一、SARS冠状病毒核蛋白的质谱鉴定(论文文献综述)
武奇[1](2021)在《IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究》文中研究说明传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要表现为呼吸道与肾脏疾病。IBV目前仍是危害养禽业的重要病原体之一,给全球的养禽业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在控制IB方面扮演着重要作用,IBV抗原的不断变异严重制约了现有的疫苗研发策略和血清学诊断。S蛋白是含有丰富中和抗原表位的表面蛋白,也是病毒进入宿主细胞的关键蛋白。但是目前对于S蛋白功能的认识及其与宿主细胞的互作还知之甚少。因此,本研究围绕IBV防控关键技术的开发,从S蛋白广谱中和表位鉴定及S蛋白与宿主细胞互作两个方面进行了研究。具体内容如下:1、传染性支气管炎病毒S蛋白新的关键抗原表位鉴定本研究首先利用软件对IBV S蛋白进行分析,根据S蛋白序列的抗原性、亲水性、表面抗原指数、保守性等指标,选取并人工合成五条抗原性和亲水性好、高度保守的多肽。通过多肽和血清交叉反应,证明五条多肽均与IBV血清有反应原性,其中Pep1的反应性最好,可以与检测的5个血清型中的4个血清型血清有很好的交叉反应性,仅仅不与New cluster型毒株CK/CH/2010/JT1的血清发生交叉反应。人工合成CK/CH/2010/JT1株的该段多肽序列,命名Pep6。通过对多肽序列比较分析,发现Pep1与Pep6序列存在5个氨基酸差异。多肽血清交叉反应结果显示Pep6不仅可以与CK/CH/2010/JT1血清反应,同时与所有检测血清均发生交叉反应。为了确定影响抗原性改变的关键氨基酸,对多肽进行截短和单个氨基酸突变,最后确定16R氨基酸是决定抗原表位广谱性的关键氨基酸。对NCBI数据库中所有的全基因毒株进行序列分析,发现传统的Mass型毒株均是16K毒株,而目前在中国流行的QX型,TW-1型等毒株均是16R突变株,进一步分析发现,16R突变株自20世纪90年代开始出现,随后发展成为流行优势株,目前在全球各大洲均有分布。本研究鉴定了一个广谱的抗原表位,并证明了 16R氨基酸是该抗原表位具有广谱性的关键。这为新型广谱疫苗的研发和检测方法的建立提供了一定理论指导。2、检测IBV抗体多肽ELISA方法的建立及初步应用本实验室在前期的IBV流行病学调查过程中发现,现有的商品化IBV抗体检测试剂盒,不能很好的检测出新型IBV变异株的血清抗体。利用Pep6抗原表位多肽作为包被抗原,建立检测IBV抗体的pELISA方法。本研究首先对检测条件进行优化,确定pELISA最佳反应条件为:最佳包被浓度0.63 μg/mL;血清最佳稀释度为1:200;血清最佳孵育时间为60 min;酶标抗体最佳孵育时间60 min;底物最佳反应时间20 min。确定pELISA的临界值为0.185。批间和批内重复性检测结果显示变异系数均小于10%,具有很好的重复性。特异性检测结果表明pELISA其他禽类病毒阳性血清均不发生非特异性反应。以IFA为参考方法,测定了 250份临床血清样品,结果显示,pELISA的敏感性、特异性和准确性分别为99.14%、94.12%和98.80%,显着高于商品化试剂盒。为评估pELISA在检测IBV疫苗引起的免疫应答中的适用性,本研究测定了 IBVH52、4/91疫苗免疫后不同时间点采集的血清,结果显示pELISA最早在疫苗接种后7 d就能检测出IBV特异性抗体,而商品化试剂盒在免疫后14 d才能检测出IBV特异性抗体。进一步分析发现,pELISA检测出的阳性率明显高于商品化的ELISA试剂盒,提示本研究建立的pELISA在检测IBV抗体和评价IBV疫苗方面具有一定的应用价值。3、应用pELISA替代中和实验评估IBV疫苗免疫应答的初步研究鸡群中血清的中和抗体是反映鸡群免疫状况的主要指标,也是评价疫苗免疫效果的关键指标之一。传统上用中和试验测定血清中和抗体,但中和实验操作复杂,技术程度较高,制约了疫苗应用后的效率评价。然而,目前还没有简单、快速的检测IBV中和抗体的替代方法。为此,探究了 pELISA作为一种潜在替代中和实验评价IBV疫苗的免疫应答的可能。首先制备Pep6的多抗血清,ELISA结果显示,多肽血清与多肽能发生特异性反应。病毒与血清的交叉中和实验结果显示Pep6的多抗血清能够中和IBV病毒,中和效价为1:8,表明Pep6含中和抗原表位。随后,应用pELISA与中和实验比较检测IBV 阳性血清,结果显示血清中和效价与pELISA效价具有很好的正相关性。进一步比较检测了 M41、H52、CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 毒株免疫/攻毒后不同时间点采集的血清,结果显示免疫/攻毒后血清的中和效价和ELISA效价均随免疫时间逐渐升高。各毒株血清的中和效价与pELISA效价的具有明显的正相关性,总相关系数达到0.83。该方法的建立为临床基层IBV疫苗免疫效果评价提供了技术条件。4、IBV S1蛋白与宿主细胞膜蛋白互作的研究IBV S蛋白在病毒感染复制过程起关键作用,通常S1与识别宿主受体并结合细胞相关,而S2促进病毒囊膜与细胞膜融合。尽管IBV是最早发现的冠状病毒,目前对IBV S1与宿主细胞互作的认识仍非常有限,还没有鉴定出IBV的蛋白受体,同时对于IBV入胞机制仍知之甚少。为此本研究构建了正确表达S1-IgGFc融合蛋白的真核质粒pCAGGS-S1-IgGFc,利用Protein G纯化柱纯化了 S1-IgGFc融合蛋白,然后应用细胞膜提取试剂盒提取CEK细胞的膜蛋白,将纯化的融合蛋白与CEK细胞膜蛋白进行免疫共沉淀(Co-IP),SDS-PAGE银染结果显示,与对照相比发现了 3条差异条带。将差异条带送质谱测序,共鉴定出GRP78、ANXA2、HSPA9、Vimentin等4种宿主蛋白与IBV S1蛋白互作,提示这些蛋白可能在病毒感染细胞发挥某种作用,为进一步探究IBV与宿主细胞膜蛋白的互作机制研究提供一定的材料和理论基础。5、GRP78蛋白促进IBV在CEK细胞中的复制GRP78蛋白又称HSPA5蛋白,是热休克蛋白家族的成员之一。传统上认为GRP78是一种ER伴侣蛋白,目前GRP78蛋白因在多种病毒的感染过程中发挥重要作用而被人们所熟知。在上一部分研究的基础上,通过Co-IP实验,进一步确定了 IBV S1蛋白与GRP78蛋白确实存在相互作用。本研究用抗GRP78多克隆抗体封闭CEK细胞,抑制GRP78蛋白的表达,结果发现抗GRP78多克隆能够有效抑制IBV M41在CEK细胞中的复制。进一步用siRNA干扰实验证明,当CEK细胞表面的GRP78的表达被抑制时,IBVM41的感染也被显着抑制。非易感细胞重建实验结果提示,不同浓度的GRP78真核质粒(0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg)转染CEF细胞,随着转染质粒浓度不断升高,IBVM41感染CEF细胞的感染能力逐渐增强,成明显的正相关。综上所述,GRP78蛋白在IBV感染CEK细胞过程中扮演了重要角色,该GPR78可能促进IBV进入宿主细胞。
张梦佳[2](2021)在《猪δ冠状病毒的分离鉴定及辅助蛋白在病毒复制及致病中的作用研究》文中提出猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)属于套式病毒目冠状病毒科δ冠状病毒属,是一种新发的猪源冠状病毒,主要感染新生仔猪,造成仔猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。临床上经常与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRo V)等其他腹泻相关病毒混合感染。自2014年PDCo V在美国首次爆发后,迅速传播至全球各国,给全球养猪业造成巨大的经济损失。冠状病毒除了编码结构蛋白和参与基因组转录、复制的非结构蛋白外,还编码一系列特有的辅助蛋白。目前的研究表明大部分辅助蛋白对于病毒复制是非必需的,但可能影响病毒的致病性。PDCo V作为唯一在体外成功分离的δ冠状病毒,已经被鉴定编码三种辅助蛋白NS6、NS7和NS7a,现有研究表明这三种辅助蛋白参与宿主天然免疫反应的调节,但其对病毒复制及致病性的影响尚不明确。鉴于此,本研究成功分离了PDCo V流行毒株CHN-HG-2017,建立了全球第一个PDCo V的反向遗传操作系统,首次揭示了PDCo V的辅助蛋白在病毒复制及致病性中的作用。主要内容如下:1.PDCo V CHN-HG-2017株的分离鉴定,全基因组序列分析及其致病性研究从RT-PCR检测为阳性的腹泻仔猪粪便中成功分离到一株PDCo V,命名为CHNHG-2017,采用间接免疫荧光和透射电镜对分离的病毒进行了鉴定。通过核苷酸序列比对分析,发现CHN-HG-2017的全基因组与其他PDCo V毒株的全基因组同源性为97.6%-99.1%。使用基因重组分析软件RDP4对CHN-HG-2017的全基因组序列进行分析,发现CHN-HG-2017可能是中国毒株CH/SXD1/2015和越南毒株Vietnam/Ha Noi6/2015的重组毒株。动物试验证实PDCo V CHN-HG-2017株对5日龄仔猪具有较强致病性,在接种后1-7天,仔猪出现腹泻、呕吐、厌食和嗜睡等典型症状。荧光定量PCR检测发现感染仔猪的粪便排毒一直持续到接种后14天。病毒中和试验结果显示感染仔猪在接种后第4天即产生中和抗体且以逐渐升高的趋势持续到接种后21天。2.成功建立了PDCo V CHN-HG-2017株的反向遗传操作系统将PDCo V CHN-HG-2017株全长基因组划分为六个连续的片段,通过体外连接获取病毒全长c DNA,体外转录后将全长转录本电转至LLC-PK1细胞成功拯救PDCo V。将拯救病毒r PDCo V和野生型PDCo V进行对比分析,发现两者的全基因组序列除了分子标记外完全相同,在LLC-PK1细胞上可产生相同的细胞病变,病毒蛋白的表达水平相当;对拯救病毒r PDCo V的生物学特性进行研究,发现其与野生型PDCo V在LLC-PK1细胞上产生的噬斑大小相似,并且在LLC-PK1和IPI-2I细胞中生长动力学相似,表明我们成功建立了PDCo V反向遗传操作系统,为研究病毒编码蛋白在病毒复制和致病中的作用奠定了基础。3.揭示了PDCo V辅助蛋白在病毒复制及致病性中的作用利用建立的PDCo V反向遗传操作系统成功拯救了缺失NS6、NS7基因的重组PDCo V,PDCo V缺失NS6或NS7后在体外仍然可以复制,表明NS6和NS7对PDCo V的复制都不是必需的。在对重组病毒的生物学特性进行研究时发现,尽管缺失NS7的重组病毒r PDCo V-△NS7在体外表现出与亲本病毒相似的生长动力学,但缺失NS6的重组病毒r PDCo V-△NS6-GFP的复制效率明显降低,表明PDCo V辅助蛋白NS6可能在促进病毒复制中起关键作用。同时,动物致病性试验表明接种r PDCo V-△NS7或野生型PDCo V的仔猪表现出相似的腹泻评分和病理损伤。然而r PDCo V-△NS6-GFP感染的仔猪没有表现出任何临床症状,表明NS6蛋白是PDCo V的重要毒力因子,因此NS6缺失的PDCo V可作为潜在的减毒活疫苗候选毒株。此外,我们设计了一种高效表达绿色荧光蛋白的重组PDCo V,可作为高通量药物筛选和中和抗体检测的工具。4.探索了PDCo V辅助蛋白NS6影响病毒复制及致病性的机理为了进一步分析PDCo V辅助蛋白NS6影响病毒复制及致病性的作用机制,将PDCo V NS6与其他结构蛋白及辅助蛋白NS7、NS7a共转染至HEK-293T细胞,免疫共沉淀结果显示PDCo V辅助蛋白NS6与辅助蛋白NS7及NS7a具有相互作用。通过反向遗传操作系统成功将Flag标签插入到病毒辅助蛋白NS6的C端,获得表达NS6-Flag的PDCo V重组病毒。将重组病毒感染LLC-PK1细胞后,通过免疫共沉淀和质谱分析鉴定出了126种可能与辅助蛋白NS6互作的宿主蛋白。对筛选的蛋白进行GO注释发现大部分蛋白均为细胞骨架蛋白,推测辅助蛋白NS6可能通过与细胞骨架相关蛋白相互作用调节病毒与宿主细胞的结合及入侵、释放等多个环节进而影响病毒的复制能力和致病性。
