长抑素常规免疫 |
| 1.2.1 合成肽疫苗 |
| 1.2.2 基因工程疫苗 |
| 1.2.3 生长抑素被动免疫 |
| 1.3 生长抑素基因免疫 |
| 1.3.1 生长抑素DNA疫苗的构建 |
| 1.3.2 生长抑素DNA疫苗的免疫效力 |
| 1.3.3 生长抑素DNA疫苗的安全性 |
| 2 生长抑素基因免疫存在的问题及解决措施 |
| 2.1 提高生长抑素DNA疫苗的传递效率 |
| 2.1.1 免疫接种途径的选择 |
| 2.1.2 转染载体的选择 |
| 2.2 增强生长抑素DNA疫苗的免疫应答 |
| 2.2.1 细胞因子佐剂 |
| 2.2.2 CpG ODN佐剂 |
| 2.2.3 补体分子佐剂 |
| 2.2.4 其他分子佐剂 |
| 2.3 优化生长抑素DNA疫苗的免疫程序 |
| 3 染色体-质粒平衡致死体系的研究进展 |
| 3.1 不同标志基因的平衡致死系统 |
| 3.1.1 以asd为标志基因 |
| 3.1.2 以thyA为标志基因 |
| 3.1.3 以glnA为标志基因 |
| 3.1.4 hok-sok解离后致死系统 |
| 3.2 平衡致死系统的构建 |
| 3.2.1 缺陷型菌株的构建 |
| 3.2.2 真核表达互补质粒的构建 |
| 3.3 平衡致死系统的应用 |
| 3.4 平衡致死系统稳定性的影响因素 |
| 4 生长抑素基因免疫的前景与展望 |
| 第二章 非抗性筛选生长抑素真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、细菌和细胞 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 酶和试剂 |
| 1.1.4 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 非抗性筛选生长抑素真核表达质粒的构建 |
| 1.2.2 质粒的表达鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR扩增产物的检测 |
| 2.2 pVGS/2SS-asd质粒的鉴定 |
| 2.3 pGS/2SS-M4GFP-asd质粒的鉴定 |
| 2.4 pVGS/2SS-asd质粒转染后RT-RCR转录鉴定 |
| 2.5 pVGS/2SS-asd质粒转染后蛋白活性鉴定 |
| 2.6 pGS/2SS-M4GFP-asd质粒转染后RT-RCR转录鉴定 |
| 2.7 pGS/2SS-M4GFP-asd质粒转染后显微观察 |
| 2.8 GS/2SS-M4GFP融合蛋白的亚细胞定位 |
| 2.9 pGS/2SS-M4GFP-asd质粒转染后蛋白活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 生长抑素DNA疫苗平衡致死系统的建立 |
| 3.2 生长抑素融合基因表达产物的免疫活性 |
| 第三章 非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的稳定性研究 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 培养基的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 沙门氏菌电转化感受态的制备 |
| 1.2.2 质粒电转化C500沙门氏菌 |
| 1.2.3 阳性克隆的筛选 |
| 1.2.4 重组菌体外稳定性检测 |
| 1.2.5 重组菌体内稳定性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原代重组菌中质粒的双酶切鉴定 |
| 2.2 重组菌体外稳定性鉴定 |
| 2.2.1 传代重组菌保守基因invA的扩增 |
| 2.2.2 传代重组菌中质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.3 传代重组菌各代细菌的生长规律观察 |
| 2.3 重组菌的体内稳定性鉴定 |
| 2.3.1 脏器中菌落生长计数 |
| 2.3.2 菌落 PCR鉴定质粒的稳定性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的免疫应答及影响因素 |
| 第一节 非抗性筛选生长抑素DNA疫苗免疫程序的优化 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗菌 C500(pVGS/2SS-asd)中质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.2 C500(pVGS/2SS-asd)疫苗的制备 |
| 1.2.3 疫苗的免疫及样品采集 |
| 1.2.4 实验动物饲养管理 |
| 1.2.5 生长抑素IgG抗体效价的检测 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pVGS/2SS-asd质粒的酶切鉴定 |
| 2.2 不同免疫剂量组小鼠的生长抑素抗体效价 |
| 2.3 不同免疫程序组小鼠的生长抑素抗体效价 |
| 2.4 不同免疫剂量组小鼠的增重比较 |
