一、肿瘤组织中端粒酶活性的研究（论文文献综述）
陈彪[1]（2020）在《纳米银抗肿瘤活性及对肺组织的毒理学研究》文中指出纳米银由于其独特的理化性能和抗菌活性,在生物医学领域有诸多应用。最近的研究表明,纳米银具有很强的抗肿瘤活性,在一些动物模型中也表现出抗癌活性,但其诱导癌细胞杀伤的分子机制仍待进一步探讨。同时,纳米银在医疗领域的广泛应用,导致其暴露人体的风险增加,其生物安全性也备受关注。本研究以肿瘤细胞为研究对象,探究纳米银的抗肿瘤活性及生物学机制;以人肺正常细胞及小鼠为研究对象,探究低剂量纳米银长期暴露造成肺组织损伤及分子机制。具体研究结果如下:1.纳米银导致肿瘤细胞增殖抑制和细胞死亡:以HeLa细胞为研究对象,纳米银暴露后,检测细胞端粒酶活性、端粒长度、细胞增殖及相关蛋白表达。结果表明,纳米银不仅能在细胞外抑制端粒酶活性,还能诱导癌细胞端粒酶活性下调,小粒径纳米银（25 nm）对端粒酶活性的抑制作用显着高于大粒径纳米银（75 nm）,纳米银抑制端粒酶催化亚基（hTERT）蛋白表达导致端粒酶活性降低;进一步探究发现,纳米银对癌细胞端粒酶活性的持续抑制和对端粒结合蛋白的下调作用导致端粒缩短与功能障碍,干扰癌细胞染色体的稳定,使细胞在分裂后期形成后期桥。通过构建端粒酶过表达细胞、端粒酶敲低细胞、酶活突变细胞及TRF2突变细胞深入研究发现,过表达hTERT可减弱纳米银的抗肿瘤活性,而下调端粒酶活性或干扰端粒可增强纳米银对HeLa细胞的细胞毒性。这些结果表明,纳米银导致的端粒功能紊乱、端粒酶活性抑制参与了纳米银介导的HeLa细胞活性抑制密切相关,为理解纳米银的抗癌机制提供了新的见解。2.纳米银对肺细胞衰老与组织纤维化的的影响:通过检测纳米银暴露后细胞衰老水平变化及相关蛋白表达情况,研究纳米银对正常肺细胞及组织的损害。本研究发现,亚毒性剂量纳米银长期暴露导致肺正常细胞中衰老相关的β半乳糖苷酶活性上调,细胞核中染色质出现异常凝集,衰老相关的分泌因子基因表达上调,这些衰老生物标记物升高表明纳米银暴露可显着诱导肺细胞发生衰老。流式分析结果显示,纳米银暴露后细胞周期阻滞在G2/M期,凋亡细胞数目从3.3%上升到74.3%。进一步通过荧光分析表明纳米银诱导的细胞凋亡与衰老相关。机制研究表明,纳米银通过上调核转录因子NFKB、环氧合酶2（COX2）等蛋白表达,进而合成过多的前列腺素E2（PGE2）,导致肺细胞发生衰老;抑制COX2可将纳米银诱导的细胞衰老降低到正常水平。同时,动物实验也表明,纳米银诱导小鼠肺组织中COX2蛋白表达及声-半乳糖苷酶活性上调,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达增多及胶原沉积。综上所述,纳米银通过激活NFκB信号通路,上调COX2/PGE2表达与合成诱导肺细胞衰老,并通过凋亡方式清除衰老细胞;纳米银暴露加速小鼠肺部细胞衰老,引起肺组织炎症与轻微肺纤维化。
郑建波[2]（2020）在《肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义》文中指出研究背景:肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年诊断出超过40万名新患者,其中约17万名患者死于肾癌。近些年来肾癌的发病率呈上升趋势,其发病机制仍未被明确。近来发现端粒及端粒酶的活性在肿瘤包括肾癌等疾病的发生发展中可能起到了重要作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,由重复排列的富含鸟嘌呤的六聚体DNA及特定的端粒结合蛋白组成。对维持基因组和染色体稳定起重要作用。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,是一种能够延长端粒重复序列的酶,通过在人类染色体末端添加5’-TTAGGG-3’重复序列来维持端粒末端的T-Loop结构。在出生后的体细胞中端粒酶的表达通常受到抑制,如果其失调可能与致癌性有关。虽然它在大多数正常人类细胞中被抑制,但在高达90%的人类恶性肿瘤中可检测到端粒酶活性。端粒酶主要有人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）及相关蛋白3个不同的亚基组成,hTERT是端粒酶全酶的催化亚基,是端粒酶活性的限速因子。已知人hTERT基因的表达和功能通过多种途径调节,包括转录因子,启动子甲基化/突变,染色质重塑,交替剪接,蛋白质修饰导等。在这些调节手段中,转录调节是最重要的。自从发现正常细胞上大多数癌基因启动子存在高甲基化后,甲基化的遗传修饰被引起广泛的兴趣。DNA甲基化,一般发生在CpG位点。hTERT启动子区域没有TATA和CAAT盒,但含有一个致密的富含CG的CpG岛,这表明DNA甲基化在hTERT表达调控中可能起潜在的作用。对重亚硫酸氢盐处理后的基因组组测序,Theodora等人研究了 37种细胞系中hTERT的启动子甲基化状态,包括正常细胞,干细胞和癌细胞。虽然他们研究没有发现特异性甲基化位点或区域与hTERT表达相关,却证实了在端粒酶阴性的SUSM-1细胞系中通过去甲基化处理诱导了 hTERT表达。目前一些研究表明hTERT启动子的CpG岛甲基化与体内较低的端粒酶活性有关,然而更多研究表明hTERT启动子区域的超甲基化与hTERT mRNA表达正相关,这与我们通常认为的基因上某个区域的甲基化升高导致该基因的表达降低相反,因此DNA甲基化在hTERT表达和端粒酶活性调节中的潜在作用仍然有待阐明。肾细胞癌（RCC）是肾脏恶性肿瘤中最常见的癌症病理类型,诊断时转移率为25-30%。据报道,hTERT基因表达可以通过各种反式作用元件和顺式作用元件调节,包括 c-Myc,Sp1,WT1,HIF-1α,P53,TGF-β,SMYD3,染色质重塑和启动子突变。然而很少有研究涉及RCC中hTERT启动子的DNA甲基化状态。为此,我们使用焦磷酸测序定量评估了 hTERT启动子区域中转录上游的筛选出的5个CpG位点的甲基化水平,进一步探讨hTERT启动子甲基化百分比和hTERT表达,端粒酶活性,临床分期和患者预后之间的相关性,并对hTERT启动子甲基化水平与其表达和端粒酶活性之间的关系进行了探讨,探索hTERT启动子甲基化在肾肿瘤发生发展中的潜在作用,筛选预测肾肿瘤预后的生物标志物。研究目的:通过收集103例肾细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等临床病理特征并随访手术后预后情况,检测肾细胞癌及配对癌旁正常组织的hTERT启动子甲基化水平、hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性。分析hTERT启动子甲基化水平与hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性3者之间的相互关系及其与肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等特征之间的关系,对hTERT启动子甲基化水平在肾细胞癌中的潜在作用机制进行初步的研究。研究对象及方法:收集2009年至2014年期间,在山东大学齐鲁医院入院手术的103名患者中,通过根治性肾切除术（n=99）或肾单位保留手术（n=4）获得成对的肾肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织（NAT）。所有标本均通过组织病理学检查确认诊断。将标本在-80℃冷冻直至随后的实验室分析。对这些患者进行随访研究,随访时间从2009年1月1日起,截止时间2016年11月30日。以手术时间作为观察起点,直至患者出现死亡,记录每个病例的年龄、性别、左右、病理类型、TNM分期、Fuhrman分级、生存时间等资料。按照DNeasy组织试剂盒（Qiagen Ltd,Venlo,Netherlands）说明书从冷冻组织标本中提取DNA。通过分光光度法测量DNA浓度并调节至50ng/ml。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen）,严格按照产品说明书进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过采用特异性的引物对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR,PCR结果确认DNA的亚硫酸氢盐转化成功。使用PyroMark PCR试剂盒（Qiagen）进行 PCR。使用 PyroMark Assay Design Software 2.0 设计引物。对于所有样品,用0.5μl亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR反应。使用生物素标记的引物（反向引物）通过使用链霉抗生物素蛋白包被的Sepharose珠（GE Healthcare,UK）纯化PCR产物。将PCR产物与Sepharose珠结合,纯化,洗涤,用0.2M NaOH溶液变性,并再次洗涤。然后将0.3μM测序引物与纯化的单链PCR产物退火,并根据产品说明在PyroMark Q96（Qiagen）中进行焦磷酸测序。为了总亚硫酸氢盐转化的内部对照,焦磷酸测序的区域中的非CG胞嘧啶也被包括。使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样品中提取总细胞RNA。使用总共1μg的RNA用M-MLV逆转录酶（Thermo,Lithuania）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems,Foster City,CA）在 7000 实时 PCR系统（Applied Biosystems）中进行QPCR。β2-作为内参照物。根据阈值循环值,使用2-△△Ct方法计算标本中hTERT mRNA的相对水平。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒（Roche Diagnostics）测定端粒酶活性。提取1.0μg蛋白质进行测定,并且在端粒酶-引物延伸反应后进行30个PCR循环。使用ELISA显色反应检测PCR产物。端粒酶活性水平表示为吸光度[测定在450nm上的OD值（参考波长690nm）]。对正态分布的采用t检验。不符合正态分布的未配对组采用Mann-Whitney U检验,配对组采用Wilcoxon秩和检验,3组样本之间比较采用多样本比较的秩和检验,Kruskal-Wallis法来进行整体分析及两两比较。