史晗[3](2021)在《猪肠道α冠状病毒辅助蛋白NS7a调控Ⅰ型IFN信号通路的机制研究》文中研究表明机体在与病原体长期抗感染与感染的博弈中,伴随着遗传进化逐渐形成一种先天性的阻止外来微生物或病原体入侵的免疫防御能力,这种先天性免疫系统被称为天然免疫。作为机体抵御外源病原微生物的第一道防线,其具有非特异性、广谱性、快速反应性及遗传性的特点。其中Ⅰ型干扰素(type I Interferon,IFN-I)信号通路是天然免疫过程中发挥重要作用的一环。病原体及微生物入侵机体细胞内后,胞内模式识别受体可以识别到病原体及其产物并被激活,通过级联放大反应活化其所介导的下游信号通路并产生干扰素,继而激活Jak-STAT信号通路产生一系列干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs),直接或间接的介导病原体清除并维持免疫平衡。冠状病毒(Coronavirus,CoVs)广泛存在于自然界中,宿主范围广泛,常见感染人类、哺乳动物及禽类。近年来,SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2的相继爆发严重影响到人类的生命安全和社会经济的正常发展秩序,引起人们对冠状病毒的高度关注。与此同时,猪肠道冠状病毒TGEV、PEDV、PDCoV和SADS-CoV在猪群中传播迅速,致死率高,对全球生猪养殖业造成重创,这使得全面剖析其病毒-宿主的相互作用及其分子机制等科学问题亟待解决。本研究以SADS-CoV的NS7a蛋白为研究对象,旨在研究NS7a在Ⅰ型干扰素信号通路应答过程中所发挥的作用及潜在调控机制。为了探究NS7a在病毒诱导激活的Ⅰ型干扰素信号通路中的作用,本研究采用病毒类似物poly(I:C)(Polyinosinic-polycytidylic acid)诱导活化HEK293T细胞中IFNβ、ISRE(Interferon-stimulated response elements)、IRF3(Interferon regulatory factor 3)、NF-κB(Nuclear factor-κB)的启动子活性及干扰素信号通路,并采用双荧光报告基因系统、实时荧光定量PCR分析NS7a对上述启动子活性剂信号通路相关信号分子的m RNA水平的影响;此外,利用蛋白质免疫印记评价NS7a对poly(I:C)所诱导的信号通路信号分子蛋白表达水平的影响。结果显示,NS7a显着抑制IFNβ、ISRE和NF-κB的启动子水平;此外,NS7a同样显着地抑制信号通路下游效应分子DDX58、MDA5、IRF3、TBK1、STING,STAT2、OASL、ISG15和IFIT2的m RNA转录水平。免疫印迹分析结果显示,NS7a同样显着抑制Ⅰ型干扰素相关分子的蛋白表达,使TBK1、P-TBK1、STING、P-STING、IRF3、P-IRF3、STAT1、P-STAT1、P-STAT2及IRF9的蛋白水平显着下调。为寻找NS7a在IFN-I信号通路中可能的作用靶点,结合前期数据,本研究首先构建了IFN-I通路各分子的真核表达质粒,重点分析信号通路上游分子与NS7a的蛋白互作。co-IP结果显示,NS7a并未与IFN-I通路上游分子产生直接相互作用。但试验过程中的另一现象引起我们的注意,即NS7a可使HEK293T细胞形态异常、死亡增加,该现象提示:NS7a可能诱导细胞凋亡。为证实这一猜想,本研究采用镜下形态学观察、蛋白质免疫印记和流式细胞术等经典凋亡检测方法,验证发现NS7a在转染48h后不仅可以显着抑制干扰素信号通路,也可以有效诱导HEK293T细胞发生凋亡,在NS7a转染细胞44 h后,细胞发生晚期凋亡占比约12%,早期凋亡占比约40%。内源性co-IP结果显示,NS7a与caspase-8酶原存在相互作用。进一步研究发现Z-VAD无法抑制NS7a引起的HEK293T细胞凋亡。综上所述,本研究发现SADS-CoV的NS7a蛋白可以抑制由poly(I:C)刺激激活的Ⅰ型干扰素信号通路并诱导HEK293T细胞发生凋亡,推测NS7a可能通过与caspase-8相互作用,激活外源性凋亡通路从而导致HEK293T细胞发生凋亡。
万伟玮[4](2020)在《抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究》文中认为沙粒病毒是一类有囊膜包裹的负链分节RNA病毒,其多个成员如瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus,GTOV)、胡宁病毒(Junin virus,JUNV)、拉沙病毒(Lassa virus,LASV)、Lujo病毒(Lujo virus,LUJV)、马秋波病毒(Machupo virus,MACV)、萨比亚病毒(Sabia virus,SABV)、和白水河病毒(Whitewater Arroyo virus,WWAV)在西非和南美等地区流行,可以导致感染者出现出血热等症状,严重威胁人类健康。目前临床上除了广谱的抗病毒药物利巴韦林,没有FDA批准的特异性针对沙粒病毒的疫苗及药物,然而利巴韦林的治疗效果有限并且有较大的副作用。因此,迫切需要通过各种研究手段来寻找新的抗沙粒病毒药物。在本课题中,我们构建了低致病性沙粒病毒淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)的反向遗传操作系统,并利用该系统拯救出带e GFP的重组LCMV病毒,随后我们利用含1018种小分子化合物的FDA成药库对重组LCMV进行了抗病毒活性筛选,发现霉酚酸、氯法齐明、贝尼地平、达拉菲尼和阿帕替尼具备较强的抗LCMV活性。其中贝尼地平的抗LCMV活性最强,在Vero细胞上IC50=0.548μM、CC50=113.8μM、SI=207.66,并且在动物水平也展现了一定的抗LCMV活性。贝尼地平是一种二氢吡啶类钙离子通道抑制剂,在临床上可以用于治疗高血压和缺血性心脏病,同时也有血管保护和肾脏保护作用。进一步的功能研究表明,贝尼地平主要靶向LCMV入侵宿主细胞的膜融合过程。将LCMV在含有贝尼地平的培养基中多次传代获得了适应性突变的病毒,对病毒基因组测序发现了位于GPC上的突变D414A,并通过反向遗传学操作系统拯救出了适应性突变病毒株LCMV GPC-D414A,其GP2上D414A突变导致突变病毒对贝尼地平的抑制作用产生抗性。同时,贝尼地平对D414A突变的LCMV GPC介导的膜融合过程也失去了抑制效果,暗示贝尼地平可能通过与GP2上的D414位点直接或间接的相互作用,影响了GPC在低p H条件下的构象改变,从而抑制了病毒的膜融合;这一位点发生突变之后,贝尼地平与GPC的相互作用受阻,GPC的膜融合可以正常进行。此外我们还发现其它二氢吡啶类钙离子通道抑制剂对LCMV也具有抑制效果,并且LCMV GPC-D414A同样对这些药物的抑制作用存在抗性,这一结果表明这些二氢吡啶类钙离子通道抑制剂的抗病毒机制与贝尼地平类似。与此同时,我们发现霉酚酸、氯法齐明、达拉菲尼和阿帕替尼对新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)也具有抑制效果,其中霉酚酸的IC50=0.101μM、CC50>100μM、SI>1000。霉酚酸是细胞内IMPDH(Inosine monophosphate dehydrogenase)抑制剂,能够降低细胞内鸟嘌呤核苷水平从而影响GTP的合成并抑制病毒的复制。我们发现通过向细胞培养基中额外添加鸟嘌呤核苷,可以缓解霉酚酸对LCMV和SARS-Co V-2两种病毒的抑制。霉酚酸、氯法齐明、贝尼地平、达拉菲尼和阿帕替尼都是FDA批准的药物,其临床安全性较为可靠,有望快速应用于沙粒病毒和SARS-Co V-2的临床治疗。HSV-1是一种在人类宿主中广泛携带的双链DNA病毒,感染人群可以终身携带病毒并且周期性的发病,在免疫力低下的情况下可能出现严重的症状。为了研究该病毒与宿主细胞的相互作用机制,本课题使用基于质谱的定量蛋白质组学的方法分析了宿主细胞HEK 293T感染HSV-1后蛋白质组的变化。我们总共鉴定到了6607个宿主蛋白,其中498个蛋白的表达受到调控。使用RNAi敲降的方法,我们发现了三个宿主蛋白IFITM3(IFN-inducible transmembrane protein 3)、CHCHD2(Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2)和TRIM27(Tripartite motif-containing protein 27)可以抑制病毒复制。通过生物信息学分析,我们鉴定到了一批参与HSV-1感染的宿主细胞信号通路,从系统的角度探究了HSV-1感染对宿主细胞的影响。
许普之[5](2020)在《肾型传染性支气管炎病毒致鸡痛风的多组学研究》文中研究说明由肾型传染性支气管炎病毒(Nephropathogenic infectious bronchitis virus,NIBV)感染引起的鸡痛风给全球养鸡业带来了巨大的经济损失。为了研究肾型传染性支气管炎病毒感染造成鸡痛风的发病机制,选用240羽海兰褐蛋鸡并随机分成攻毒组和对照组,每组设置3个重复,每个重复40羽。于试验第0天(28日龄)攻毒组按鸡胚半数致死量测定结果(105 ELD50/0.2mL)人工滴鼻攻毒,0.2mL/羽;对照组滴鼻无菌生理盐水,0.2mL/羽。观察记录鸡的临床症状,于试验第10天从每个重复中随机选取4羽鸡进行采样,然后分别使用RNA-Seq和GC-TOF/MS检测了鸡肾脏转录组学和代谢组学图谱,以及利用16S rRNA-seq分析鸡盲肠微生物组成的变化,进一步对这三种表型数据进行相关性分析。试验结果如下:(1)对照组鸡正常;攻毒组鸡肾脏肿大,色苍白,输尿管增粗且有白色粘液;肾小管上皮细胞脱落,肾小管结构丧失,以及间质扩张和大量的炎性细胞浸润。(2)攻毒组肝脏、脾、法氏囊、肾、回肠、空肠均检测到NIBV病毒,其中空肠中病毒载量最低,肾脏中最高;对照组鸡各组织则均未检测到病毒。(3)与对照组相比,肾脏代谢组学分析共检出160个差异代谢物,通路富集分析显示NIBV感染显着改变了鸡肾脏氨基酸代谢,糖代谢以及嘌呤代谢。(4)与对照组相比,肾脏转录组学分析共检出2868个差异表达基因,包括1521个上调基因和1347个下调基因。KEGG通路富集分析显示“细胞因子-细胞因子受体相互作用”是最具代表性的上调基因富集通路,“过氧化物酶体”是下调基因富集最显着的通路。其中“Toll样受体信号通路”,“NOD样受体信号通路”和“RIG-I样受体信号通路”是显着富集的参与先天免疫的模式识别受体信号通路。(5)与对照组相比,16S rRNA-seq分析结果显示NIBV感染改变了攻毒组鸡盲肠的微生物结构组成,并降低了微生物的多样性。LEfSe分析筛选出7个组间具有统计学差异的用于区分NIBV感染的潜在生物标志物(LDA Score>4),即与对照组相比,攻毒组中变形菌门(Proteobacteria,P=0.037)的相对丰度显着上升;拟杆菌科(Bacteroidaceae,P=0.037),拟杆菌属(Bacteroides,P=0.037),Bacteroides vulgatus(P=0.016),乳杆菌目(Lactobacillales,P=0.037)乳杆菌科(Lactobacillaceae,P=0.025),乳杆菌属(Lactobacillus,P=0.025)的相对丰度显着下降。结论:NIBV病毒可以在鸡的肝脏、脾、法氏囊、肾,回肠和空肠组织中进行复制。NIBV感染显着下调过氧化物酶体的作用,并显着激活先天免疫系统中的模式识别受体信号通路,从而激活免疫应答,促进肾脏的炎症及损伤,最终导致肾脏尿酸排泄障碍。嘌呤代谢发生改变并显示出尿酸合成增加的趋势。此外,NIBV感染能够引起的盲肠菌群结构的改变并降低微生物的多样性。本研究为进一步揭示NIBV感染致鸡痛风的发病分子机制提供了新的理论依据。