| 2.5 不同免疫程序组小鼠的增重比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 平衡致死系统对生长抑素DNA疫苗免疫效果的影响 |
| 3.2 免疫程序对非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的影响 |
| 第二节 非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的免疫应答 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗菌C500(pVGS/2SS-asd)中质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.2 疫苗的制备 |
| 1.2.3 疫苗的免疫及样品采集 |
| 1.2.4 实验动物饲养管理 |
| 1.2.5 生长抑素抗体检测 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生长抑素IgG抗体效价 |
| 2.2 生长抑素IgG分型抗体效价 |
| 2.3 生长抑素IgA抗体效价 |
| 3 讨论 |
| 3.1 非抗性生长抑素DNA疫苗诱导产生的免疫应答 |
| 3.2 免疫途径对非抗性筛选生长抑素DNA疫苗免疫应答的影响 |
| 第五章 非抗性筛选生长抑素DNA疫苗在小鼠体内的组织分布 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗的制备 |
| 1.2.2 实验分组与免疫 |
| 1.2.3 样品的采集 |
| 1.2.4 RNA的提取与检测 |
| 1.2.5 cDNA第一条链的合成 |
| 1.2.6 内参基因的PCR扩增 |
| 1.2.7 目的基因的PCR扩增 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA质量检测 |
| 2.2 重组菌口服免疫后在小鼠组织中的表达分布 |
| 2.3 重组菌肌肉注射后在小鼠组织中的表达分布 |
| 3 讨论 |
| 3.1 非抗性筛选生长抑素DNA疫苗在小鼠体内的表达分布 |
| 3.2 免疫途径对生长抑素DNA疫苗表达分布的影响 |
| 第六章 非抗性筛选生长抑素DNA疫苗免疫小鼠的毒性研究 |
| 第一节 一般毒性的观察与检测 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 疫苗 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗的制备 |
| 1.2.2 实验分组 |
| 1.2.3 血常规检测 |
| 1.2.4 石蜡切片的制作 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 血液学指标检测 |
| 2.2 组织病理学观察 |
| 3 讨论 |
| 3.1 生长抑素DNA疫苗免疫后对小鼠血液指标的影响 |
| 3.2 生长抑素DNA疫苗免疫后对小鼠组织的毒性分析 |
| 第二节 染色体整合分析 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 疫苗 |
| 1.1.2 酶及试剂盒 |
| 1.1.3 其它试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗的制备及免疫 |
| 1.2.2 组织的准备 |
| 1.2.3 基因组DNA的提取 |
| 1.2.4 基因组DNA的纯化 |
| 1.2.5 基因组DNA浓度测定 |
| 1.2.6 内参基因的扩增 |
| 1.2.7 目的基因的扩增 |
| 1.2.8 PCR灵敏度的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR灵敏度检测结果 |
| 2.2 内参基因扩增结果 |
| 2.3 目的基因扩增结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 已发表研究论文 |
| CURRICULUM VITAE |
| 致谢 |
（8）柔嫩艾美耳球虫免疫调节型多价DNA疫苗的构建及免疫效果观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡抗球虫感染的免疫机制 |
| 1 鸡球虫的生活史 |
| 2 鸡球虫的免疫原性 |
| 3 鸡球虫的入侵机理 |
| 4 宿主的肠道免疫系统 |
| 5 宿主的免疫应答作用 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫抗原基因的研究进展 |
| 1 虫体表面抗原基因 |
| 2 虫体细胞器抗原基因 |
| 3 有性生殖阶段抗原基因 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 DNA疫苗的研究进展 |
| 1 DNA疫苗的概念及特点 |
| 2 DNA疫苗的作用机制 |
| 3 增强DNA疫苗免疫效果的方法 |