对于指标与预后之间的关系,采用Kaplan-Meier分析,对Log-rank检验有意义的单因素纳入多因素Cox回归分析,报告的所有P值均为双尾检验,并且采用值小于0.05。SPSS 16.0软件统计结果提示P=0.000,做图时按P<0.001显示处理。研究结果:我们提取12个肾癌组织和相对应癌旁正常组织（NAT）的DNA,采用重亚硫酸盐转化后,设计了 3对PCR引物对hTERT启动子的三个区域的14个CpG位点进行焦磷酸测序。在所有14个检查的CpG位点中发现,与NAT相比,我们发现肾癌组织中的hTERT启动子区CpG甲基化百分比更高,按P小于0.05,2组之间均有显着统计学意义。同时在三个区域PCR过程中,我们发现包含位点1至5区域的PCR扩增信号最稳定。以这个区域为研究对象,我们扩大检测样本,使用焦磷酸测序检测了 103名肾癌患者配对样本中位点1至位点5的甲基化百分比。我们发现与NAT相比,肾癌组织中所有5个CpG位点都显着高甲基化。在所有103个肾肿瘤组织和配对NAT中,患者的年龄与MMP1-5（means of methylation percentage of CpG sitel to site2）之间均不存在线性相关性。肾癌组织中MMP 1-5和hTERT全长mRNA表达（R2=0.450）之间观察到较高的正相关。一致地,在MMP 1-5和端粒酶活性之间也发现了正相关（R2=0.446）。我们的数据表明hTERT启动子在肾癌组织中是高甲基化的,并且甲基化水平与hTERT mRNA表达和端粒酶活性密切相关。我们研究hTERT启动子甲基化水平与临床病理特征之间的关联,发现所有患者的甲基化与年龄和性别无关。同时我们发现较高水平的hTERT启动子甲基化水平与疾病阶段显着相关,但是我们的数据发现Fuhrman等级之间与hTERT甲基化水平没有统计学显着差异。同时,透明细胞RCC（ccRCC）和非ccRCC之间的hTERT启动子甲基化水平没有显着差异。肾肿瘤组织与NAT相比,全长hTERT mRNA表达及端粒酶活性有明显的统计学差异,hTERT表达与端粒酶活性之间存在直线相关性。经单因素的分析,患者的TNM分期,细胞Fuhrman分级,hTERT启动子甲基化水平,hTERT mRNA表达水平,端粒酶活性对肾癌术后生存率有影响,经多因素Cox回归分析发现AJCC分期、hTERT启动子甲基化水平是影响肾癌病人预后的独立因素。研究结论:综上所述,我们通过对人肾癌中hTERT启动子甲基化水平、hTERT表达及端粒酶活性与临床特征和预后之间的相关性研究,我们发现hTERT启动子甲基化与hTERT表达/端粒酶活性之间存在正相关,hTERT表达与端粒酶活性之间存在正相关。hTERT启动子甲基化此外,我们发现了 hTERT启动子甲基化、hTERT mRNA表达及端粒酶活性与临床结果之间的密切关联,是肾癌预后不良的危险因素。hTERT启动子CaAvg（按48.3%分层）,AJCC分层是影响肾癌患者手术之后预后的独立因素,hTERT启动子甲基化水平影响hTERT mRNA表达及端粒酶活性,影响肾癌预后,揭示这种表观遗传改变可以作为RCC诊断和预后的有价值的生物标志物。
熊佳惠[3]（2020）在《基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制》文中指出目的:基于网络药理学的方法,探讨附子理中汤对于晚期胃癌的作用机制。方法:首先,通过TCMSP数据库、Drug Bank数据库和Pharm Mapper平台对附子理中汤所含化学活性成分进行筛选并获取其作用靶点,再利用GAD、OMIM及CTD数据库获得胃癌的相关靶点;然后,利用Draw Ven Diagram平台制作韦恩图,获得两者的交集靶点蛋白,通过Cytoscape3.5.1软件构建出蛋白互作图;再通过DAVID分析工具和KOBAS3.0软件对搜集到的靶点蛋白从生物过程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）和细胞组分（cellular component,CC）三个方向进行基因本体功能富集分析和KEGG通路分析;最后,利用PDB数据库、Systems Dock Web Site数据库集进行受体-配体的分子对接,并分析docking scores,验证附子理中汤治疗晚期胃癌的有效性。结果:从TCMSP数据库筛选出附子理中汤的147种化学成分,其中预测到4791个靶点,通过CTD、OMIM筛选出28006个与胃癌相关的靶点,最后韦恩图确定附子理中汤治疗晚期胃癌存在346个潜在靶标;其中附子理中汤与胃癌相互作用的关键靶标有TP53（肿瘤抑制蛋白p53）、AKT1（蛋白激酶B）、CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A）、STAT3（信号转导子与转录激活因子3）、BCL2L1（促生存因子）、JUN（核内癌基因）、CCND1（细胞周期素D1）、EGF（表皮生长因子）等,主要作用机制可能涉及2-Oxocarboxylicacid metabolism（2-氧羧酸代谢）信号通路和Propanoate metabolism（丙酸盐代谢）信号通路等分子通路,分子对接结果中表明STAT3对接分数最高,与附子理中汤有较好的结合性。结论:附子理中汤治疗晚期胃癌的关键靶点包括TP53（肿瘤抑制蛋白p53）、AKT1（蛋白激酶B）、CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A）、STAT3（信号转导子与转录激活因子3）、BCL2L1（促生存因子）、JUN（核内癌基因）、CCND1（细胞周期素D1）、EGF（表皮生长因子）等,其主要作用机制可能涉及2-Oxocarboxylicacid metabolism（2-氧羧酸代谢）信号通路和Propanoate metabolism（丙酸盐代谢）信号通路等分子通路等,靶点STAT3与附子理中汤有较好的结合性,可能在附子理中汤治疗晚期胃癌的过程中发挥着至关重要的作用。
段阳芳[4]（2019）在《舌鳞状细胞癌中HuR与端粒酶活性之间关系的研究》文中指出目的:探究舌鳞状细胞癌中RNA结合蛋白HuR（ELAVL1）对端粒酶活性和端粒长度的影响及作用机制。方法:1.收集2018年间于我院行舌鳞癌切除术患者的新鲜癌症组织及周围癌旁组织,用端粒重复序列扩增方法（TRAP）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测其端粒酶活性和HuR的蛋白表达水平。2.用RNA-pulldown实验和RNA免疫沉淀法（RNA-IP）来检测HuR与端粒酶核心成分TERC的结合程度。3.在舌鳞癌细胞SCC25细胞系中敲低HuR,用Western blot和实时荧光定量法（qPCR）分别检测其对端粒核心成分TERT和TERC的影响。4.在舌鳞癌细胞SCC25细胞系中敲低HuR,用RNA-pulldown法检测敲低HuR对TERC和TERT结合的影响;同时,用TRAP法检测敲低HuR对端粒酶活性的影响。5.在SCC25细胞中长期敲低HuR用DNA免疫印迹法（Southern blot）检测其对端粒长度的影响。结果:1.舌鳞癌患者癌组织中端粒酶活性以及HuR的表达水平都比癌旁组织中的高,且具有统计学意义（P<0.05）。2.用RNA-pulldown和RNA-IP证实了HuR能够和端粒酶RNA TERC结合。3.在SCC25细胞中敲低HuR并不影响TERT和TERC水平的表达,但是减弱端粒酶核心成分TERC与催化亚基TERT的结合,进而可以影响端粒酶活性。4.长期敲低HuR的SCC25细胞端粒明显缩短。结论:舌鳞癌中RNA结合蛋白HuR可通过结合端粒酶RNA TERC上影响端粒酶核心成分的组装,进而影响端粒酶活性和端粒长度。
汪旭东[5]（2019）在《聚集诱导发光核酸探针在癌症的检测和光动力治疗中的应用》文中指出荧光材料的研究推进了科技的发展,也使得我们能够获取更多的知识。尤其是利用荧光材料,我们可以更好的了解生化过程以及生物分子的功能。然而,传统的荧光材料在高浓度或者团聚后,其受聚集诱导猝灭（ACQ）的影响导致荧光猝灭。为了防止受荧光材料团聚引起荧光猝灭的影响,传统的荧光材料用于生物领域时,需要其在水溶液中有良好的溶解性。通过在荧光团引入极性基团的策略增加染料在水溶液中的溶解性。然而,由于传统的荧光材料本身含有疏水的苯环容易引起染料在水溶液中团聚,所以在水溶液中传统荧光材料团聚后,荧光依然会发生减弱甚至是猝灭的现象。最近发展的聚集诱导发光材料在良溶剂呈单分散状态时荧光很弱,而聚集后由于分子内的转动受阻荧光增强。尽管基于聚集诱导发光材料报道了一系列探针用于检测以及光动力治疗。但是聚集诱导发光材料用于生命分析和治疗及与其它治疗方法联合用于癌症治疗的研究还是相对较少。本课题以聚集诱导发材料为中心,利用聚集诱导发光材料独有的聚集诱导发光特性以及聚集诱导发光材料可以作为光敏剂的优点,发展了基于聚集诱导发光材料用于诊断和治疗的方法,拓展了聚集诱导发光材料的生物应用。具体研究内容包括以下三个方面:（1）聚集诱导发光荧光分子（AIE）修饰DNA形成的探针（TPE-R-DNA）结合核酸外切酶III辅助循环信号放大策略,用于癌症组织成像以及预后分析。TPE-R-DNA包含两部分:疏水的长波长AIE分子（TPE-R-N3）作为信号部分;能够特异性识别MnSOD mRNA的亲水性的DNA（Alk-DNA）作为识别部分。没有靶标MnSOD mRNA时,TPE-R-DNA因为良好的水溶性在水溶液中几乎没有荧光。而当MnSOD mRNA存在时,靶标与探针TPE-R-DNA杂交形成双链。然后双链中的探针被Exo III水解并释放出疏水的荧光基团。随后,疏水的荧光基团在水中团聚荧光从而增强。TPE-R-DNA对MnSOD mRNA检测限低至0.6 pM。探针可用于测定癌症组织中的MnSOD mRNA表达水平,结果表明肾癌中MnSOD mRNA的表达水平低于癌旁组织中MnSOD mRNA的表达水平。此外,通过分析组织中MnSOD mRNA表达水平预测癌症患者的预后。结果表明,肿瘤组织中MnSOD mRNA含量越低的患者生存时间越短。（2）GSH响应的MnO2负载具有聚集诱导发光特性的光敏剂（TB）和核酸酶（DNAzyme）用于癌症成像和光动力-基因联合治疗。其中TB为具有聚集诱导发光特性的光敏剂,可用于光动力治疗;而核酸酶在Mn2+辅助下可以降解细胞中EGR-1 mRNA从而可用于基因静默。体外的实验表明MnO2-核酸酶-TB纳米复合物（MDT）能够被细胞摄入并被细胞内的GSH降解释放出核酸酶和TB。核酸酶通过基因静默降低EGR-1蛋白的表达,从而抑制癌细胞生长。此外,释放的TB在细胞中团聚荧光增强,并且在光照时产生的单线态氧进一步抑制癌细胞的生长。光动力和基因静默联合治疗显着提高肿瘤治疗效果。活体实验表明MDT通过光动力和基因静默联合治疗有效抑制MCF-7荷瘤小鼠的肿瘤生长。（3）聚集诱导发光特性的带正电的AIE分子（SSNB）用于检测端粒酶活性以及端粒酶响应光动力治疗。当细胞中含有端粒酶时,端粒酶引物扩增。SSNB随后与扩增后带负电的引物通过静电作用结合,荧光分子的分子内自由转动受限导致荧光增强。SSNB不仅可以检测不同类型癌细胞中端粒酶的活性,还可以基于细胞中端粒酶含量的不同区分癌细胞和正常细胞。此外,SSBN还可用于端粒酶响应高选择性和高效的光动力治疗。