朱朋朋[6](2020)在《禽传染性支气管炎病毒S1蛋白与宿主细胞膜蛋白的互作研究及HSPA8在病毒感染过程中功能的初探》文中进行了进一步梳理禽传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染引起的一种急性传染病。在本研究中,我们采用IP实验结合质谱鉴定技术成功鉴定出HSPA8、Fibronectin、HSP90AB1、HSPD1和VPS18这些宿主蛋白可以与IBV-S发生互作。co-IP结果显示HSPA8、HSP90AB1和HSPD1这三种蛋白可以与M41-RBD(Receptor binding domain)发生互作。结合银染结果,我们挑选HSPA8进行进一步验证。HSPA8表达量测定表明,HSPA8在肾脏中表达水平较高。流式测定表明HSPA8可以存于CEK、Vero和293T细胞的表面。激光共聚焦实验发现HSPA8 与 M41-RBD存在共定位现象。Gst-pull-down实验表明HSPA8 与M41-RBD的互作属于直接互作。进一步研究发现HSPA8可以与不同IBV毒株(QX、H120和Beaudette株)S1蛋白发生互作,而且人源和猪源的HSPA8均可以与M41-RBD发生互作。以上的实验结果提示宿主HSPA8有可能在不同IBV毒株感染宿主细胞的过程中均起着重要的作用。病毒感染性抑制实验表明,利用HSPA8重组蛋白处理IBV或者利用HSPA8抗体封闭宿主细胞可以抑制病毒对于宿主细胞的感染,然而,IBV在HSPA8过表达细胞系中不能连续传代,结果表明HSPA8并不是IBV的功能性受体,可能只是IBV的一种黏附分子。为了进一步探究HSPA8对于IBV增殖的影响,我们进行了 HSPA8过表达和RNA干扰实验来验证。结果表明,过表达HSPA8可以抑制IBV-Beaudette株在Vero细胞中的复制。敲低HSPA8可以促进Beaudette株在Vero细胞上的复制。以上的结果表明也表明H SPA8不是IB V的功能性受体,在IBV进入细胞后,HSPA8可能发挥另外的功能。随后我们对HSP90AB1对于IBV-B eaudette复制的影响进行了探究。过表达结果显示,过表达HSP90AB1会抑制IBV-Beaudette在Vero细胞上的复制,敲低HSP90AB1 会促进IBV-Beaudette在H1299细胞上的复制。以上结果表明HSP90AB1是一个潜在的抗病毒因子。综上所述,我们的研究成功鉴定出HSPA8、HSP90AB1和HSPD1这三个蛋白是IBV S1的互作蛋白,进一步研究发现HSPA8是IBV的黏附分子。HSP90AB1在胞内是一个潜在抗病毒感染的宿主因子。该研究为今后进一步研究IBV的功能性受体,寻找合适的细胞培养体系,理解IBV在感染宿主过程中的致病机理奠定了基础。
龚旺[7](2019)在《PDCoV N蛋白转运入核的分子机制探究》文中研究表明猪δ冠状病毒(Porcine Deltacorconavirus,PDCoV)属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、δ冠状病毒属的新成员,因其导致仔猪高发病率和快速传播特征而得到全世界的广泛关注。核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)作为冠状病毒的主要结构蛋白,在病毒的复制和免疫调节中发挥重要作用。它能够与核酸结合,从而起到保护病毒基因组免受细胞外因子侵害的作用。同时N蛋白还在病毒复制和亚基因组病毒RNA转录过程中起着非常关键的作用。目前关于α冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和β冠状病毒属的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)的研究较多,但是对δ冠状病毒属的N蛋白研究相对较少。本研究主要从以下方面研究N蛋白转运入核的机制,为进一步了解δ冠状病毒属病毒N蛋白提供理论研究基础。本研究构建了PDCoV N蛋白表达质粒,在真核LLC-PK1细胞中验证其能正常表达,间接免疫荧光和共聚焦试验发现N蛋白可以完全定位于细胞质,但少部分蛋白呈现细胞质和细胞核仁同时定位的现象。通过抗N蛋白的单克隆抗体验证了病毒感染情况下N蛋白定位情况与超表达情况一致。后续,我们通过http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/网站预测、构建缺失突变体,同时通过间接免疫荧光发现C端的295-318氨基酸位点对N蛋白核仁定位至关重要。N蛋白进入细胞核仁需要核转运家族蛋白协助跨过核膜。为探寻N蛋白核转运过程中所依赖的核输入蛋白,我们扩增了猪源α家族核转运蛋白importinα1、importinα3、importinα4、importinα5、importinα6、importinα7和importinα8,并通过免疫共沉淀方法分析,发现PDCoV N蛋白不能够与importinαs发生相互作用。这些研究将揭示PDCoV N蛋白细胞核转运的分子机制,为后续阐明N蛋白功能奠定理论基础。
刘赫[8](2019)在《DDX17在汉滩病毒复制过程中作用的初步研究》文中研究表明研究背景 汉坦病毒在全世界广泛流行,其主要通过啮齿类动物传播,感染人体可引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和汉坦病毒肺综合征(Hantavirus pulmonary syndrome,HPS)两种急性传染病。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家。正汉坦病毒属的汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)是我国重症HFRS的主要病原体。HTNV为单负链RNA病毒(-ss RNA),其基因组按大小分为L、M和S三个片段,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp)、包膜糖蛋白前体(glycoprotein prescursor,GPC)以及核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)。目前临床上对于HFRS尚无特异性治疗药物,主要原因是HTNV致病机理尚不清楚。故深入研究HTNV感染、复制过程可为HFRS发病机制提供理论基础,为新型抗HTNV治疗药物提供潜在靶点。病毒-宿主相互作用是近年来HTNV感染、复制研究领域的热点问题。HTNV NP是病毒感染过程中在宿主胞质内表达量最多的病毒蛋白,已知其可结合病毒核酸起到保护病毒基因组的作用,但尚不清楚NP可与哪些宿主蛋白相互作用,其分子机制及生物学意义是什么。探索HNTV NP与宿主蛋白相互作用的过程将为阐明HTNV感染、复制机理提供理论基础。研究目的 鉴定与HTNV NP相互作用的宿主蛋白,明确筛选出的宿主蛋白DDX17在HTNV感染、复制过程中的作用。方法与结果1.筛选并鉴定与HTNV NP相互作用的宿主蛋白1.1构建含有HTNV NP融合亲和素标签(SF-NP)的真核表达质粒首先,设计针对HTNV(76-118株)S片段全长基因的PCR引物,在引物上下游分别加入Eco RⅠ和KpnⅠ酶切位点,以HTNV S片段的c DNA序列为模板进行PCR扩增,测序鉴定正确后获得含有双酶切位点的S片段的c DNA。同时,将亲和素标签基因(SF)连接进入真核表达载体p CAGGS,测序鉴定正确后获得p CAGGS-SF。然后,将含有双酶切位点的S片段的c DNA连接进入p CAGGS-SF,测序鉴定正确后获得含有NP融合亲和素标签(SF-NP)的真核表达质粒p CAGGS-SF-NP。最后,将p CAGGS-SF-NP转染HEK-293T细胞,通过Western blot验证目的基因表达情况,结果可见SF-NP表达条带大小与预期相符,表明成功构建含SF-NP的真核表达质粒。1.2亲和层析分离鉴定与NP相互作用的宿主蛋白将p CAGGS-SF-NP及对照质粒p CAGGS-SF分别转染HEK-293T细胞,转染48h后裂解细胞,将细胞裂解液在层析柱中与Strep Trap?HP琼脂珠孵育,经过缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱等步骤后获得与SF-NP相互作用的宿主蛋白,进行SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色。与p CAGGS-SF转染组相比,p CAGGS-SF-NP转染组在75-60 k Da、35-25 k Da之间可见特异性条带;通过切胶收获上述特异性条带,分别编码为1号、2号和3号,交由华大基因公司进行质谱鉴定。结果显示,在1号胶条中发现评分较高的解旋酶家族成员DDX3、DDX17和DDX5等。结合既往文献报道及本课题组前期研究结果,选取DDX17作为研究对象进行后续实验研究。2.明确DDX17分子在HTNV复制过程中的作用2.1明确HTNV感染后宿主细胞中DDX17分子表达水平及亚细胞定位的变化(1)HTNV感染后宿主细胞中DDX17分子表达的变化在MOI=1的条件下将HTNV感染人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),同时以未感染组为对照,分别在0 h、12 h、24 h、3 d和5d收获细胞样品,裂解后提取RNA并反转录制备c DNA,采用实时定量PCR(q RT-PCR)检测HTNV感染后各个时间点DDX17 m RNA的表达情况。结果显示,HTNV感染后DDX17 m RNA的表达水平逐渐升高,在24 h时达到最高,随后开始降低,在感染后72 h表达量已恢复到正常水平,提示DDX17可能在HTNV感染早期发挥作用。(2)HTNV感染后宿主细胞中DDX17分子亚细胞定位的变化HTNV感染HUVEC(MOI=1),在感染后24 h通过免疫荧光技术检测DDX17亚细胞定位的变化,结果提示未感染组DDX17主要定位于细胞核,而HTNV感染组DDX17在细胞质中的含量增加。2.2明确过表达DDX17分子对HTNV复制的影响构建并包装含有p LVX-Zs Green-DDX17的重组慢病毒,检测慢病毒滴度并验证过表达效果;之后,用慢病毒感染HUVEC,以含有空载体p LVX-Zs Green的慢病毒感染组为对照,在慢病毒感染48 h后,感染HTNV(MOI=1),分别在HTNV感染后24 h、48 h和72 h收获细胞样本,并利用q RT-PCR、Western blot和In-cell western等方法分别检测样本中HTNV核酸表达水平、蛋白表达水平及子代病毒滴度,结果显示,与对照组相比,过表达DDX17后,细胞中HTNV S片段的复制水平、NP的表达水及子代病毒滴度均显着增加,提示DDX17对于HTNV复制具有促进作用。