| 4 鸡球虫DNA疫苗的研究 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2免疫剂量的筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2免疫途径的筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第六章 柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2首免日龄与免疫次数的筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第七章 柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2稳定性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第八章 柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的交叉免疫保护性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第九章 柔嫩艾美耳球虫MZ5-7和SO7基因的表位分析及其T细胞表位片段的克隆 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第十章 柔嫩艾美耳球虫免疫调节型多价表位DNA疫苗的构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第十一章 柔嫩艾美耳球虫免疫调节型多价表位DNA疫苗的免疫保护性实验 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 全文总结 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）禽流感病毒M2重组多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽流感病毒研究进展 |
| 1.1 禽流感病毒的分类、命名 |
| 1.2 禽流感的发生及危害 |
| 1.3 禽流感病毒的形态结构及其理化特性 |
| 1.4 禽流感病毒分子生物学研究进展 |
| 1.4.1 禽流感病毒的基因组 |
| 1.4.2 禽流感病毒的蛋白结构 |
| 1.5 禽流感病毒的复制 |
| 1.5.1 病毒粒子的吸附、侵入与脱壳 |
| 1.5.2 基因组的转录和复制 |
| 1.5.3 AIV基因表达的调控 |
| 1.5.4 AIV的装配与释放 |
| 1.6 禽流感与人禽流感 |
| 1.7 禽流感的防治 |
| 1.7.1 综合防治 |
| 1.7.2 疫苗接种 |
| 1.7.3 疫区的控制 |
| 1.8 禽流感疫苗研究进展 |
| 1.8.1 灭活全病毒疫苗 |
| 1.8.2 纯化组分疫苗 |
| 1.8.3 减毒活疫苗 |
| 1.8.4 重组亚单位疫苗 |
| 1.8.5 重组活载体疫苗 |
| 1.8.6 合成多肽疫苗 |
| 1.8.7 核酸疫苗 |
| 1.8.8 RNAi疫苗 |
| 2 粘膜免疫研究进展 |
| 2.1 粘膜免疫系统基本组成 |
| 2.2 粘膜免疫系统的诱导与效应细胞 |
| 2.3 分泌型IgA作用 |
| 2.4 粘膜免疫的优点 |
| 2.5 粘膜疫苗佐剂 |
| 第二章 禽流感病毒M2蛋白及其膜外序列的多肽疫苗研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 基于M2蛋白及其M2e表位的疫苗研究进展 |
| 1.2 本研究的目的和内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料、载体、菌株、工具酶 |
| 2.2 主要试剂及溶液的配制 |
| 2.2.1 质粒抽提相关溶液 |
| 2.2.2 SDS-PAGE相关溶液 |
| 2.2.3 Western blotting相关溶液 |
| 2.2.4 ELISA所用试剂 |
| 2.2.5 蛋白纯化相关试剂 |
| 2.2.6 其它相关溶液 |
| 2.3 引物设计和序列分析 |
| 2.4 M基因的克隆 |
| 2.4.1 PCR引物 |
| 2.4.2 病毒RNA提取 |
| 2.4.3 RT-PCR |
| 2.4.4 M基因的TA克隆 |
| 2.4.5 序列测定及分析 |
| 2.4.6 M2基因及缺失跨膜区的M2基因的克隆 |
| 2.5 基于M2基因膜外序列的融合基因构建 |
| 2.5.1 M2e比对及密码子优化 |
| 2.5.2 PCR引物 |
| 2.5.3 M2eHBc和M2eHBc+融合基因片段的获得 |
| 2.6 原核表达载体的构建 |
| 2.6.1 pET32a-△M2原核表达载体的构建 |
| 2.6.2 pMALc2x-M2eHBc和 pMALc2x-M2eHBc+原核表达载体的构建 |
| 2.7 目的基因的诱导表达 |
| 2.7.1 缺失跨膜区的M2蛋白表达 |
| 2.7.2 M2eHBc和M2eHBc+融合蛋白表达 |
| 2.7.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.8 原核表达重组蛋白纯化及浓度测定 |
| 2.9 表达产物的抗原性分析 |
| 2.10 纯化表达蛋白的交叉抗原性检测 |
| 2.11 电镜观察原核表达的融合蛋白 |
| 2.12 免疫小鼠 |
| 2.13 抗体效价检测 |
| 2.13.1 血清收集方法 |