刘雪雯[6]（2019）在《胃癌中BRM对hTERT选择性剪接和端粒酶活性的调节》文中进行了进一步梳理研究目的胃癌是一种高发的恶性肿瘤,是所有肿瘤病死率的第三位,给人类健康造成了巨大的威胁,引起了沉重的疾病负担。随着医疗技术的不断进步,胃癌的5年存活率有所提升,但是依然不容乐观。胃癌的发生发展过程中涉及多种因素,包括环境因素和遗传因素等。SWI/SNF复合物是一种ATP酶依赖的染色质重塑复合物,其核心的ATP酶亚基有两种,BRM和BRG1。在多种肿瘤包括胃癌的组织和细胞系中有BRM蛋白水平的下调,说明除了ATP酶活性功能,BRM蛋白可能有抑制肿瘤的作用。有研究表明BRM作为一种选择性剪接调控因子,参与调控其他肿瘤相关蛋白的表达,进而影响肿瘤的发生发展。人端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶的核心催化亚基,是肿瘤细胞的一种标志物,hTERT的前体mRNA会发生选择性剪接,产生多种选择性剪接转录本,但是这些选择性剪接转录本都不能翻译成有逆转录酶活性的hTERT蛋白。因此本研究的目的是探究胃癌中BRM蛋白对hTERT选择性剪接模式和端粒酶活性的影响,为肿瘤的靶向治疗提供新的方向和证据。研究方法本课题主要分为两个部分:第一部分,采用生物信息学的方法,调用多种数据库分析BRM和BRG1在细胞中的分布,在人类正常组织和肿瘤组织中的表达水平,与胃癌病人的生存分析,与胃癌中幽门螺杆菌感染的相关性,相互作用基因以及GO分析和通路富集分析。第二部分,进行生物学试验,用携带shRNA的慢病毒载体感染胃癌细胞系,稳定敲低胃癌细胞中的BRM,利用逆转录PCR,蛋白免疫印迹,端粒重复序列扩增法（TRAP）,克隆形成和RNA-Seq等方法检测BRM敲低对hTERT的选择性剪接模式,端粒酶活性和细胞增殖的影响,探讨BRM在肿瘤中的作用。研究结果第一部分:生物信息学分析结果显示BRM均匀分布在细胞质和细胞核中,BRG1主要分布在细胞核中;在人类正常组织中BRM和BRG1的mRNA和蛋白都有广泛的表达;BRM高表达的胃癌患者生存期相对较长,而BRG1低表达的胃癌患者生存期相对较长,可能代表了BRM和BRG1在胃癌的进展过程中有不同的作用;在无感染幽门螺旋杆菌感染的胃癌患者中BRM和BRG1表达量较多且易发生突变,在有幽门螺旋杆菌感染的胃癌患者中BRM和BRG1表达量较少;得到BRM的相互作用基因133个,BRG1的相互作用基因213个,有64个基因是二者的相互作用基因重合的部分,二者的相互作用基因主要富集在肿瘤相关的信号通路中,提示BRM和BRG1在肿瘤的发生发展中可能起着重要的作用。第二部分:采用携带shRNA的慢病毒载体感染胃癌细胞系构建BRM稳定敲低的细胞系,逆转录PCR检测hTERT前体mRNA的选择性剪接模式,结果显示,BRM敲低的细胞中全长型转录本的表达水平显着升高,之后用TRAP方法检测了端粒酶活性,结果显示BRM敲低的细胞中的端粒酶活性也出现了显着升高,这提示BRM可以通过调控hTERT的选择性剪接模式进而影响端粒酶活性。研究结论一、生物信息学分析的结果表明,BRM和BRG1可能参与胃癌的发生发展,并且可能具有不同的作用。二、生物学实验的结果显示,BRM的敲低可以影响hTERT的选择性剪接模式和端粒酶活性,表明BRM是hTERT选择性剪接的一个调控因子,有望开发作为肿瘤治疗的一个靶点。
戴薇[7]（2019）在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中提出癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因（direct target gene,DTG）,包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因（包括126个激活基因和90个抑制基因）是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达（NF-κB-activated gene expression,Nage）载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列（decoy）与最小启动子序列（minimal promoter）融合构成NF-κB特异性启动子（decoy minimal promoter,DMP）,DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达（telomerase-activated gene expression,Tage）系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞（BMSC）不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶（homothallic switching endonuclease,HO）切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和NF-κB激活的基因表达（Nage）载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒（AAV）中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达（Nage）载体、端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
杨慧[8]（2016）在《靶向泛素连接酶STUB1对宫颈癌放射敏感性的影响及其机制研究》文中研究表明第一部分泛素连接STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌预后的关系目的：研究泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT胞浆或胞核蛋白在不同宫颈组织中的表达情况及其与宫颈癌临床病理特征及预后的关系,分别探讨其在宫颈癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组织化学SP法在组织芯片中分别检测STUB1、hTERT蛋白在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变（Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN）及宫颈癌组织中的表达差异；采用卡方检验分析hTERT蛋白不同亚细胞表达情况与宫颈癌患者不同临床病理特征间的关系；采用Kaplan-Meier法分别分析STUB1、hTERT蛋白表达对宫颈癌患者总生存率的影响；采用COX回归法分析影响宫颈癌预后的独立因素；采用Spearman法分析宫颈癌组织中STUB1与hTERT表达的相关性。结果：宫颈癌组织中STUB1蛋白表达显着低于正常宫颈和CIN组织（P<0.05）,而hTERT蛋白显着高表达（P<0.05）。在宫颈癌组织中,STUB1蛋白的低表达率在不同年龄、不同人流情况、不同绝经情况、不同肿瘤大小、不同组织类别、不同FIGO分期、不同淋巴结转移情况、不同阴道及宫旁浸润情况、不同放疗情况和不同局部复发情况的宫颈癌患者中无显着统计学差异（P>0.05）；而与肿瘤分化程度密切相关,即分化程度低的宫颈癌患者,STUB1蛋白的表达越低（P<0.05）。hTERT总蛋白的高表达率与肿瘤的FIGO分期、分化程度、局部复发密切相关,而与其它临床病理特征无相关性（P>0.05）：即FIGO分期高、分化程度低、局部复发的宫颈癌患者,hTERT总蛋白的表达越高（P<0.05）。STUB1蛋白或hTERT总蛋白高表达组和低表达组宫颈癌患者的5年生存率分别为（STUB1 51.8% vs 48.2%, P=0.016; hTERT 70.00% vs 63.50%, P=0.128）;除此之外,hTERT蛋白胞核而不是其胞浆高表达组的宫颈癌患者5年生存率显着高于低表达（胞浆68.6% s 71.7%,P=-0.070；胞核61.8% vs 67.2%,P=0.016）,但二者皆与宫颈癌其他临床病理因素均无相关性。多因素分析显示,hTERT蛋白总及胞核表达水平不是宫颈癌预后的独立影响因素；然而,STUB1及hTERT蛋白胞浆表达水平可作为宫颈癌预后的独立因素。Spearman相关分析显示,STUB1蛋白表达水平与hTERT胞浆或胞核蛋白表达情况皆无明显相关性。结论：STUB1及hTERT表达情况皆与宫颈癌发生过程密切相关。STUB1蛋白低表达水平与宫颈癌预后差密切相关；然而,hTERT总蛋白及胞核表达水平尚不能作为宫颈癌患者预后的预测指标,仅其蛋白胞浆表达水平有望成为宫颈癌患者预后判断的指标。因此,STUB1及hTERT蛋白胞浆表达情况有望成为预测宫颈癌预后的指标,并有可能成为宫颈癌治疗的新靶点。第二部分 泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌放射敏感性的关系目的：研究泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT胞浆或胞核蛋白在宫颈癌放射敏感/抗拒株模型中的表达情况,分析其与宫颈癌细胞内在放射敏感性的关系。