2.3明确HTNV NP与DDX17相互作用情况根据Uniprot所示NP(C0IXS4)及DDX17(Q92841)蛋白序列及结构域,分别构建含有标签的NP/DDX17全长及截短体质粒,即Myc-NP/NP截短体,HA-DDX17/DDX17截短体,之后进行如下实验:(1)将Myc-NP与HA-DDX17/DDX17截短体共转入HEK-293T细胞,在转染48 h后收集细胞裂解液进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)实验(NP pull down DDX17/DDX17截短体),即以抗Myc标签的抗体进行免疫沉淀(immunoprecipitation,IP),以抗HA标签的抗体进行免疫印迹(immunoblotting,IB),明确NP是否与DDX17相互作用及参与相互作用的DDX17结构域,结果提示NP可以将DDX17 pull down,其中DDX17的aa314-652区域(DDX17-F3R4)是其与NP相互作用的关键区域;(2)反之,将HA-DDX17与Myc-NP/NP截短体共转入HEK-293T细胞,在转染48h后收集细胞裂解液进行co-IP实验(DDX17 pull down NP/NP截短体),即以抗HA标签的抗体进行IP,以抗Myc标签的抗体进行IB,明确DDX17是否与NP相互作用及参与相互作用的NP结构域,结果提示DDX17可以将NP pull down,其NP的aa121-429区域是其与DDX17相互作用的关键位点。既往文献报道,DDX17的aa314-652区域包含解旋酶结构域,提示DDX17可能辅助HTNV基因组解螺旋过程;而NP的aa121-429区域包含两个RNA结合结构域,即RNA结合结构域aa121-300,可特异性结合病毒RNA;非特异RNA结合结构域aa301-429,可结合任意RNA,可能在截获宿主m RNA“帽子”过程中发挥作用;而co-IP实验结果显示,DDX17可分别与上述两个结构域相互作用,提示DDX17可能在病毒基因组解旋及病毒获取宿主m RNA“帽子”过程中发挥作用。2.4初步探索HTNV感染后DDX17分子细胞亚定位改变的机制将含有Myc-NP和HA-DDX17的质粒分别转染HEK-293T细胞,以抗Myc/HA标签抗体进行IP,用抗核转运分子KPNA1、2、4、5、6的抗体进行IB,结果显示,NP、DDX17均可以与KPNA1、2结合,提示NP可能通过竞争性结合KPNA1、2,使DDX17分子滞留于细胞质,以利于自身的复制。结论1.通过亲和层析联合质谱鉴定筛选出包括DDX17在内的多个与NP相互作用的宿主蛋白分子。2.DDX17可以促进HTNV的复制,并与NP共定位于细胞质。3.DDX17的解旋酶结构域与NP的RNA结合结构域和非特异RNA结合结构域作用,提示DDX17可能通过协助病毒基因组解旋、获取宿主m RNA“帽子”结构等过程促进病毒的复制。4.DDX17与NP可能通过竞争性结合核转运分子KPNA1、2致使DDX17滞留于细胞质,从而促进HTNV的复制。
曾松林[9](2016)在《猪流行性腹泻病毒AJ1102株感染Vero细胞的蛋白质组学及传代致弱研究》文中研究指明猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以新生仔猪水样腹泻、呕吐、脱水和高死亡率等为主要特征的传染病。该病最早于1970s年在英国和比利时报道,在随后的30年间,PED主要在亚洲和欧洲的多个国家流行,给养猪业带来极大的经济损失。在国内,由于TGEV、PEDV二联灭活疫苗和二联活疫苗的广泛使用,为有效控制PED的流行起到了十分重要的作用。然而自2010年年底以来,由于PEDV变异毒株的出现引起了仔猪腹泻在我国的暴发并呈现新的流行特征:发病率高、致死率高、流行广,即使疫苗免疫猪场也不能幸免,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。2013年,PEDV变异毒株先后登陆美国、加拿大等以前从未发生过PED的美洲国家,并导致大量仔猪发病或死亡,引起了全球养猪业的恐慌。深入研究PEDV变异毒株的致病与免疫机理,研制更加安全有效的新型疫苗,已成为当前PED研究的热点。因此,本研究通过蛋白质组学方法对分离的PEDV变异毒株AJ1102株感染Vero细胞后蛋白的差异表达情况进行了分析,并且将该毒株在Vero细胞上连续传代后对不同代次病毒的毒力和免疫原性进行了评价。具体研究内容如下:1.PEDV AJ1102株感染Vero细胞的蛋白质组学研究为了了解PEDV AJ1102株感染Vero细胞后细胞蛋白表达的差异,通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)技术,结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS),对PEDV感染Vero细胞的蛋白表达情况进行了鉴定和分析。共有49个蛋白表达有显着差异,其中8个蛋白表达上调、41个蛋白表达下调。利用生物信息学软件对差异表达蛋白的亚细胞定位和生物学功能进行了聚类分析,并绘制了蛋白互作的网络图,发现这些差异表达的蛋白与细胞凋亡、信号转导及压力应激反应等多种生物进程通路有关。推测PEDV可能通过调控细胞凋亡和ERK信号通路来促进病毒的复制。为了检验蛋白质组学鉴定结果的可信度,通过Western blot方法进一步对HSDL2,14-3-3 gamma和HSP27的表达进行了检测,结果与蛋白质组学鉴定的结果基本上一致。研究结果为更好的了解PEDV感染宿主后的致病机制提供了数据。2.PEDV AJ1102株的传代与不同代次的全基因组序列分析将PEDV AJ1102株在Vero细胞上连续传至第120代,并对P11、P40、P70、P100和P120进行了全基因组测序分析,这5个代次病毒的全基因组序列的长度分别为28042 bp、28042 bp、28054 bp、28051 bp和28051 bp,序列比对发现在传代过程中病毒非编码区、非结构蛋白基因及S基因的突变率要明显高于其它基因的突变,并且突变主要发生在P1至P11的传代过程中;值得注意的是在传代过程中出现了两处特征性的突变,其中一处是在P70代出现的:在S基因的3087-3088位碱基之间插入了 12个碱基,导致其编码的S蛋白在1269-1270氨基酸之间有4个氨基酸(AIVD)的插入;在P100代中出现了另一特征性的变异:M基因669-671位碱基缺失(TTT),导致M蛋白223位氨基酸由组氨酸突变为谷氨酰胺和224位氨基酸(亮氨酸)的缺失,并且这两处特征性的变异一直到P120均稳定存在。3.PEDV AJ1102株传代后不同代次的致病性分析将PEDVAJ1102株P11,P40,P70,P100和P120 5个代次的病毒进行3~5日龄和24~26日龄仔猪的致病性分析,动物试验结果表明:P11和P40引起80%以上的的3~5日龄和24~26日龄仔猪发病,且P11攻毒组3~5日龄仔猪1头发病死亡,P70,P100和P120这3个代次的攻毒组不引起3~5日龄和24~26日龄仔猪发病,说明病毒在P70以后毒力已经明显减弱。4.PEDV AJ1102株不同代次的免疫原性分析PEDVAJ1102株P40、P70、P100和P120病毒经肌肉免疫仔猪后发现:P70免疫组产生中和抗体的时间最早,到免疫后21日,所有免疫猪的中和抗体均不低于1:19.0(1:19.0~1:27.0);而P100和P120免疫组仔猪在免疫后21日抗体水平(均不高于(1:11.3)明显低于P70免疫组,说明病毒传至P100后诱导中和抗体的能力有所下降。虽然P100和P120诱导的中和抗体要低于P70,但也能保护免疫仔猪抵抗PEDV强毒的攻击,这可能是由于病毒免疫后诱导的细胞免疫在抵抗强毒攻击中起到了重要的作用。5.PEDV AJ1102株S基因的插入对毒力的影响由于PEDV AJ1102株传至第70代时,其毒力显着下降,而P70与P11和P40相比基因组的一个特征性变异是在S基因1269-1270之间有4个氨基酸(AIVD)的插入,且这4个氨基酸的插入在随后的传代中一直稳定存在,推测这4个氨基酸的插入可能是引起病毒毒力下降的原因。为了证实这一点,首先通过对各代次病毒S基因的扩增测序发现4个氨基酸的插入最早出现在P55,于是通过克隆获得了无4个氨基酸插入的克隆毒P55和有4个氨基酸插入的克隆毒P55-In,经动物实验证实,与P11相比P55的毒力有所下降染,但3-5日龄仔猪仍有较强的致病性,而P55-In对3-5日龄仔猪不致病,由此说明S基因4个氨基酸的插入是导致病毒毒力减弱的一个重要原因。6.PEDV AJ1102株M基因的缺失对免疫原性的影响为了确定PEDV AJ1102株M基因中669-671位碱基的缺失是否影响病毒的免疫原性,首先通过RT-PCR扩增和测序确定了 3个碱基的缺失最早是在第82代出现的,于是通过克隆分别获得了碱基未缺失的克隆毒P82和3个碱基缺失的克隆毒P82-Del,并将这两个克隆毒分别传到100代后对其免疫原性进行了比较,结果在免疫后7d,P70、P82、P100免疫组个别仔猪产生了低水平的中和抗体,到免疫后21d所有免疫猪的抗体水平均不低于1:19.0;而P82-Del和P100-Del免疫组仔猪产生中和抗体时间相对较晚,免疫后14d才有部分仔猪产生了低水平的中和抗体,到免疫后21d也未见明显上升。但所有免疫组均能保护仔猪抵抗PEDV AJ1102株强毒的攻击,说明M基因中3个碱基的缺失对病毒的免疫原性有一定的影响,同时也说明病毒诱导的其它免疫反应在保护免疫猪中也起着非常重要的作用。
张寅杰[10](2013)在《胡宁病毒核蛋白结构与功能的研究》文中研究表明胡宁病毒被认为是致命的阿根廷出血热的病原体。该种疾病严重威胁公众健康安全,并导致超过五百万人陷于疾病威胁之中。由于其传播途径为依靠飞沫传播,故被认为是一种潜在的生化武器而更加受到各方重视。胡宁病毒是一种负义单链RNA病毒,隶属于沙粒病毒科沙粒病毒属。其基因组由两段组成,合成四种蛋白质。在这四种蛋白质中,核蛋白在病毒RNA合成以及针对宿主的免疫抑制等方面均发挥重要作用。但人们对其具体的分子作用机制知之甚少。迄今为止,已有多种负链RNA病毒的核蛋白结构得到解析,但就沙粒病毒科而言,却只有拉沙热病毒的核蛋白已经解析结构。在本论文中,我们解析了沙粒病毒科另一种重要病毒——胡宁病毒的核蛋白C端结构域的结构,其分辨率达到2.2A。这一结构与拉沙热病毒核蛋白的C端结构域有许多相似之处,却也包含不同之处。该研究拓展了我们对负义单链RNA病毒核蛋白的认识。2003年,严重急性呼吸系统综合征的爆发对世界各国均造成了巨大危害。其病原体被认定为是冠状病毒的一种:SARS冠状病毒。该病毒基因组可产生十六种非结构蛋白质,用于病毒的复制与转录工作。其中,非结构蛋白8被认为是该病毒的引物酶。它为该病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(非结构蛋白12)生产并提供引物。它同时也是该病毒的第二种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。SARS冠状病毒的非结构蛋白7与非结构蛋白8可以形成一个十六聚体的超级复合物。其结构不同于普通RNA依赖的RNA聚合酶的结构,暗示其独特的工作机制。在本论文中,我们解析了非结构蛋白7与非结构蛋白8C端结构域的复合物结构,并依据体内实验证据和结构信息,提出了在非结构蛋白8C端结构域参与调节下的冠状病毒引物酶超级复合物工作机制的模型,该模型为抗冠状病毒药物的研制提供了依据,进而为控制并遏制致命的SARS冠状病毒及其类似物的传播提供帮助。