| 2.13.2 HBcAg抗体检测 |
| 2.13.3 M2特异性抗体效价检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 M基因RT-PCR扩增和重组载体pMD18T-M鉴定 |
| 3.2 M基因序列比对及分子进化分析 |
| 3.3 缺失跨膜区的M2基因扩增及pET32a-△M2鉴定 |
| 3.4 M2e与HBcAg融合基因的扩增及原核表达载体鉴定 |
| 3.5 融合蛋白的表达及蛋白表达形式分析 |
| 3.5.1 pET32a-OM2表达分析 |
| 3.5.2 pMALc2x-M2eHBc和pMALc2x-M2eHBc+表达分析 |
| 3.6 原核表达的融合蛋白抗原性分析 |
| 3.7 融合蛋白的交叉反应性检测 |
| 3.8 电镜观察结果 |
| 3.9 抗体效价检测 |
| 3.9.1 抗血清中HBcAg抗体 |
| 3.9.2 抗血清中M2抗体效价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 M基因的克隆与序列分析 |
| 4.2 融合基因的构建 |
| 4.3 外源基因的原核表达 |
| 4.4 病毒样颗粒 |
| 4.5 融合蛋白交叉抗原性及抗体效价 |
| 第三章 LTB的克隆与表达及其与M2eHBc+蛋白的粘膜免疫研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 LT与CT的结构与功能 |
| 1.2 LT和CT的粘膜免疫佐剂研究 |
| 1.3 LT与CT B亚单位的免疫佐剂研究 |
| 1.4 本研究的目的和内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料、载体、菌株、工具酶 |
| 2.2 LT基因的克隆 |
| 2.2.1 PCR模板制备、引物设计及PCR扩增 |
| 2.2.2 LT基因的TA克隆 |
| 2.3 LTB的原核表达载体构建 |
| 2.3.1 LTB PCR引物合成、PCR扩增 |
| 2.3.2 pET32a-LTB原核表达载体构建 |
| 2.4 LTB亚单位与M2eHBc+的融合表达载体构建 |
| 2.5 目的基因的诱导表达 |
| 2.6 表达产物抗原性分析 |
| 2.7 体外GM1-ELISA检测 |
| 2.8 电镜观察原核表达的融合蛋白LBM2eHBc+ |
| 2.9 小鼠免疫接种 |
| 2.10 抗体效价检测 |
| 2.10.1 免疫血清及肠分泌液制备 |
| 2.10.2 血清抗原特异性IgG效价检测 |
| 2.10.3 肠分泌液中抗原特异性IgA检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 LT全长基因的克隆及序列分析 |
| 3.2 pET32a-LTB原核表达载体构建 |
| 3.3 pMALc2x-LBM2eHBc+原核表达载体的构建 |
| 3.4 融合蛋白的表达及蛋白表达形式 |
| 3.4.1 pET32a-LTB的表达 |
| 3.4.2 pMALc2x-LBM2eHBc+的原核表达 |
| 3.5 重组蛋白的抗原性分析 |
| 3.6 重组蛋白的GM1-ELISA |
| 3.7 电镜观察结果 |
| 3.8 抗体效价检测 |
| 3.8.1 血清M2特异性IgG检测结果 |
| 3.8.2 肠冲洗液M2特异性IgA检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 原核表达系统中目的蛋白的可溶性表达 |
| 4.2 LTB对共免疫原的粘膜佐剂活性 |
| 第四章 M2eHBc+融合基因的DNA疫苗免疫研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 DNA疫苗 |
| 1.1.1 DNA疫苗的发展及其优点 |
| 1.1.2 DNA疫苗诱发机体产生免疫保护的机制 |
| 1.1.3 加强DNA免疫效应的策略 |
| 1.1.4 DNA疫苗与其它疫苗的二次免疫(初免-加强)策略 |
| 1.2 DNA疫苗与粘膜免疫 |
| 1.3 禽流感病毒DNA疫苗的研究 |
| 1.4 本研究的目的与内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂及溶液的配制 |
| 2.2.1 质粒大量抽提所需试剂配制 |
| 2.2.2 细胞培养及转染相关试剂配制 |
| 2.2.3 T细胞增殖试验相关试剂配制 |
| 2.3 pcDNA3-LTB、 pcDNA3-M2eHBc+及pcDNA3-LBM2eHBc+构建 |
| 2.4 转染及免疫用质粒的制备及浓度纯度测定 |
| 2.4.1 转染及免疫用质粒的制备 |
| 2.4.2 质粒浓度及质粒纯度测定 |
| 2.5 体外转染哺乳动物细胞 |
| 2.6 免疫小鼠 |
| 2.7 IgG和IgA抗体效价检测 |
| 2.8 T细胞增殖试验 |
| 2.8.1 小鼠脾脏淋巴细胞分离 |
| 2.8.2 T细胞增殖试验(MTT法) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DNA疫苗相关载体的构建 |
| 3.2 体外转染Western blotting分析 |
| 3.3 DNA疫苗抗体检测结果 |