方法：采取6MV的X射线在室温下分别对指数生长期的C33A和Hela细胞按照每周一次600cGy的剂量进行辐射,分别照射10次和12次；采用克隆形成实验对照射后达到稳定传代的细胞株进行放射生物学参数测定,将照射后验证具有放射抗拒性的细胞株分别命名为C33AR和HelaR;采用Western blotting方法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中STUB1及hTERT蛋白表达水平；采用TRAP和Real-time PCR法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中端粒酶活性及端粒长度的变化；采用流式细胞仪分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中细胞周期及细胞凋亡的变化；采用transwell法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中细胞侵袭的变化；采用免疫荧光技术分别检测C33A/C33AR细胞照射前后Y H2AX的变化；采用免疫共沉淀法（Co-IP）检测C33A/C33AR中hTERT总蛋白泛素化水平的变化。结果：克隆形成结果显示：C33A细胞株的D0=1.34±0.028,SF2=0.516±0.058;C33AR细胞株的D0=1.89±0.008, SF2=0.655±0.041;Hela细胞株的D0=2.59±0.007, SF2=0.625±0.041; HelaR细胞株的D0=2.76±0.012, SF2=0.751±0.041;表明经过6MV X线辐射后,C33AR及HelaR分别较C33A及Hela细胞的放射抗拒性显着增加（P<0.05）。Western blotting结果显示,两株放射抗拒株hTERT总蛋白表达水平较其亲本株显着升高（P<0.05）,而STUB1蛋白表达水平较其亲本株显着降低。TRAP和Real-time PCR结果显示,放射抗拒株端粒酶活性和端粒长度分别较其亲本株显着提高（P<0.05）。细胞周期显示放射抗拒株中放射诱导的G2/M期阻滞持续时间显着较其亲本长（P<0.05）。细胞凋亡检测显示,放射抗拒株自发性与放射诱导的凋亡水平皆较其亲本株显着减少（P<0.05）。Transwell显示,C33AR的细胞侵袭力较其亲本株显着增加（P＞0.05）。免疫荧光结果表明C33AR中自发性和辐射诱导的γH2AX皆较其亲本显着减少（P<0.05）。免疫共沉淀结果显示C33AR细胞中,hTERT总蛋白泛素化水平较其亲本降低；Western blotting检测C33A/C33AR中hTERT蛋白在胞浆或胞核的表达水平,结果显示放抗株中hTERT蛋白胞浆表达明显较高,hTERT蛋白胞核表达明显较低。结论：成功建立宫颈癌放射抗拒细胞株C33AR及HelaR,宫颈癌细胞内在放射敏感性降低可能与STUB1表达减少导致的hTERT蛋白胞浆降解减少,从而引起的端粒酶活性增加、端粒延长、射线诱导的G2/M期阻滞时间延长、自发性凋亡及射线诱导的凋亡率减少、自发性和辐射诱导的γH2AX减少有关。因此,深入研究STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制,明确hTERT蛋白胞浆降解增多对放射敏感性的效应,有助于为研究潜在放射增敏靶点提供新的方向。第三部分过表达泛素连接STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制目的：本课题组前期研究发现hTERT蛋白胞浆表达水平可能与宫颈癌放射敏感性相关,且泛素连接酶STUB1在放抗株中低表达,与hTERT总蛋白及胞浆表达水平负相关,可调控放射敏感性。然而,STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制尚不明。因此,本课题主要目的是研究STUB1作为人宫颈癌细胞放射增敏靶点的潜在机制。方法：采用Lipo2000脂质体转染联合嘌呤霉素筛选法构建STUB1过表达的稳定转染细胞株C33AR-STUB1、HelaR-STUB1及其对应的空白对照稳定细胞株C33AR-NC、HelaR-NC;采用Western blotting法验证并检测蛋白表达水平变化；采用克隆形成实验检测STUB1过表达后细胞放射敏感性的变化;采用TRAP和eal-time PCR法分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中端粒酶活性和端粒长度的变化；采用流式细胞仪法分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中照射前后细胞周期和凋亡的变化：采用免疫荧光分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1细胞照射前后DNA损伤灶点变化；采用免疫共沉淀法（Co-IP）检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中hTERT蛋白在胞浆中的泛素化修饰的变化。结果：成功构建过表达STUB1的C33AR-STUB1和HelaR-STUB1细胞株及其空白对照C33AR-NC和HelaR-NC.克隆形成结果显：C33AR-NC细胞株的D0=2.44, SF2=0.603;C33AR-STUB1细胞株的D0=1.70, SF2=0.441; HelaR-NC细胞株的D0=2.44, SF2=0.751; HelaR-STUB1细胞株的D0=2.33,SF2=0.533;表明过表达STUB1的细胞C33AR-STUB1和HelaR-STUB1获得了显着的放射增敏效应。TRAP和Real-time PCR结果显示,C33AR-STUB1细胞端粒酶活性和端粒长度皆较C33AR-NC细胞显着降低（P<0.05）；Western blotting结果显示,过表达STUB1后,细胞中hTERT蛋白总及胞浆表达水平降低,但对胞核表达无影响,PI3K、AKT及p-AKT表达降低,端粒结合蛋白TRF1及RAP1表达增加,TRF2、PTOP1、POT1及TIN2表达减少；Co-IP结果显示hTERT蛋白胞浆的泛素化修饰增加。细胞周期检测显示STUB1过表达后,细胞G2/M期分布增加；联合射线后细胞周期结果显示STUB1过表达显着缩短射线诱导的G2/M期阻滞持续时间；Western blotting结果显示过表达STUB1,显着降低ATM、 ATR、Chk1、Chk2、p-Chk1及p-Chk2表达水平,而p-ATM、p-ATR及CDC25C表达水平增加。细胞凋亡检测结果显示STUB1过表达后,细胞自发性和射线诱导的早期凋亡皆增加；Western blotting结果显示过表达STUB1,促凋亡蛋白Bax与抑制凋亡蛋白Bcl-2表达的比例提高。免疫荧光检测提示STUB1过表达,显着增加自发性及射线诱导的DNA损伤灶。结论：过表达泛素连接酶STUB1可导致放射增敏,其调控细胞放射敏感性的可能机制如下：通过促进hTERT蛋白胞浆泛素化修饰使hTERT蛋白胞浆储备减少,并通过下调P13K及AKT,使PI3K/AKT介导的hTERT磷酸化激活减少,从而导致进入胞核的有活性的hTERT减少,从而降低端粒酶活性,进而端粒缩短,下调大部分端粒相关蛋白,使端粒相对欠稳定,从而使ATM/ATR-Chkl/Chk2-CDC25C介导的细胞周期G2/M期阻滞缩短、Bax/Bcl2比例提高而致细胞凋亡增加,进而增加细胞DNA损伤灶,最终导致放射增敏。因此,STUB1有望成为放射增敏的靶点,其通过影响hTERT蛋白胞浆表达水平从而调控放射敏感性的现象,为研究端粒稳态相关因素调控放射敏感性的机制提供了可供参考的思路。
刘显勋[9]（2016）在《HNRNP A1在非小细胞肺癌中的作用和机制研究》文中指出HNRNP A1是HNRNPs蛋白家族的一员,在增殖活跃的哺乳动物细胞中含量丰富,其参与RNA的剪切及运输等过程。HNRNP A1还可以促进NF-κB的抑制性亚基IκBα的降解过程,并且参与细胞中端粒的延长过程。已有研究表明,HNRNP A1在多种肿瘤细胞中高表达,并参与肿瘤的发生发展。本项研究发现HNRNP A1蛋白在肺腺癌肿瘤组织细胞中高表达。为了探索HNRNP A1在非小细胞肺癌中的作用,我们运用RNAi技术干扰其在非小细胞肺癌细胞中的表达。然后我们检测敲除HNRNP A1对非小细胞肺癌细胞的影响。我们发现,敲除肺癌细胞肺癌中HNRNP A1的表达可以显着抑制非小细胞肺癌细胞的增殖能力及克隆形成能力。并且非小细胞肺癌细胞的细胞分裂周期更多的停滞在G0/G1期。这表明,HNRNP A1可能在非小细胞肺癌细胞中发挥重要的作用,为进一步研究HNRNP A1在肺癌治疗中的潜在作用打下基础。
刘丽[10]（2016）在《人端粒酶逆转录酶hTERT启动子在恶性肿瘤发生和诊断中的作用研究》文中研究说明端粒酶（telomerase）是能以自身RNA为模板合成端粒DNA的逆转录酶,其主要作用是维持染色体末端端粒（telomere）的长度以保持染色体的稳定性。人端粒酶主要由两个部分组成,人端粒酶RNA模板（human telomerase RNA, hTR）和人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）。研究证实,端粒酶与恶性肿瘤的发生发展关系密切,而在这个过程中,hTERT作为端粒酶的限速酶发挥了关键作用,但是其表达调控机制尚不完全明确。本论文主要从以下三个方面研究hTERT启动子在恶性肿瘤发生发展过程中的调控机制及其在肿瘤诊断中的潜在应用：（1）hTERT启动子DNA甲基化,（2）hTERT启动子突变,（3）hTERT的转录调控机制。第一部分hTERT启动子DNA甲基化在胃肠道恶性肿瘤诊断中的研究背景胃肠道恶性肿瘤（gastrointestinal cancer,GIC）,主要包括胃癌（gastric cancer, GC）和结直肠癌（colorectal cancer,CRC）,是最常见的恶性肿瘤之一。目前内镜活检是诊断GIC的主要手段,但是内镜检查是有创性检查且价格昂贵。基于粪便的无创性检查方法是更易于被接受的GIC筛查和术后复发监测的手段。越来越多的研究者致力于研究粪便中肿瘤标记物在GIC诊断中的应用。与易于降解的mRNA和蛋白相比,DNA甲基化更为稳定,是更为可靠的疾病检测标记物。DNA甲基化（DNA methylation）是人类基因表观遗传学（epigenetics）的主要修饰方式之一,以往的很多研究揭示了多种基因如CDH1、P16、hMLH1、MGMT、 RASSF2等异常甲基化与GC和CRC的关系。