二、SARS冠状病毒核蛋白的质谱鉴定(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SARS冠状病毒核蛋白的质谱鉴定(论文提纲范文)
(1)IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一部分 文献综述 |
综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
1 病原学 |
1.1 发现和分类 |
1.2 IBV的形态 |
1.3 IBV的理化特征 |
1.4 IBV培养特性 |
1.5 IBV致病性 |
1.6 IBV生活周期 |
2 IBV分子生物学特性 |
2.1 IBV基因组 |
2.2 IBV主要编码蛋白及功能 |
2.3 IBV毒株分型 |
3 IBV流行病学 |
3.1 自然宿主 |
3.2 实验室宿主 |
3.3 传播方式 |
3.4 IBV流行现状 |
4 IBV变异机制 |
4.1 点突变 |
4.2 基因缺失或插入 |
4.3 同源重组 |
5 诊断技术 |
5.1 分离鉴定 |
5.2 血清学诊断 |
5.3 分子生物学检测 |
综述二 IBV疫苗研究进展 |
1 疫苗接种 |
1.1 疫苗 |
1.2 接种时间 |
1.3 疫苗接种程序 |
2 疫苗的应用 |
2.1 喷雾疫苗接种 |
2.2 凝胶疫苗接种 |
3 疫苗接种后的保护评价 |
3.1 病毒分离 |
3.2 纤毛停滞 |
3.3 qRT-PCR |
3.4 血清中和抗体水平评价 |
综述三 IBV S蛋白研究进展及与宿主细胞互作研究进展 |
1 IBV S蛋白研究进展 |
1.1 结构特点 |
1.2 序列多样性 |
1.3 IBV S蛋白功能 |
1.4 影响病毒吸附的宿主因素 |
2 IBV与宿主互作的研究进展 |
2.1 病毒感染对细胞凋亡的影响 |
2.2 病毒感染过程中自噬的激活 |
2.3 冠状病毒感染与天然免疫反应 |
第二部分 研究内容 |
第一章 IBV S蛋白关键抗原表位的鉴定 |
1 材料方法 |
1.1 病毒、多肽和血清样品 |
1.2 主要试剂和仪器 |
1.3 主要试剂配方 |
1.4 多肽库合成 |
1.5 IBV毒株EID_(50)测定 |
1.6 IBV S蛋白序列保守性和抗原性比较分析 |
1.7 pELISA实验步骤 |
1.8 IDEXX检测试剂盒实验步骤 |
1.9 IBV S2蛋序列比较分析 |
2 实验结果 |
2.1 IBV S蛋白抗原性和保守性分析 |
2.2 多肽与IBV阳性血清的交叉反应 |
2.3 多肽抗原性关键氨基酸的确定 |
2.4 16R变异株的流行情况 |
3 讨论 |
第二章 检测IBV抗体多肽酶联免疫吸附试验(pELISA)方法建立及应用 |
1 材料和方法 |
1.1 生物材料 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要仪器 |
1.4 pELISA方法步骤 |
1.5 pELISA方法条件的优化 |
1.6 pELISA方法性能的评价 |
2 结果 |
2.1 Pep6与不同基因型毒株的血清具有很好的反应性 |
2.2 pELISA抗体检测方法条件的优化 |
2.3 pELISA临界值、重复性和特异性测定 |
2.4 pELISA性能的评价 |
3 讨论 |
第三章 pELISA评价疫苗免疫效力的潜在作用 |
1 材料与方法 |
1.1 生物材料 |
1.2 主要试剂 |
1.3 ELISA方法实验步骤 |
1.4 多肽血清的制备 |
1.5 血清中和滴度的测定 |
2 结果 |
2.1 多肽血清中和效果 |
2.2 pELISA与中和实验比较测定血清抗体滴度 |
2.3 免疫血清pELISA滴度与中和滴度的相关性 |
3 讨论 |
第四章 IBV S1蛋白互作蛋白的宿主蛋白 |
1 材料与方法 |
1.1 生物材料 |
1.2 生物试剂 |
1.3 引物设计 |
1.4 病毒总RNA提取 |
1.5 真核表达载体的构建 |
1.6 CEK细胞的制备 |
1.7 质粒转染 |
1.8 间接免疫荧光(IFA) |
1.9 Western-blot |
1.10 S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
1.11 CEK细胞膜蛋白提取 |
1.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
1.13 SDS-PAGE(银染) |
1.14 质谱 |
2 结果 |
2.1 sp-S1-IgGFc片段PCR扩增结果 |
2.2 重组质粒酶切鉴定 |
2.3 重组质粒转染IFA鉴定FJ14S1-IgGFc融合蛋白表达 |
2.4 激光共聚焦鉴定重组S1-IgGFc融合蛋白表达 |
2.5 Western blot鉴定重组融合蛋白S1-IgGFc的表达 |
2.6 重组S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
2.7 免疫共沉淀(Co-IP) |
2.8 质谱鉴定 |
3 讨论 |
第五章 GRP78蛋白协助IBV感染宿主细胞 |
1 材料方法 |
1.1 生物材料 |
1.2 生物试剂 |
1.3 主要试剂溶液配制 |
1.4 主要仪器 |
1.5 引物设计 |
1.6 真核质粒构建 |
1.7 CEKC的制备 |
1.8 质粒转染 |
1.9 共聚焦鉴定真核蛋白表达 |
1.10 免疫沉淀(IP) |
1.11 抗体封闭实验 |
1.12 siRNA干扰 |
1.13 GRP78转染293T重建实验 |
1.14 统计学分析 |
2 结果 |
2.1 酶切鉴定构建的真核表达载体 |
2.2 共聚焦鉴定蛋白表达 |
2.3 GRP78蛋白与IBV S1蛋白的互作 |
2.4 多克隆抗体封闭CEK细胞膜表面GRP78蛋白抑制IBV复制 |
2.5 siRNA干扰GRP78的表达能抑制IBV的复制 |
2.6 非易感细胞感染实验 |
3 讨论 |
全文结论 |
参考文献 |
攻读学位期间取得的研究成果 |
致谢 |
(2)猪δ冠状病毒的分离鉴定及辅助蛋白在病毒复制及致病中的作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略语表(Abbreviation) |
文献综述 |
1.1 PDCoV(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)简介 |
1.1.1 PDCoV的起源与进化 |
1.1.2 PDCoV的流行情况及致病性 |
1.1.3 PDCoV的基因组特征 |
1.1.4 冠状病毒生命周期 |
1.2 冠状病毒反向遗传操作系统的建立及应用 |
1.2.1 冠状病毒反向遗传系统的建立 |
1.2.2 冠状病毒反向遗传系统的应用 |
1.3 冠状病毒编码蛋白功能的研究 |
1.3.1 结构蛋白功能的研究 |
1.3.2 非结构蛋白功能的研究 |
第2章 研究目的与意义 |
第3章 材料与方法 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 病料及实验动物 |
3.1.2 动物免疫相关材料 |
3.1.3 细胞、毒株与菌株 |
3.1.4 工具酶及主要试剂 |
3.1.5 抗体及转染相关试剂 |
3.1.6 细菌及细胞培养基及相关试剂配制 |
3.1.7 主要缓冲液及相关试剂配制 |
3.1.8 主要实验仪器及设备 |
3.1.9 分子生物学分析软件 |
3.2 试验方法 |
3.2.1 腹泻病料采集与处理 |
3.2.2 总RNA提取(Trizol) |
3.2.3 RT-PCR |
3.2.4 PDCoV病毒的分离 |
3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测及回收与纯化 |
3.2.6 外源DNA片段与载体的连接反应 |
3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
3.2.8 连接产物的转化 |
3.2.9 质粒的制备与鉴定 |
3.2.10 PDCoV全基因组序列的测定与分析 |
3.2.11 PDCoVN、NS6、NS7 蛋白的原核表达 |
3.2.12 上清蛋白纯化 |
3.2.13 包涵体蛋白纯化 |
3.2.14 单克隆抗体的制备 |
3.2.15 免疫共沉淀及蛋白质免疫印迹实验 |
3.2.16 间接免疫荧光(IFA) |
3.2.17 病毒噬斑试验 |
3.2.18 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定 |
3.2.19 病毒粒子的超离纯化与电镜观察 |
3.2.20 病毒中和试验 |
3.2.21 体外连接克隆PDCoV及其重组病毒全长cDNA |
3.2.22 PDCoV及其重组病毒的拯救 |
3.2.23 PDCoV仔猪致病性实验 |
3.2.24 荧光定量RT-PCR |
3.2.25 病理切片与免疫组化切片制备 |
3.2.26 银染 |
3.2.27 质谱鉴定与分析 |
3.2.28 统计学方法 |
第4章 结果与分析 |
4.1 PDCoV CHN-HG-2017 株的分离鉴定,全基因组序列分析及其致病性研究 |
4.1.1 PDCoV CHN-HG-2017 株的分离鉴定 |
4.1.2 PDCoV CHN-HG-2017 株的病毒全基因序列测定分析 |
4.1.3 PDCoV CHN-HG-2017 株对仔猪致病性试验 |
4.2 PDCoV CHN-HG-2017 株反向遗传操作系统的建立 |
4.2.1 克隆PDCoV CHN-HG-2017 株全长cDNA |
4.2.2 体外转录及病毒拯救 |
4.2.3 拯救病毒的鉴定 |
4.3 利用反向遗传操作技术研究PDCoV辅助蛋白在病毒复制及致病性中的作用 |
4.3.1 重组病毒的拯救 |
4.3.2 重组病毒的鉴定 |
4.3.3 重组病毒体外生物学特性分析 |
4.3.4 重组病毒体内致病性分析 |
4.4 研究PDCoV辅助蛋白NS6 影响病毒复制及致病性的作用机制 |
4.4.1 鉴定辅助蛋白NS6 相互作用的病毒蛋白 |
4.4.2 携带Flag标签重组病毒的拯救及鉴定 |
4.4.3 辅助蛋白NS6 相互作用的宿主因子的筛选及鉴定 |
第5章 讨论与结论 |
5.1 讨论 |
5.1.1 PDCoV CHN-HG-2017 株的分离鉴定,全基因组序列分析及其致病性研究 |
5.1.2 PDCoV CHN-HG-2017 株反向遗传操作系统的建立 |
5.1.3 PDCoV辅助蛋白在病毒复制及致病性中的作用 |
5.1.4 研究PDCoV辅助蛋白NS6 影响病毒复制及致病性的作用机制 |
5.2 结论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
本研究由以下项目资助 |
(3)猪肠道α冠状病毒辅助蛋白NS7a调控Ⅰ型IFN信号通路的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 绪论 |
1.1 猪急性腹泻综合征及病原体概述 |