| 3.3.1 血清IgG-M2检测结果 |
| 3.3.2 肠洗液IgA-M2检测结果 |
| 3.4 T细胞增殖的试验结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 毕氏酵母表达的LBM2eHBc+重组基因多肽疫苗及其抗原性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 毕氏酵母表达所用各种试剂与溶剂的配制 |
| 2.3 LBM2eHBc+融合基因毕氏酵母表达载体的构建 |
| 2.4 LBM2eHBc+融合基因转化毕氏酵母GS115 |
| 2.4.1 GS115感受态的制备 |
| 2.4.2 重组表达载体pPIC9K-LBM2eHBc+线性化 |
| 2.4.3 表达载体pPIC9K-LBM2eHBc+转化GS115感受态细胞 |
| 2.5 LBM2eHBc+融合基因在毕氏酵母GS115中的表达 |
| 2.5.1 转化子的PCR快速鉴定 |
| 2.5.2 阳性转化子的Dot-ELISA鉴定 |
| 2.5.3 酵母整合的PCR分析 |
| 2.5.4 融合基因在酵母中的表达 |
| 2.6 表达蛋白的SDS-PAGE分析及Western-blotting分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 酵母表达载体的构建 |
| 3.2 转化GS115阳性克隆的PCR鉴定及Dot-ELISA鉴定 |
| 3.3 PCR分析外源基因在酵母中的整合 |
| 3.4 外源基因的诱导表达 |
| 3.5 表达蛋白的Western blotting分析 |
| 4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 其它研究工作 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（10）SARS-CoV DNA疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究目的和意义 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.SARS及SARS冠状病毒研究进展 |
| 2.DNA疫苗及其免疫佐剂和免疫途径研究进展 |
| 第二章 SARS-CoV S、N、M和E结构蛋白的DNA疫苗初步研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 第三章 IL-2基因佐剂对SARS-CoV N蛋白DNA疫苗的免疫增强作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 第四章 IL-2基因佐剂对SARS-CoV S蛋白DNA疫苗的免疫增强作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 第五章 以减毒沙门氏菌为SARS-CoV N DNA口服疫苗载体的初步研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第六章 不同免疫途径对SARS-CoV S蛋白DNA疫苗免疫效果的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 已发表和撰写的文章 |
| 致谢 |
四、免疫途径及载体对乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究(摘要)（论文参考文献）
- [1]生长抑素DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）对于育肥猪的生产性试验研究[D]. 周子超. 华中农业大学, 2019
- [2]Myostatin DNA疫苗及前肽蛋白免疫动物对肌肉生长的影响[D]. 杜玮. 石河子大学, 2018(02)
- [3]肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究[D]. 霍春玲. 武汉大学, 2017(02)
- [4]抑制素基因疫苗免疫杂交水牛的方法学和安全性研究[D]. 刘青. 华中农业大学, 2016(12)
- [5]C.sinensis与HBV相互作用及EBOV的DNA疫苗免疫保护作用研究[D]. 李文芳. 中山大学, 2016(06)
- [6]以减毒沙门氏菌为载体的H5N1流感疫苗及乙肝基因治疗药物研究[D]. 裴增林. 武汉大学, 2015(03)
- [7]非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的构建和免疫效力及安全性研究[D]. 梁爱心. 华中农业大学, 2009(09)
- [8]柔嫩艾美耳球虫免疫调节型多价DNA疫苗的构建及免疫效果观察[D]. 宋小凯. 南京农业大学, 2008(08)
- [9]禽流感病毒M2重组多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究[D]. 张国广. 厦门大学, 2007(11)
- [10]SARS-CoV DNA疫苗研究[D]. 胡慧. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(02)