同时,也有研究报道在CRC患者血清和粪便标本中发现了多种基因启动子区域DNA的异常甲基化,例如SEPT9、 RASSF2、SFRP2等,都有可能做为CRC患者无创性诊断的分子标记物。多项研究表明,在包括GIC在内的90%以上的人类恶性肿瘤细胞中,存在hTERT mRNA的过表达和端粒酶的异常活化。作为端粒酶的催化亚基,hTERT的表达水平在很大程度上决定了端粒酶的活性。hTERT启动子富含CpG二核苷酸,即存在CpG岛（CpG islands）。研究发现,hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞之间呈现出不同的甲基化状态,这使得hTERT启动子DNA甲基化可能作为一种潜在的分子标记物用于疾病检测。已有研究报道,GC和CRC肿瘤组织中的hTERT启动子DNA甲基化水平高于癌旁正常组织,且甲基化水平与hTERT mRNA的表达水平密切相关。但尚未有研究报道粪便中hTERT启动子DNA甲基化的情况。目的阐明GIC患者肿瘤组织和粪便中hTERT启动子DNA甲基化的水平,探讨粪便中hTERT启动子DNA甲基化水平是否可以作为GIC诊断和监测的指标。方法本研究收集了34例GC和CRC患者的肿瘤组织和癌旁正常组织标本,69例GC和CRC患者的粪便标本,以及62例非肿瘤患者的粪便标本。肿瘤患者的粪便标本均在接受治疗前获取,并即刻于-80℃C冻存。分别提取组织和粪便中的基因组DNA,然后进行重亚硫酸盐转化（bisulfite conversion）并纯化,采用焦磷酸测序（pyrosequencing）技术定量检测组织和粪便中hTERT启动子2个CpG位点的甲基化水平。统计分析GC和CRC患者粪便中CpG位点甲基化水平与患者年龄、性别、肿瘤分化、肿瘤大小、临床分期、肿瘤侵袭性等临床病理资料之间的相关性,分析该方法对GC和CRC诊断的敏感性和特异性。结果GIC肿瘤组织和癌旁正常组织中hTERT启动子的2个被检测CpG位点Site1和Site2的甲基化水平均具有显着性差异（P=0.008和P=0.004）。GIC患者粪便中Sitel和Site2的甲基化水平显着高于非肿瘤患者（P<0.05）。将Site1和Site2的甲基化水平取平均值Avg,受试者工作特征曲线（ROC）分析显示,对所有的GIC患者,Site1、Site2、Avg的曲线下面积（AUC）依次为0.769、0.777、0.799。GC和CRC患者粪便中Site1和Site2的甲基化水平没有显着性差异,且甲基化水平与年龄、性别无关。在CRC中,Duke C/D期患者Sitel位点的甲基化水平显着高于Duke A/B期患者（P<0.05）。而在GC中,组织学低分化和临床晚期肿瘤患者Site2位点的甲基化水平更高（P<0.05）。GC患者粪便潜血试验（OBT）的AUC为0.537,CRC患者粪便OBT的AUC为0.834。将粪便hTERT启动子的甲基化水平与OBT综合起来进行多参数回归ROC分析,GC和CRC的AUC可分别达到0.806和0.920。结论在所检测的2个hTERT启动子区域的CpG位点Site1和Site2中,GIC肿瘤组织的甲基化水平明显高于癌旁正常组织,GIC患者粪便中hTERT启动子DNA甲基化水平明显高于非肿瘤患者。GIC患者粪便hTERT启动子特定位点的甲基化水平与肿瘤的分化程度、临床分期、以及侵袭性有关。粪便hTERT启动子的甲基化水平与OBT综合分析可以提高CRC患者诊断的敏感性和特异性。第二部分hTERT启动子突变在肾细胞癌中的研究背景肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,RCC包括不同类型的肿瘤,主要有透明细胞癌（clear cell RCC,ccRCC）,肾乳头状癌（papillary RCC,pRCC）和肾嫌色细胞癌（chromophobe RCC,chRCC）。在RCC中,端粒酶活性异常升高,但是端粒酶活化的机制尚不明确。近来研究者在黑色素瘤中发现了hTERT启动子有2个高频突变：C228T和C250T,突变产成了新的ETS1结合序列,从而显着提高了hTERT启动子的转录活性以及hTERT mRNA的表达水平,并将端粒酶活性提高了2-4倍。因此,这种突变可能是造成hTERT表达和端粒酶活性在肿瘤中异常升高的原因之一。另外,hTERT启动子突变也和患者的临床病理特征或疾病的预后有关。研究显示,在黑色素瘤中,hTERT启动子突变与患者年龄、肿瘤的厚度、是否形成溃疡以及患者的预后等有关。在泌尿系统恶性肿瘤中,hTERT启动子突变在膀胱癌组织中的发生率较高,并且被认为是膀胱癌中目前已知的发生频率最高的基因改变。关于hTERT启动子突变是否存在于RCC中,现有的研究还不能明确这一点,并且也不清楚突变是否与患者的临床病理特征有关。目的分析RCC患者肿瘤组织中hTERT启动子突变的情况,明确以上突变与患者临床病理特征的关系,为进一步明确端粒酶异常活化的机制提供理论依据。方法本研究收集了109例RCC患者的肿瘤组织和癌旁正常组织,提取组织的DNA,然后采用Sanger测序法,分别检测hTERT启动子上C228T突变、C250T突变以及VHL基因改变的发生情况。提取肿瘤组织的RNA,采用定量Real-timePCR技术检测hTERT mRNA的表达水平。统计分析肿瘤组织中hTERT启动子突变的发生与患者年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、肿瘤侵袭性以及VHL基因改变之间的相关性。结果在被检测的109例RCC肿瘤组织中,有10例存在hTERT启动子突变,其中9例是C228T突变,1例是C250T突变。在hTERT启动子突变阳性和突变阴性的肿瘤组织中,hTERT mRNA的表达水平明显不同,突变阳性的ccRCC中hTERT mRNA的表达水平明显升高。在96例ccRCC中,9例突变阳性的患者中处于临床Ⅲ/ⅣV期的有5例（5/9,55.6%）,87例突变阴性的患者中处于临床Ⅲ/Ⅳ期的有9例（9/87,10.3%）,呈现显着统计学差异（P=0.003）。hTERT启动子突变的发生率在患者年龄、性别、肿瘤大小等方面没有明显的组间差异。在9例检测出hTERT启动子突变的ccRCC患者中,有2例发生了远处转移,3例发生了肾被膜侵袭,而在未检测出突变的87例ccRCC患者中,4例发生了远处转移,3例发生了肾被膜侵袭。远处转移和肾被膜侵袭的发生率在突变阳性组和突变阴性组分别是5/9（55.6%）和7/87（8.0%）（P=0.001）。在所检测的77例ccRCC肿瘤组织VHL基因位点中,32例（41.6%）存在VHL位点的一个或多个改变,而在这些改变中,4例发生在hTERT启动子突变阳性的患者中,28例发生在hTERT启动子突变阴性的患者中,其差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论RCC肿瘤组织中存在着hTERT启动子突变。ccRCC中瘤组织中hTERT启动子突变与hTERT mRNA表达水平呈正相关,突变阳性组和突变阴性组在肿瘤的临床分期以及肿瘤的侵袭性方面存在明显差异,但是在患者的年龄、性别、肿瘤大小等方面无明显差异。ccRCC肿瘤组织中hTERT启动子突变阳性组和突变阴性组在VHL基因改变方面无统计学差异。第三部分精浆刺激宫颈癌端粒酶活化过程中hTERT的转录调控研究背景宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,宫颈癌的发生与多种因素有关,如人乳头瘤病毒（HPV）感染、频繁的性生活等,但其确切原因和发生机制尚不明确。研究证实,宫颈癌中hTERT的表达和端粒酶活性都异常升高。在宫颈组织由宫颈上皮内瘤变（CIN）向宫颈癌恶性转化的过程中端粒酶激活是非常重要的步骤,但是端粒酶活化的机制尚不明确。研究表明,hTERT的转录激活是端粒酶活化的关键步骤,但是目前hTERT的转录调控机制仍然不明确。hTERT转录活性的调控有很多因子的参与,包括转录活化因子和抑制因子。c-MYC、Sp1、雌激素等被证实是hTERT转录活化因子,能上调hTERT的表达；P53、转录激活蛋白1（AP-1）、Mad等被认为是抑制因子,抑制hTERT启动子的活性。精浆是精液的主要组成成分之一,含有前列腺素、雌激素、孕激素、血管生长因子、细胞因子、蛋白酶、蛋白激酶等多种物质。以往研究发现,精浆可以促进宫颈癌的发生和发展。精浆或前列腺素E2（PGE2）处理宫颈癌细胞系后,可以诱导PGE2受体EP1、EP4、表皮生长因子受体（EGFR）等表达上调,进而刺激肿瘤的发生发展。另有研究显示,精浆中的物质还可以刺激子宫内膜上皮细胞中白介素1-β（IL1-β）.白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、环氧化酶-2（COX-2）等多种细胞因子或酶的表达,进而影响子宫内膜上皮细胞的功能。目的探讨在精浆刺激宫颈细胞恶变的过程中,hTERT的作用及hTERT的转录调控机制。方法（1）hTERT mRNA表达水平检测：三株宫颈癌细胞系HeLa Caski、SiHa,以及从人正常宫颈组织中分离出原代的宫颈上皮细胞,培养至对数生长期后经血清饥饿处理48h,实验组分别加入不同量的精浆,对照组均不加入精浆,24h后收获细胞,提取细胞总RNA后采用定量Real-time PCR技术检测hTERT mRNA的表达水平。（2）端粒酶活性检测：经培养和处理的三株细胞系和宫颈上皮细胞（方法同上）,收获细胞后采用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒定量检测端粒酶活性。（3）Western Blotting:检测COX-2、Spl的蛋白表达水平。（4）hTERT启动子活性测定：采用hTERT启动子活性报告质粒和Progema荧光素酶活性双报告系统进行检测。（5）siRNA技术：采用COX-2特异性siRNA,抑制HeLa细胞中COX-2的表达。（6）染色质免疫共沉淀（ChIP）技术：实验组HeLa细胞（加入PGE2或精浆）和对照组HeLa细胞（不加入PGE2或精浆）,甲醛溶液使组蛋白或转录因子与DNA交联。收获细胞后将DNA超声碎裂成200-1 000bp的片段。用Spl抗体或乙酰化的组蛋白H3、H4抗体沉淀相应的DNA-蛋白质复合物,用蛋白A/G琼脂糖收集,然后洗脱、去交联。最后获取DNA,进行定量PCR扩增。（7）动物实验：雌性BALB/c裸鼠12只（出生6周）。血清饥饿的HeLa细胞,实验组加入精浆,对照组不加入精浆。悬浮后注射入裸鼠腋窝部皮下,3周后取出肿瘤组织分析。