1.1.1 猪肠道冠状病毒简介 |
1.1.2 分类学,基因组结构和形态 |
1.1.3 SADS-CoV的流行病学史 |
1.1.4 SADS-CoV 的遗传进化分析 |
1.1.5 猪胃肠道冠状病毒与天然免疫 |
1.1.6 SADS-CoV的致病机理 |
1.1.7 SADS-CoV的临床症状及检测 |
1.2 Ⅰ型干扰素信号通路 |
1.2.1 干扰素概述 |
1.2.2 Ⅰ型干扰素信号传导过程中常见的修饰 |
1.2.3 病毒逃避策略:抑制干扰素信号通路的常见机制 |
第二章 材料和方法 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 主要试验试剂及耗材 |
2.1.2 试剂配制 |
2.1.3 质粒、细胞和抗体 |
2.1.4 主要仪器设备 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 HEK293T细胞的复苏和培养 |
2.2.2 细胞传代 |
2.2.3 细胞冻存 |
2.2.4 细胞转染 |
2.2.5 双荧光报告试验 |
2.2.6 引物设计 |
2.2.7 总RNA的提取 |
2.2.8 cDNA制备 |
2.2.9 PCR扩增基因片段 |
2.2.10 胶回收 |
2.2.11 双酶切反应 |
2.2.12 载体与片段连接 |
2.2.13 转化 |
2.2.14 菌落PCR鉴定 |
2.2.15 去内毒素小提质粒 |
2.2.16 反转录(荧光定量用) |
2.2.17 荧光定量(SYBR Green法) |
2.2.18 Western blot |
2.2.19 免疫共沉淀试验 |
2.2.20 流式细胞术 |
第三章 结果 |
3.1 NS7a显着抑制Ⅰ型IFN信号通路 |
3.2 NS7a真核表达质粒的表达鉴定 |
3.3 构建JAK-STAT信号通路上游相关信号因子表达载体 |
3.4 NS7a抑制MAVS、IKBKE、IRF3 的启动子活性 |
3.5 NS7a抑制相关信号因子m RNA水平 |
3.6 NS7a抑制信号通路相关蛋白表达水平 |
3.7 NS7a与 JAK-STAT信号通路上游相关信号因子无蛋白水平相互作用 |
3.8 质谱分析 |
3.9 NS7a对 HEK293T细胞形态及生长状态的负面影响 |
3.10 Western blot检测NS7a诱导的HEK293T细胞凋亡 |
3.11 流式细胞术检测NS7a诱导的HEK293T细胞凋亡 |
3.12 Z-VAD无法有效抑制NS7a引起的HEK293T凋亡 |
3.13 NS7a与 caspase-8 相互作用 |
第四章 讨论 |
全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(4)抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 引言 |
1.1 沙粒病毒的发现及分类 |
1.2 沙粒病毒的结构和编码的蛋白 |
1.2.1 沙粒病毒颗粒的结构 |
1.2.2 沙粒病毒基因组的结构 |
1.2.3 沙粒病毒的核蛋白NP |
1.2.4 沙粒病毒RNA依赖的RNA聚合酶L |
1.2.5 沙粒病毒的基质蛋白Z |
1.2.6 沙粒病毒的膜蛋白GPC |
1.3 沙粒病毒的生命周期 |
1.4 沙粒病毒流行病学及临床特征 |
1.5 沙粒病毒的动物模型 |
1.5.1 旧世界沙粒病毒的动物模型 |
1.5.2 新世界沙粒病毒的动物模型 |
1.6 沙粒病毒的药物和抗体研究进展 |
1.6.1 抑制沙粒病毒复制的药物研究进展 |
1.6.2 沙粒病毒进入抑制剂研究进展 |
1.6.3 多肽类药物的研究进展 |
1.6.4 沙粒病毒疫苗的研究进展 |
1.7 Ⅰ型单纯疱疹病毒简介 |
第二章 FDA批准的小分子药物库的抗病毒药物筛选 |
2.1 实验材料,实验仪器与实验方法 |
2.1.1 实验材料 |
2.1.2 实验仪器 |
2.1.3 质粒的构建 |
2.1.4 LCMV及其重组病毒的拯救与扩增 |
2.1.5 VSV假病毒的包装 |
2.1.6 SARS-Co V-2 病毒的获得 |
2.1.7 免疫噬斑印记法检测LCMV的滴度 |
2.1.8 LCMV NP蛋白小鼠和家兔抗血清的制备 |
2.1.9 MTT法检测细胞活力 |
2.1.10 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR) |
2.1.11 病毒与宿主细胞的结合与内化 |
2.1.12 细胞膜融合模型 |
2.1.13 迷你基因组复制系统 |
2.1.14 LCMV出芽能力检测 |
2.1.15 Western blot印记法检测目的蛋白 |
2.1.16 动物实验 |
2.1.17 筛选药物适应性突变病毒 |
2.1.18 免疫荧光染色法(Immunofluorescence assay,IFA) |
2.2 实验结果 |
2.2.1 利用重组e GFP的 LCMV筛选FDA批准的小分子药物库 |
2.2.2 筛选得到的抗病毒药物的IC50、CC50和SI值 |
2.2.3 五种抗病毒药物的作用阶段 |
2.2.4 贝尼地平的抗病毒机制 |
2.2.5 具有耐药性的突变位点的发现 |
2.2.6 贝尼地平能够抑制LCMV在小鼠体内的复制 |
2.2.7 贝尼地平在沙粒病毒中具有广谱的抗病毒效果 |
2.2.8 其它二氢吡啶类药物抑制LCMV的作用与贝尼地平相似 |
2.2.9 霉酚酸、阿帕替尼、达拉菲尼和氯法齐明对新冠病毒的抑制作用 |
2.2.10 额外添加鸟嘌呤核苷中和霉酚酸的抗病毒作用 |
2.3 讨论 |
2.4 总结与展望 |
第三章 HSV-1 感染的HEK293T细胞定量蛋白质组学分析 |
3.1 实验材料,实验仪器与实验方法 |
3.1.1 实验材料 |
3.1.2 实验仪器 |
3.1.3 质谱样品的SILAC标记 |
3.1.4 细胞核蛋白与胞浆蛋白的提取 |
3.1.5 蛋白的提取和消化 |
3.1.6 液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)分析 |
3.1.7 蛋白的鉴定与定量 |
3.1.8 GO聚类分析 |
3.1.9 siRNA转染细胞 |
3.1.10 病毒基因组DNA和宿主细胞基因表达的检测 |
3.2 实验结果 |
3.2.1 HSV-1 感染HEK293T细胞的定量蛋白质组学分析的样品准备 |
3.2.2 质谱获得的定量蛋白质组数据的处理 |
3.2.3 WB和 qRT-PCR法验证MS分析得到的差异蛋白 |
3.2.4 通过GO分析鉴定被HSV-1感染影响的生命过程 |
3.2.5 IFITM3、CHCHD2 和TRIM27 对病毒复制的作用 |
3.3 讨论 |
3.4 总结与展望 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
(5)肾型传染性支气管炎病毒致鸡痛风的多组学研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
前言 |
第一章 文献综述 |
1 鸡痛风发病机制研究进展 |
1.1 鸡痛风简介 |
1.2 鸡痛风的致病因素 |
1.2.1 鸡痛风的非传染性致病因素 |
1.2.2 鸡痛风的传染性致病因素 |
1.3 鸡痛风发病机制研究 |
1.4 鸡痛风的病理学变化及诊断 |
1.5 鸡痛风的预防及治疗 |
2 传染性支气管炎病毒研究进展 |
2.1 IBV病原学 |
2.2 IBV的流行病学调查 |
2.3 IBV的病理学研究 |
2.4 IBV的致病性研究 |
2.5 IBV的检测及诊断 |
3 多组学技术及其应用 |
3.1 转录组学及其应用 |
3.2 代谢组学及其应用 |
3.3 肠道微生物组学及其应用 |
4 本研究目的与意义 |
第二章 试验研究 |
1 材料与方法 |
1.1 试验材料 |
1.1.1 实验动物与分组 |
1.1.2 主要仪器 |
1.1.3 主要试剂 |
1.1.4 试剂、培养基的制备 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 样品采集 |
1.2.2 组织病理学检查及血清尿酸检测 |
1.2.3 各组织中病毒载量的测定 |
1.2.4 肾脏代谢组检测 |
1.2.5 肾脏转录组测序 |
1.2.6 16S rRNA测序分析 |
2 试验结果 |
2.1 临床病理变化及血清尿酸检测 |
2.2 各组织中病毒载量测定 |
2.3 NIBV感染状态下肾脏代谢组学特征 |
2.3.1 肾脏代谢组主成分分析(PCA) |
2.3.2 肾脏代谢组正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA) |
2.3.3 肾脏差异代谢物分析 |
2.3.4 肾脏差异代谢物的代谢通路分析 |
2.4 NIBV感染对肾脏基因转录水平的影响 |
2.4.1 测序数据质量整体分析 |
2.4.2 转录组测序重复相关性评估 |
2.4.3 差异表达基因分析 |
2.4.4 GO功能富集分析 |
2.4.5 差异基因KEGG富集分析 |
2.5 NIBV感染状态下鸡盲肠菌群的影响 |
2.5.1 16S rRNA测序数据处理与质控统计 |
2.5.2 OTU分析和物种注释 |
2.5.3 Alpha多样性分析 |
2.5.4 Beta多样性分析 |
2.6 相关性分析 |
3 讨论 |
3.1 NIBV感染对模式识别受体信号通路的影响 |
3.2 NIBV感染对过氧化物酶体的影响 |
3.3 NIBV感染对机体代谢水平的影响 |
3.4 差异表达基因与差异代谢物的相关性分析 |
3.5 NIBV感染对盲肠菌群的影响 |
全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间发表的论文 |
(6)禽传染性支气管炎病毒S1蛋白与宿主细胞膜蛋白的互作研究及HSPA8在病毒感染过程中功能的初探(论文提纲范文)
本研究课题来源于 |
论文创新点 |
致谢 |
摘要 |
Abstract |
技术路线 |
缩略词 |
第一部分 文献综述 |
第一章 IBV病原生物学研究进展 |
1.1 IBV的分类和组成 |
1.2 IBV基因组结构 |
1.3 IBV的复制过程 |
1.4 IBV的培养特性 |
1.5 IBV结构蛋白研究进展 |
1.5.1 S蛋白 |
1.5.2 M蛋白 |
1.5.3 N蛋白 |
1.5.4 E蛋白 |
1.6 IBV受体研究进展 |
第二章 HSPA8分子研究进展 |
2.1 HSPA8分子结构 |
2.2 HSPA8蛋白的功能 |
第二部分 研究内容 |
第一章 IBV S1蛋白互作宿主细胞膜蛋白的质谱鉴定 |
1.1 材料 |
1.1.1 细胞、毒株和抗体 |
1.1.2 主要仪器与设备 |
1.1.3 主要试剂 |
1.2 方法 |
1.2.1 M41细胞适应毒的获得 |
1.2.1.1 病毒扩繁 |
1.2.1.2 病毒RNA抽提 |
1.2.1.3 反转录及核酸电泳检测 |
1.2.1.4 M41在CEK细胞上连续传代 |
1.2.1.5 毒价测定 |
1.2.2 定点收样实验 |
1.2.3 IBV感染CEK后的内源性IP实验 |
1.2.3.1 细胞膜蛋白的抽提 |
1.2.3.2 免疫沉淀 |
1.2.4 SDS-PAGE及银染 |
1.2.5 质谱鉴定 |
1.3 结果 |
1.3.1 M41 CEK细胞适应株的获得 |
1.3.2 M41-CEK细胞适应株病毒复制最佳时间点的测定 |
1.3.3 膜蛋白组分抽提检测 |
1.3.4 IP实验鉴定与M41 S1发生互作的宿主蛋白 |
1.3.5 互作蛋白的质谱鉴定 |
1.4 讨论 |
第二章 HSPA8与IBV病毒蛋白互作研究 |
2.1 材料 |
2.1.1 细胞和毒株 |
2.1.2 主要仪器与设备 |
2.1.3 主要试剂 |
2.2 方法 |
2.2.1 真核表达载体的构建 |
2.2.1.1 病毒及组织RNA的抽提 |
2.2.1.2 病毒及鸡基因组反转录 |
2.2.1.3 IBV M41株、H120株、QX株、Beaudette株cDNA的PCR扩增 |
2.2.1.4 cDNA的PCR扩增 |
2.2.1.5 质粒空载的双酶切线性化 |
2.2.1.6 PCR产物及空载酶切产物的回收纯化 |
2.2.1.7 感受态制备 |
2.2.1.8 PCR扩增片段的克隆及转化 |
2.2.1.9 重组质粒的鉴定 |
2.2.1.10 质粒抽提 |
2.2.2 质谱鉴定蛋白的互作验证 |
2.2.2.1 293T细胞的培养 |
2.2.2.2 质粒的转染 |
2.2.2.3 Co-IP实验 |
2.2.2.4 激光共聚焦 |
2.2.2.5 M41-RBD和HSPA8蛋白直接相互作用验证 |
2.2.3 M41感染CEK细胞后的内源性IP实验 |
2.2.4 不同种属之间HSPA8蛋白与M41-S1蛋白的互作验证 |
2.2.4.1 猪源和人源HSPA8蛋白真核表载体的构建 |
2.2.4.2 co-IP验证不同种属HSPA8蛋白与M41-S1蛋白的互作 |
2.2.5 鸡组织中HSPA8表达水平检测 |
2.2.5.1 qPCR引物设计 |
2.2.5.2 组织RNA抽提及反转录 |
2.2.5.3 Q-PCR引物验证 |
2.2.5.4 组织中HSPA8基因qPCR检测 |
2.2.6 间接流式实验 |
2.3 结果 |
2.3.1 筛选蛋白与M41-RBD互作分析 |
2.3.1.1 构建Fibronectin、HSPA8、HSP90AB1和HSPD1真核表达载体 |
2.3.1.2 构建M41-S1-RBD蛋白截短体真核表达载体 |
2.3.1.3 Co-IP验证Fibronectin、HSPA8、HSP90AB1、HSPD1蛋白与M41-RBD的相互作用 |
2.3.2 IP实验确定HSPA8与M41-S互作 |
2.3.3 M41-RBD与HSPA8细胞内共定位 |
2.3.4 HSPA8与M41-RBD存在直接互作 |
2.3.4.1 构建pGEX-4T-1-M41-RBD/HSPA8和pET-28a-HSPA8原核表达载体 |
2.3.4.2 M41-RBD和HSPA8重组蛋白的诱导表达与纯化 |
2.3.4.3 Gst-pull-down |
2.3.5 不同IBV毒株S1蛋白可以与HSPA8蛋白互作 |
2.3.5.1 不同IBV毒株S1蛋白截短体真核表达载体的构建及表达验证 |
2.3.5.2 不同IBV毒株S1蛋白与HSPA8蛋白互作验证 |
2.3.6 人源和猪源的HSPA8蛋白可以与M41-RBD发生互作 |
2.3.7 HSPA8在鸡组织中的表达分析 |
2.3.7.1 qPCR引物设计及验证 |
2.3.7.2 qPCR检测组织中HSPA8基因的表达 |
2.3.8 流式鉴定HSPA8在细胞表面表达 |
2.4 讨论 |
第三章 HSPA8对于IBV入侵和增殖的影响 |
3.1 材料 |
3.1.1 细胞和毒株 |
3.1.2 主要仪器与设备 |
3.1.3 主要试剂 |
3.2 方法 |
3.2.1 HSPA8重组蛋白和HSPA8抗体抑制M41感染CEK细胞实验 |
3.2.1.1 HSPA8重组蛋白抑制M41感染CEK细胞实验 |
3.2.1.2 HSPA8抗体抑制M41感染CEK细胞实验 |
3.2.2 IBV在HSPA8过表达Vero细胞系传代实验 |
3.2.2.1 PCDH-puro-HSPA8-flag载体的构建 |
3.2.2.2 慢病毒的包装 |
3.2.2.3 HSPA8蛋白过表达细胞系构建 |
3.2.2.4 M41在HSPA8过表达细胞系上传代实验 |
3.2.3 HSPA8重组蛋白和HSPA8抗体抑制Beaudette株感染细胞实验 |
3.2.3.1 肝素酶处理Vero细胞后Beaudette株感染实验 |
3.2.3.2 HSPA8重组蛋白抑制Beaudette株感染Vero细胞实验 |
3.2.3.3 HSPA8抗体抑制Beaudette株感染Vero细胞实验 |
3.2.4 过表达HSPA8对于BD株复制的影响 |
3.2.5 敲低HSPA8对于BD株在Vero细胞上复制的影响 |
3.2.5.1 HSPA8基因siRNA的筛选 |
3.2.5.2 敲低HSPA8对于Beaudette株在Vero细胞上复制的影响 |
3.2.6 过表达HSP90AB1对于Beaudette株复制的影响 |
3.2.7 敲低HSP90AB1对于BD株在H1299细胞上复制的影响 |
3.2.7.1 HSP90AB1基因sh序列的预测及sh载体的构建 |
3.2.7.2 慢病毒的包装 |
3.2.7.3 111299细胞HSP90ABI干扰细胞系的构建 |
3.2.7.4 细胞活力测定 |
3.2.7.5 敲低HSP90AB1对于BD株在H1299细胞上复制的影响 |
3.3 结果 |
3.3.1 HSPA8重组蛋白和HSPA8抗体抑制M41感染CEK细胞 |
3.3.1.1 HSPA8重组蛋白预处理抑制M41感染CEK细胞 |
3.3.1.2 HSPA8抗体封闭抑制M41感染CEK细胞 |
3.3.2 M41-CEK不能在HSPA8过表达细胞系上连续传代 |
3.3.2.1 构建PCDH-puro-HSPA8-flag载体及表达验证 |
3.3.2.2 构建HSPA8蛋白过表达细胞系 |
3.3.2.3 M41在HSPA8蛋白过表达细胞系上的连续传代 |
3.3.3 HSPA8重组蛋白和HSPA8抗体抑制IBV-Beaudette株感染宿主细胞 |
3.3.3.1 肝素酶处理对于Beaudette株吸附到Vero细胞上的影响 |
3.3.3.2 HSPA8重组蛋白预处理抑制Beaudette感染Vero细胞 |
3.3.3.3 HSPA8抗体封闭细胞抑制Beaudette感染Vero细胞 |
3.3.4 过表达HSPA8抑制Beaudette在Vero细胞上的复制 |
3.3.5 敲低HSPA8对Beaudette株增殖的影响 |
3.3.5.1 转染筛选有效敲低HSPA8的siRNA |
3.3.5.2 敲低HSPA8促进Beaudette在Vero细胞上的增殖 |
3.3.6 过表达HSP90AB1抑制IBV-Beaudette在Vero细胞上的复制 |
3.3.7 敲低HSP90AB1促进IBV-Beaudette在H1299细胞上的复制 |
3.3.7.1 HSP90AB1稳定干扰的H1299细胞系的构建 |
3.3.7.2 干扰HSP90AB1表达不影响H1299细胞系活力 |
3.3.7.3 干扰HSP90AB1基因表达促进IBV复制 |
3.4 讨论 |
全文总结 |
参考文献 |
附录A 常用试剂配方 |
附录B 作者简介 |
(7)PDCoV N蛋白转运入核的分子机制探究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 文献综述 |
1 冠状病毒形态学 |
1.1 冠状病毒的形态结构及结构特征 |
1.2 CoV核衣壳蛋白简介 |
1.2.1 冠状病毒N蛋白结构分析 |
1.2.2 冠状病毒N蛋白的功能 |
2 核转运相关蛋白简介 |
2.1 核转运蛋白结构与家族成员 |
2.2 核转运的分子机制 |
2.3 核转运的临床意义及应用 |
第二章 猪δ冠状病毒N蛋白NLS序列探究 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 病毒、细胞及质粒 |
1.1.2 主要试剂 |
1.1.3 主要仪器 |
1.1.4 常用试剂的配制 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 PDCoV N基因NLS序列预测及引物设计 |
1.2.2 表达质粒的构建 |
1.2.3 重组质粒的真核表达及样品制备 |
1.2.4 Western blot实验 |
1.2.4.1 SDS-PAGE胶的制备及SDS-PAGE电泳 |
1.2.4.2 Western blot检测分析 |
1.2.5 间接免疫荧光实验及激光共聚焦扫描显微镜观察 |
2 实验结果 |
2.1 PDCoV N基因NLS序列预测结果 |
2.2 重组质粒的命名及其真核表达蛋白大小 |
2.3 N基因全长及突变体的Western blot和间接免疫荧光结果 |
2.3.1 PDCoV病毒及N基因全长质粒结果 |
2.3.2 三个位置全部突变或缺失的重组突变体结果 |
2.3.3 两个位置突变和/或缺失的重组突变体结果 |
2.3.4 单个位置突变或缺失的重组突变体结果 |
3 讨论 |
第三章 猪δ冠状病毒N蛋白与importinαs相互作用观察 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 病毒、细胞及质粒 |
1.1.2 主要试剂 |
1.1.3 主要仪器 |
1.1.4 常用试剂的配制 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 α家族核转运蛋白引物设计 |
1.2.2 表达质粒的构建 |
1.2.3 重组质粒的真核表达及样品制备 |
1.2.4 Western blot实验 |
1.2.4.1 SDS-PAGE胶的制备及SDS-PAGE电泳 |
1.2.4.2 Western blot检测分析 |
1.2.5 co-IP实验 |
1.2.5.1 重组质粒共转染 |
1.2.5.2 样品处理及co-IP实验 |
1.2.6 质粒共转染及间接免疫荧光实验 |
2 实验结果 |
2.1 重组质粒的命名及表达的蛋白大小 |
2.2 α家族核转运蛋白定位情况 |
2.3 免疫共沉淀鉴定与N蛋白相互作用的核转运蛋白 |
3 讨论 |
全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
(8)DDX17在汉滩病毒复制过程中作用的初步研究(论文提纲范文)
缩略语表 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
文献回顾 |
第一部分 与汉滩病毒核衣壳蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与鉴定 |
1.材料和方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
第二部分 DDX17 在汉滩病毒复制过程中的作用 |
1.材料和方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
小结 |
参考文献 |
研究成果 |
致谢 |
(9)猪流行性腹泻病毒AJ1102株感染Vero细胞的蛋白质组学及传代致弱研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略语表(Abbreviation) |
第1章 文献综述 |
1.1 猪流行性腹泻的流行病学 |
1.1.1 国外流行情况 |
1.1.2 国内流行情况 |
1.2 病毒分子生物学特性 |