结果（1）在三株细胞系HeLa、Caski、SiHa中,实验组（精浆处理组）的hTERT mRNA的表达水平均明显高于对照组（P<0.01）,实验组HeLa和Caski中端粒酶活性也明显升高（P<0.05和P<0.01）。而在原代培养的正常宫颈上皮细胞中,对照组hTERT mRNA表达量很低或无法检出,但实验组加入精浆（终浓度为1：10）时,hTERT mRNA的表达水平明显升高（P<0.05）,端粒酶活性也明显升高（P<0.05）。（2）选用特异性COX-2 siRNA抑制HeLa细胞中COX-2的表达后,实验组（精浆处理组）的hTERT mRNA表达未见明显异常,而用非特异性siRNA处理HeLa细胞后,实验组hTERT mRNA表达水平明显高于对照组。（3）采用hTERT荧光素酶报告载体p181晰转染HeLa细胞,实验组HeLa细胞hTERT启动子活性明显高于对照组（P<0.05）。然后用COX-2特异性siRNA抑制COX-2表达后,实验组hTERT启动子活性与对照组相比,其差异不具有统计学意义。（4）采用Western Blotting的方法,实验组HeLa细胞分别加入精浆和PGE2,24小时后收集细胞进行检测,发现精浆处理组和PGE2处理组Spl蛋白的表达水平均明显升高,分别是之前的5.6倍和6.5倍。（5）染色质免疫共沉淀（ChIP）实验发现,HeLa细胞加入精浆或PGE2处理后,Spl抗体沉淀的DNA中hTERT启动子片段被明显募集,还同时伴有乙酰化的组蛋白H3和H4的增加。（6）动物实验结果显示,裸鼠体内精浆处理过的HeLa细胞所生长出的肿瘤组织比对照组HeLa细胞所生长出的肿瘤组织体积明显增大、重量明显增加。结论精浆能促进宫颈癌细胞系和原代培养的正常宫颈上皮细胞中hTERT mRNA表达水平及端粒酶活性上调。精浆诱导HeLa细胞中hTERT启动子活性升高,同时伴有Spl表达增加以及Spl与hTERT启动子结合的增强。COX-2介导了精浆促进hTERT转录激活和端粒酶活性上调的过程,即这一过程是通过COX-2-PGE2-Sp1轴实现的。
二、肿瘤组织中端粒酶活性的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤组织中端粒酶活性的研究（论文提纲范文）
（1）纳米银抗肿瘤活性及对肺组织的毒理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳米银概述 |
| 1.2.1 纳米银合成方法 |
| 1.2.2 纳米银医学应用 |
| 1.3 纳米银抗肿瘤应用前景 |
| 1.3.1 纳米银抗肿瘤研究进展 |
| 1.3.2 纳米银抗肿瘤机制 |
| 1.3.3 靶向端粒/端粒酶抗肿瘤前景 |
| 1.4 纳米银暴露与健康风险 |
| 1.4.1 纳米银肺组织暴露途径 |
| 1.4.2 纳米银长期低剂量暴露的健康风险 |
| 1.4.3 细胞衰老对肺组织慢性疾病的影响 |
| 1.5 论文研究目的和主要内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 纳米银 |
| 2.2 主要试剂、抗体、耗材和仪器 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 抗体及质粒 |
| 2.2.3 耗材 |
| 2.2.4 仪器 |
| 2.3 常用工作液的制备 |
| 2.4 细胞培养 |
| 2.4.1 细胞传代 |
| 2.4.2 细胞冻存 |
| 2.5 纳米银溶液配制及细胞暴露 |
| 2.6 细胞活力实验 |
| 2.7 克隆形成实验 |
| 2.8 稳转细胞株构建 |
| 2.9 荧光法标记衰老细胞 |
| 2.10 一步法TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.11 RNA提取 |
| 2.12 ELISA法测定PGE2浓度 |
| 2.13 蛋白质样品提取与制备 |
| 2.14 组蛋白提取 |
| 2.15 蛋白免疫印迹 |
| 2.16 端粒酶活性检测 |
| 2.16.1 端粒酶提取 |
| 2.16.2 端粒酶活性检测 |
| 2.17 基因组DNA提取 |
| 2.18 端粒长度测定 |
| 2.19 核/质蛋白分离提取 |
| 2.20 PI单染法检测细胞周期 |
| 2.21 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.22 动物分组及处理 |
| 2.23 动物样本采集与处理 |
| 2.24 H&E染色 |
| 2.25 石蜡切片免疫组化 |
| 2.26 石蜡切片Masson染色 |
| 2.27 统计分析 |
| 第3章 纳米银调控端粒端粒酶发挥抗肿瘤活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 纳米银表征 |
| 3.2.2 纳米银对胞外/胞内端粒酶活性的影响 |
| 3.2.3 纳米银对肿瘤细胞端粒长度及染色体不稳定性的影响 |
| 3.2.4 端粒酶活性变化影响纳米银的肿瘤细胞杀伤能力 |
| 3.2.5 端粒酶活性变化对肿瘤细胞辐射敏感性的影响 |
| 3.2.6 纳米银长期暴露对肿瘤细胞抗性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 低剂量纳米银长期暴露对肺细胞衰老的影响及机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 低剂量纳米银长期暴露对人胚肺成纤维细胞(MRC5)活力的影响 |
| 4.2.2 低剂量纳米银长期暴露诱导的细胞衰老水平变化 |
| 4.2.3 细胞周期阻滞在低剂量纳米银长期暴露诱导的细胞衰老中的作用 |
| 4.2.4 NFκB信号通路在低剂量纳米银长期暴露诱导细胞衰老中的作用 |
| 4.2.5 细胞凋亡在低剂量纳米银长期暴露诱导的衰老细胞清除中的作用 |
| 4.2.6 低剂量纳米银长期暴露对小鼠肺组织衰老的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.1.1 总结 |
| 5.1.2 创新性 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 图清单 |
| 附录B 缩略词表 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（2）肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 人TERT启动子甲基化水平及其与肾细胞癌病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人hTERT启动子甲基化水平等影响肾细胞癌预后的多因素分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾癌DNA甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（3）基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1 文献研究 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 西医发病机制 |
| 1.3 晚期胃癌的中西医治疗概述 |
| 1.4 附子理中汤对晚期胃癌的作用 |
| 2 数据分析与成果讨论 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 晚期胃癌的中西医治疗进展 |
| 1 中西医对晚期胃癌的认识 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 西医发病机制 |
| 2 中西医治疗晚期胃癌 |
| 2.1 中医治疗 |
| 2.2 西医治疗 |
| 2.3 中西医联合治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）舌鳞状细胞癌中HuR与端粒酶活性之间关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床资料 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 主要的试剂及药品 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 溶液和试剂配方 |
| 2.1.6 实验所用序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞的培养 |
| 2.2.2 质粒的构建 |
| 2.2.3 慢病毒转染稳定细胞系的筛选 |
| 2.2.4 端粒酶活性检测 |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹（Western blot） |
| 2.2.6 逆转录实时荧光定量 PCR 反应（RT-qPCR） |
| 2.2.7 RNA-蛋白结合实验（RNA-pulldown assay） |
| 2.2.8 RNA 免疫沉淀实验（RNA-IP） |
| 2.2.9 端粒酶长度检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 舌鳞癌患者癌症组织和正常组织中的端粒酶活性水平 |
| 3.2 舌鳞癌患者癌症组织和正常组织中HuR的表达水平 |
| 3.3 HuR和端粒酶RNA TERC的结合情况 |
| 3.4 HuR对端粒酶核心成分TERT和 TERC表达水平的影响 |
| 3.5 HuR通过影响TERT和 TERC的组装进而调控端粒酶活性 |
| 3.6 长期敲低HuR后舌鳞癌细胞的端粒缩短情况 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 端粒酶在肿瘤的作用 |
| 4.2 端粒酶在口腔舌鳞状细胞癌中作用 |
| 4.3 舌鳞癌中HuR对于端粒酶活性的影响 |
| 第5章 结语与展望 |
| 5.1 结语 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）聚集诱导发光核酸探针在癌症的检测和光动力治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 聚集诱导发光材料在生物体系中的应用 |