1.2.1 PEDV的分类地位 |
1.2.2 PEDV的分子结构 |
1.2.3 PEDV的理化特性 |
1.2.4 PEDV复制周期 |
1.2.5 PEDV编码的蛋白及其功能 |
1.2.6 PEDV的感染致病机理 |
1.3 PEDV的疫苗研究进展 |
1.3.1 PEDV免疫特性 |
1.3.2 PEDV传统疫苗 |
1.3.3 PEDV基因工程疫苗 |
1.4 蛋白质组学研究技术 |
1.4.1 病毒学中的蛋白质组学研究 |
1.4.2 同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)技术 |
第2章 PEDVAJ1102株感染Vero细胞的蛋白质组学研究 |
2.1 研究目的与意义 |
2.2 实验材料 |
2.2.1 细胞、毒株 |
2.2.2 主要试剂 |
2.2.3 抗体及Western blot所需实验材料 |
2.2.4 细胞培养基及其配置 |
2.2.5 主要缓冲液与相关试剂及其配置 |
2.2.6 主要实验仪器及设备 |
2.2.7 分子生物学信息软件 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 猪流行性腹泻病毒的增殖 |
2.3.2 病毒滴度的测定 |
2.3.3 用于蛋白质组学分析的细胞样品的制备 |
2.3.4 全细胞蛋白质的提取 |
2.3.5 蛋白质的酶解 |
2.3.6 iTRAQ 8 plex试剂标记肽段 |
2.3.7 SCX分离 |
2.3.8 基于Triple TOF 5600的LC -MSMS分析 |
2.3.9 生物信息学分析 |
2.3.10 Western blot实验 |
2.3.11 间接免疫荧光实验与激光共聚焦显微镜观察 |
2.4 结果与分析 |
2.4.1 猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero细胞动力学分析 |
2.4.2 鉴定的蛋白质 |
2.4.3 差异蛋白的筛选 |
2.4.4 单一肽段(single-peptide)谱图注释 |
2.4.5 差异蛋白的亚细胞定位分析 |
2.4.6 差异蛋白的生物学进程聚类分析 |
2.4.7 差异蛋白的互作网络分析 |
2.4.8 差异蛋白的验证 |
2.5 讨论 |
2.5.1 细胞凋亡 |
2.5.2 ERK通路 |
2.5.3 HSP27蛋白 |
2.5.4 细胞骨架蛋白 |
2.5.5 其他团队的相关研究 |
第3章 PEDV AJ1102株的传代致弱研究 |
3.1 研究目的与意义 |
3.2 实验材料 |
3.2.1 细胞、毒株、及菌株 |
3.2.2 试验动物 |
3.2.3 载体与质粒 |
3.2.4 主要试剂 |
3.2.5 细胞培养基及其配置 |
3.2.6 主要缓冲液与相关试剂及其配置 |
3.2.7 主要实验仪器及设备 |
3.2.8 病理切片常用试剂 |
3.2.9 免疫反应试验所用抗原及血清 |
3.2.10 分子生物学信息软件 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 猪流行性腹泻病毒AJ1102株的连续传代及蚀斑克隆 |
3.3.2 病毒滴度的测定 |
3.3.3 病毒RNA的提取 |
3.3.4 病毒基因组的反转录 |
3.3.5 外源病毒检测 |
3.3.6 PEDV全基因组的分段克隆 |
3.3.7 PCR产物的电泳检测 |
3.3.8 PCR产物或酶切产物回收与纯化 |
3.3.9 DNA片段与载体的连接 |
3.3.10 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
3.3.11 连接产物的转化 |
3.3.12 质粒的制备与鉴定 |
3.3.13 重组质粒的测序 |
3.3.14 猪流行性腹泻发病判定标准 |
3.3.15 RNA的提取及实时荧光定量RT-PCR |
3.3.16 猪流行性腹泻病毒中和抗体测定 |
3.3.17 病理切片制作 |
3.3.18 病理组织切片免疫组化染色 |
3.3.19 PEDV病毒的扩大增殖 |
3.3.20 PEDV AJ1102株不同代次对3-5日龄仔猪的致病性试验 |
3.3.21 PEDV AJ1102株不同代次对24-26日龄仔猪的致病性试验 |
3.3.22 PEDV AJ1102株不同代次的免疫评价 |
3.3.23 PEDV AJ1102株S基因插入的氨基酸对毒力的影响 |
3.3.24 PEDV AJ1102株M基因氨基酸的突变与缺失对免疫原性的影响 |
3.3.25 统计学方法 |
3.4 结果与分析 |
3.4.1 PEDV AJ1102株的传代研究 |
3.4.2 PEDV AJ1102株不同代次的全基因组分析 |
3.4.3 PEDV AJ1102株不同代次对3-5日龄仔猪的致病性试验 |
3.4.4 PEDV AJ1102株不同代次对24-26日龄仔猪的致病性试验 |
3.4.5 PEDV AJ1102株不同代次的免疫原性评价 |
3.4.6 PEDV AJ1102株S基因插入的氨基酸对毒力的影响 |
3.4.7 PEDV AJ1102株M基因氨基酸的突变与缺失对免疫原性的影响 |
3.5 讨论 |
3.5.1 PEDV AJ1102株的传代致弱评价 |
3.5.2 PEDV AJ1102株的免疫原性评价 |
3.5.3 PEDV AJ1102株的致病性变化与S基因变异的相关性 |
3.5.4 PEDV AJ1102株的免疫原性变化与M基因变异的相关性 |
第4章 结论 |
参考文献 |
致谢 |
个人资料 |
教育经历 |
发表的文章 |
成果转化情况 |
(10)胡宁病毒核蛋白结构与功能的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
主要符号说明 |
第一章 引言 |
第一节 沙粒病毒研究现状概述 |
1.1.1 选题背景及意义 |
1.1.2 沙粒病毒科研究概况 |
1.1.2.1 沙粒病毒简介与分类 |
1.1.2.2 沙粒病毒生活周期 |
1.1.2.3 沙粒病毒引发的疾病 |
1.1.3 胡宁病毒研究概况 |
1.1.3.1 胡宁病毒分布、研究概况 |
1.1.3.2 胡宁病毒病毒结构和基因组构成 |
1.1.3.3 NP在胡宁病毒生活周期中的重要作用 |
1.1.4 单股负链RNA(-ssRNA)病毒NP的结构与功能研究概况 |
1.1.4.1 单节段-ssRNA病毒(the order Mononegavirales)NP结构与功能研究概况 |
1.1.4.2 多节段-ssRNA病毒NP结构与功能研究概况 |
1.1.5 本部分的课题内容与意义 |
第二节 冠状病毒研究现状概述 |
1.2.1 选题背景及意义 |
1.2.2 冠状病毒科研究概况 |
1.2.2.1 冠状病毒的简介与分类 |
1.2.2.2 冠状病毒的生活周期 |
1.2.2.3 冠状病毒引发的疾病 |
1.2.3 SARS病毒研究概况 |
1.2.3.1 SARS病毒研究概况 |
1.2.3.2 SARS病毒病毒结构和基因组组成 |
1.2.4 冠状病毒科蛋白质结构与功能研究概况 |
1.2.4.1 非结构蛋白结构与功能研究 |
1.2.4.2 结构蛋白结构与功能研究 |
1.2.4.3 附属蛋白的研究 |
1.2.5 本部分的课题内容与意义 |
第三节 文章结构安排 |
第二章 胡宁病毒核蛋白NP表达、纯化与结构解析 |
第一节 胡宁病毒NP生物信息学分析及预测 |
2.1.1 核苷酸序列分析 |
2.1.2 蛋白质序列基本信息 |
2.1.3 蛋白质序列其他分析 |
2.1.4 蛋白质同源序列比对 |
第二节 胡宁病毒NP的基因克隆与融合蛋白的构建 |
第三节 胡宁病毒NP的蛋白质表达与纯化 |
2.3.1 融合蛋白试表达 |
2.3.2 融合蛋白大量表达 |
2.3.3 融合蛋白的纯化 |
2.3.3.1 细胞的破碎 |
2.3.3.2 GST亲和层析 |
2.3.3.3 离子交换层析 |
第四节 胡宁病毒NP△340的蛋白质结晶与数据收集 |
2.4.1 蛋白质的结晶 |
2.4.1.1 蛋白质结晶原理 |
2.4.1.2 胡宁病毒NP△340蛋白质晶体的初步筛选 |
2.4.1.3 胡宁病毒NP△340蛋白质晶体的优化 |
2.4.2 数据的收集 |
第五节 胡宁病毒NP△340的蛋白质晶体数据相位的确定与结构修正 |
2.5.1 解决蛋白质晶体数据相位的方法 |
2.5.2 胡宁病毒NP△340相位的确定与精修 |
2.5.3 最终结构模型的质量评估 |
第三章 胡宁病毒NP△340的三维结构分析 |
第一节 胡宁病毒NP△340的总体结构的描述 |
第二节 胡宁病毒NP△340与拉沙热病毒NP的结构比较 |
第三节 胡宁病毒NP△340结构中金属离子的存在情况 |
第四节 胡宁病毒NP△340功能分析 |
3.4.1 溶液状态下的胡宁病毒NP△340结合二价金属离子情况 |
3.4.2 胡宁病毒NP△340的3’-5’核酸外切酶活性测定 |
第四章 SARS冠状病毒非结构蛋白7与非结构蛋白8 C端结构域的复合物 |
第一节 非结构蛋白8的C端结构域的证实 |
第二节 非结构蛋白8的C端结构域的克隆构建 |
第三节 非结构蛋白7与8的C端结构域的蛋白质共纯化 |
4.3.1 非结构蛋白7与8C的大量表达 |
4.3.2 非结构蛋白7与8C的菌体破碎 |
4.3.3 亲和层析 |
4.3.4 凝胶排阻层析 |
第四节 非结构蛋白7与8的C端结构域复合物的结构解析与分析 |
4.4.1 复合物的结晶 |
4.4.2 复合物的数据收集与处理 |
4.4.3 非结构蛋白7-8C复合物结构分析 |
第五章 结论 |
参考文献 |
致谢 |
附录A 胡宁病毒核蛋白核苷酸序列与氨基酸序列 |
附录B 非结构蛋白7与非结构蛋白8相关核苷酸序列与氨基酸序列 |
个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果 |
四、SARS冠状病毒核蛋白的质谱鉴定(论文参考文献)
- [1]IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究[D]. 武奇. 扬州大学, 2021
- [2]猪δ冠状病毒的分离鉴定及辅助蛋白在病毒复制及致病中的作用研究[D]. 张梦佳. 华中农业大学, 2021
- [3]猪肠道α冠状病毒辅助蛋白NS7a调控Ⅰ型IFN信号通路的机制研究[D]. 史晗. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究[D]. 万伟玮. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [5]肾型传染性支气管炎病毒致鸡痛风的多组学研究[D]. 许普之. 江西农业大学, 2020(07)
- [6]禽传染性支气管炎病毒S1蛋白与宿主细胞膜蛋白的互作研究及HSPA8在病毒感染过程中功能的初探[D]. 朱朋朋. 浙江大学, 2020
- [7]PDCoV N蛋白转运入核的分子机制探究[D]. 龚旺. 江西农业大学, 2019
- [8]DDX17在汉滩病毒复制过程中作用的初步研究[D]. 刘赫. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [9]猪流行性腹泻病毒AJ1102株感染Vero细胞的蛋白质组学及传代致弱研究[D]. 曾松林. 华中农业大学, 2016(04)
- [10]胡宁病毒核蛋白结构与功能的研究[D]. 张寅杰. 南开大学, 2013(06)