| 1.2.1 检测 |
| 1.2.3 治疗 |
| 1.3 本文主要研究内容 |
| 1.4 参考文献 |
| 2 基于DNA-AIE探针检测组织中MnSOD mRNA和预后分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 凝胶电泳实验 |
| 2.2.4 TPE-R-N_3 的合成 |
| 2.2.5 TPE-R-DNA的合成 |
| 2.2.6 细胞培养 |
| 2.2.7 细胞毒性 |
| 2.2.8 细胞内MnSOD mRNA的检测 |
| 2.2.9 激光共聚焦荧光成像 |
| 2.2.10 荧光定量PCR |
| 2.2.11 临床样本分析 |
| 2.2.12 组织学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 TPE-R-DNA的合成与设计机理 |
| 2.3.2 TPE-R-DNA的表征 |
| 2.3.3 可行性分析 |
| 2.3.4 TPE-R-DNA体外检测MnSOD mRNA |
| 2.3.5 荧光成像 |
| 2.3.6 组织中的MnSOD mRNA成像 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 3 基于MnO_2-核酸酶-AIE光敏剂复合物用于细胞选择性成像和光动力-基因联合治疗 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 MnO_2 纳米片的合成 |
| 3.2.4 MnO_2-核酸酶-TB纳米复合物的合成 |
| 3.2.5 体外酶切反应 |
| 3.2.6 凝胶电泳实验 |
| 3.2.7 免疫印迹实验 |
| 3.2.8 体外治疗 |
| 3.2.9 单线态氧的测定 |
| 3.2.10 细胞培养 |
| 3.2.11 激光共聚焦荧光成像 |
| 3.2.12 细胞中的单线态氧的测定 |
| 3.2.13 定量PCR |
| 3.2.14 免疫荧光实验 |
| 3.2.15 细胞毒性测定 |
| 3.2.16 活体实验 |
| 3.2.17 体内光动力治疗 |
| 3.2.18 MDT纳米材料毒性评估 |
| 3.2.19 免疫组化染色 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 MnO_2 纳米片合成与表征 |
| 3.3.2 MnO_2 纳米片负载TB和核酸酶 |
| 3.3.3 MDT溶液实验 |
| 3.3.4 MDT细胞内可行性研究 |
| 3.3.5 活体实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 4 基于关-开型AIE探针检测端粒酶及端粒酶响应的光动力治疗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 化合物的合成 |
| 4.2.4 单线态氧的测定 |
| 4.2.5 细胞培养 |
| 4.2.6 端粒酶的提取 |
| 4.2.7 激光共聚焦荧光成像 |
| 4.2.8 体外光动力实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 SSNB的合成及SSNB的光学性质 |
| 4.3.2 SSNB体外检测端粒酶 |
| 4.3.3 细胞内检测端粒酶 |
| 4.3.4 原位成像 |
| 4.3.5 端粒酶激活光动力治疗 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 研究内容总结 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 下一步工作展望 |
| 致谢 |
| 附录1 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
| 附录2 化合物谱图 |
| 博士学位论文创新点概述 |
（6）胃癌中BRM对hTERT选择性剪接和端粒酶活性的调节（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、生物信息学方法研究SMARCA2和SMARCA4 的表达 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 SMARCA2和SMARCA4 在细胞中的分布和组织中的表达 |
| 1.2.2 SMARCA2和SMARCA4 与胃癌患者的的生存分析 |
| 1.2.3 SMARCA2和SMARCA4 与幽门螺杆菌感染的相关性 |
| 1.2.4 SMARCA2和SMARCA4 的相互作用基因和富集分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、胃癌中BRM缺失对hTERT选择性剪接及端粒酶活性的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.1.6 引物及序列 |
| 2.1.7 实验方法和流程 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 shRNA敲低BRM的效果 |
| 2.2.2 BRM敲低对hTERT选择性剪接模式的影响 |
| 2.2.3 BRM敲低对端粒酶活性和细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 BRM敲低的RNA测序分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 hTERT前体mRNA选择性剪接的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
| 1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
| 1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
| 1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
| 1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
| 1.3 端粒酶与癌症 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 癌症干细胞 |
| 1.4.1 CSC的生物学特性 |
| 1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
| 1.4.3 NF-κB与 CSC |
| 1.5 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞siRNA干扰 |
| 2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
| 2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR |
| 2.3.6 Ch IP-qPCR |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
| 2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
| 2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
| 2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
| 2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
| 2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
| 2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.9 qPCR检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 细胞培养和转染 |
| 3.3.3 Western blotting |
| 3.3.4 细胞增殖能力测定 |
| 3.3.5 相对端粒长度检测 |
| 3.3.6 病毒包装和纯化 |
| 3.3.7 病毒滴度测定 |
| 3.3.8 病毒感染 |
| 3.3.9 动物实验 |
| 3.3.10 qPCR检测 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
| 3.4.2 Nage载体特异性验证 |
| 3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.4 相对端粒长度检测 |
| 3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
| 3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 细胞培养和转染 |
| 4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
| 4.3.4 端粒合成检测 |
| 4.3.5 相对端粒长度检测 |
| 4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
| 4.3.7 病毒感染 |
| 4.3.8 动物实验 |
| 4.3.9 qPCR检测 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Tage系统特异性验证 |
| 4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
| 4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.4 相对端粒长度检测 |
| 4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
| 4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
| 4.4.7 Tage系统优化 |
| 4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 细胞培养和转染 |
| 5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
| 5.3.4 病毒感染 |
| 5.3.5 细胞活力测定 |
| 5.3.6 RT-qPCR检测 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
| 5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
| 5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
| 5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
| 5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
| 5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（8）靶向泛素连接酶STUB1对宫颈癌放射敏感性的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstracts |
| 1 引言 |
| 第一部分：泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌预后的关系 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 STUB1、hTERT在不同宫颈病变中的表达情况 |
| 3.2 根据ROC曲线定义STUB1、hTERT总蛋白表达的cut off值 |
| 3.3 STUB1、hTERT总蛋白表达与宫颈癌临床病理特点的关系 |
| 3.4 根据ROC曲线定义hTERT胞浆、胞核蛋白表达的cut off值 |
| 3.5 hTERT胞浆、胞核蛋白表达与宫颈癌临床病理特点的关系 |
| 3.6 生存分析 |
| 3.7 STUB1和hTERT胞浆或胞核表达在宫颈癌组织中相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 第二部分：泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌放射敏感性的关系 |
| 5 材料与方法 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 6 研究结果 |
| 6.1 宫颈癌放射敏感/抗拒株模型的放射敏感性检测 |
| 6.2 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中hTERT总蛋白表达的检测 |
| 6.3 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中端粒酶活性的检测 |
| 6.4 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中端粒长度的检测 |
| 6.5 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中细胞周期的检测 |
| 6.6 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中细胞凋亡的检测 |
| 6.7 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中细胞侵袭性的检测 |
| 6.8 肿瘤放射敏感/抗拒株模型C33A/C33AR中rH2AX的检测 |
| 6.9 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中C33A/C33ARhTERT蛋白泛素化水平的变化及hTERT亚细胞定位表达情况 |
| 7 讨论 |
| 第三部分：过表达泛素连接酶STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制 |
| 8 材料和方法 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 实验方法 |
| 9 研究结果 |
| 9.1 STUB1稳定过表达的C33AR-STUB1及HelaR-STUB1细胞株的成功建立 |
| 9.2 STUB1过表达对C33AR及HelaR细胞放射敏感性的影响 |
| 9.3 过表达STUB1对端粒酶活性的影响 |
| 9.4 过表达STUB1对端粒长度的影响 |
| 9.5 过表达STUB1对细胞周期的影响 |
| 9.6 过表达STUB1对细胞凋亡的影响 |
| 9.7 过表达STUB1对rH2AX的影响 |
| 9.8 过表达STUB1对hTERT亚细胞定位表达及hTERT胞浆蛋白泛素化水平的影响 |
| 9.9 过表达STUB1对PI3K/AKT、端粒相关蛋白、细胞周期、凋亡、DNA损伤修复表达的影响 |
| 10 讨论 |
| 11 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）HNRNP A1在非小细胞肺癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.绪论 |
| 1.1 肺癌概述 |
| 1.2 核不均一核糖核蛋白(HNRNP s) |
| 1.2.1 HNRNPs结构特点 |
| 1.2.2 HNRNPs的基本功能 |
| 1.2.3 HNRNPs与肿瘤 |
| 1.2.4 HNRNP A/Bs |
| 1.3 核不均一核糖核蛋白A1(HNRNP A1) |
| 1.4 HNRNP A1与NF-κB |
| 1.5 HNRNP A1与端粒 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 基本化学试剂 |
| 2.1.2 酶类 |
| 2.1.3 试剂盒及耗材 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 菌株、质粒和细胞株 |
| 2.1.6 抗体 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞/组织总RNA的提取 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR(Realtime PCR) |
| 2.2.4 RNAi慢病毒载体构建 |
| 2.2.5 蛋白质检测技术 |
| 2.2.6 免疫荧光 |
| 2.2.7 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)分析. |
| 2.2.8 软琼脂集落生长实验 |
| 2.2.9 免疫组化 |
| 2.2.10 流式细胞术 |
| 2.2.11 荧光显微镜观察 |
| 2.2.12 非小细胞肺癌的分期标准 |
| 2.2.13 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 与癌旁组织相比HNRNP A1蛋白在肺腺癌组织中高表达 |
| 3.2 慢病毒介导的shRNA可以有效降低A549细胞中HNRNP A1 的表达 |
| 3.3 敲除HNRNP A1基因可以抑制A549细胞的增殖能力 |
| 3.4 敲除HNRNP A1基因的A549细胞分裂更多的停滞在G0/G1期 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 核不均一核糖核酸(hnRNPs)在肿瘤中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文目录 |
（10）人端粒酶逆转录酶hTERT启动子在恶性肿瘤发生和诊断中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 hTERT启动子DNA甲基化在胃肠道恶性肿瘤诊断中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 hTERT启动子突变在肾细胞癌中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 精浆刺激宫颈癌端粒酶活化过程中hTERT的转录调控研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
四、肿瘤组织中端粒酶活性的研究（论文参考文献）
- [1]纳米银抗肿瘤活性及对肺组织的毒理学研究[D]. 陈彪. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [2]肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义[D]. 郑建波. 山东大学, 2020(01)
- [3]基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制[D]. 熊佳惠. 广西中医药大学, 2020(02)
- [4]舌鳞状细胞癌中HuR与端粒酶活性之间关系的研究[D]. 段阳芳. 南昌大学, 2019(01)
- [5]聚集诱导发光核酸探针在癌症的检测和光动力治疗中的应用[D]. 汪旭东. 华中科技大学, 2019
- [6]胃癌中BRM对hTERT选择性剪接和端粒酶活性的调节[D]. 刘雪雯. 天津医科大学, 2019(02)
- [7]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)
- [8]靶向泛素连接酶STUB1对宫颈癌放射敏感性的影响及其机制研究[D]. 杨慧. 武汉大学, 2016(01)
- [9]HNRNP A1在非小细胞肺癌中的作用和机制研究[D]. 刘显勋. 上海交通大学, 2016(03)
- [10]人端粒酶逆转录酶hTERT启动子在恶性肿瘤发生和诊断中的作用研究[D]. 刘丽. 山东大学, 2016(10)