一、半乳糖修饰人血清白蛋白的质谱分析（论文文献综述）
戴士杰[1]（2021）在《长效化胰高血糖素样肽-1类似物设计、合成及降糖活性研究》文中认为胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及其类似物（如Exendin-4,Ex4）是多肽类肠降血糖素药物,已广泛用于治疗2型糖尿病（T2DM）。目前,临床上使用基于GLP-1/Exendin-4多肽作为治疗糖尿病药物的一个主要挑战是,多肽易被蛋白酶降解和快速被肾脏清除等固有的属性,导致其在体内的半衰期很短、成药性差,临床上需要通过高剂量和增加给药频率来达到治疗效果。目前已发展了多种策略用于改善GLP-1多肽药物的药代动力学性质,主要包括聚乙醇化修饰、长链脂肪酸或其他小分子修饰提高与白蛋白的相互作用、GLP-1多肽与白蛋白或Fc的融合表达等。然而,上述策略在改善GLP-1及其类似物药代动力学性质的同时,也产生一些新的问题和挑战,如免疫原性,产品的均一性以及制备工艺的复杂化等问题。研究具有新型作用机制的GLP-1类似物可提高T2DM的治疗效果和作用窗口。本论文以临床批准的GLP-1多肽Exendin-4为模型,基于正交化学和分选酶（Sortase A,Srt A）的定点修饰技术,探索了葡聚糖和半抗原定点修饰新策略用来改善Exendin-4的药代动力学性质,提高其长效降糖活性;论文最后运用丝氨酸/苏氨酸连接（Ser/Thr ligation,STL）策略和重组表达技术相结合,发展了半合成方法合成索玛鲁肽。主要结果如下:（1）通过肟连接化学对“化学突变”的Ex4类似物（Ex4-12K*,Ex4-27K*,Ex4-12-27K*）进行葡聚糖定点修饰,延长Ex4的长效降糖效果。通固相多肽合成技术对Ex4多肽12,27和12/27位进行“化学突变”,制备成含羟胺赖氨酸的Ex4类似物,借助正交肟连接化学将不同分子量的葡聚糖（Mw=6000 Da和20000 Da）定点地修饰到Ex4多肽类似物含羟胺的赖氨酸上,成功地构建了六种均一葡聚糖-Ex4（dextran-Ex4）偶联物。体外受体结合实验和腹腔糖耐量实验（IPGTT）显示葡聚糖修饰的位点对胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）激活能力和急性降血糖能力有显着影响,其中对Ex4的12位进行葡聚糖修饰对其GLP-1R激活能力影响最小,完全保留了Ex4促进胰岛素分泌进而调节血糖的能力。长效降血糖实验结果表明,除了dextran-Ex4-12K*-27K*（6000）,其他dextran-Ex4偶联物的长效降血糖能力均得到提高,且修饰的位点以及用于修饰的葡聚糖分子量大小对长效降糖作用效果都有显着影响。构效关系研究结果表明:dextran-Ex4-12K*（20000）在第4、6、8、12以及24小时的血糖水平以及最终的AUC glucose 0-24h值保持最低,表明dextran-Ex4-12K*（20000）具有最优的长效降糖作用。（2）设计和合成新型小分子半抗原DNP定点修饰的Exendin-4类似物Ex4-DNP,发展了半抗原DNP作为内源性抗体粘合剂用以延长Ex4半衰期的新策略。通过Srt A介导的连接反应（SML）制备三种含不同长度连接臂的Ex4-DNP偶联物6-8和FITC标记的Ex4-DNP偶联物9-11。体外细胞GLP-1R激活实验结果显示DNP定点修饰会导致其刺激GLP-1R的能力略有下降,但EC50值仍保持在纳摩尔水平（6:1.39 n M;7:1.98 n M;8:4.03 n M）。药代动力学实验结果表明,当体内存在丰富的抗DNP抗体时,使用半抗原DNP对Ex4进行修饰可以显着延长其半衰期。其中含有中等长度PEG连接臂的偶联物10的半衰期达到了3.55小时,是相同条件下未修饰Ex4的4.9倍。此外,Ex4-DNP偶联物在预免疫的db/db小鼠模型的长效降糖活性相比于在未预免疫的db/db小鼠模型显着增强,其中含有PEG3连接臂的偶联物7表现出最好的长效降血糖效果,这与药代动力学实验结果一致。最后在长期治疗实验中,与每天两次皮下注射未修饰的Ex4相比,每天一次皮下注射Ex4-DNP偶联物7在改善糖基化血红蛋白（HbA1c）、葡萄糖耐量、脂质代谢和保护胰岛方面表现出更有益的作用,并且无明显的毒性作用和免疫原性。（3）设计和合成新型半抗原鼠李糖脂定点修饰的Exendin-4类似物Ex4-Lipid-Rha,发展了半抗原鼠李糖作为内源性抗体粘合剂和脂肪链作为白蛋白粘合剂双重作用机制延长Exendin-4半衰期的新策略。通过化学酶法SML反应成功构建Ex4-Lipid-Rha偶联物5-7。体外细胞GLP-1R激活实验表明鼠李糖脂修饰导致其激活GLP-1R的能力略有下降,但EC50值仍保持在亚纳摩尔水平（5:0.14 n M;6:0.19 n M;7:0.21 n M）。体内IPGTT实验证明,对Ex4的C端进行鼠李糖脂修饰不会影响其促进胰岛素分泌和急性降血糖的活性。长效降血糖实验结果表明在没有对db/db糖尿病小鼠模型进行Rha-OVA预免疫之前,Ex4-Lipid-Rha偶联物5-7的长效降血糖能力均获得一定的增强;另一方面,对db/db糖尿病小鼠模型进行Rha-OVA预免疫之后,偶联物5-7的长效降血糖能力进一步得到增强,此时的增益效果要不仅归因于脂肪链与体内白蛋白的相互作用,还得益于半抗原Rha与内源性抗体的相互作用。（4）建立了基于STL化学连接的半合成法制备长效降糖药物索马鲁肽。从溶剂、温度、助溶剂和投料比等方面优化了四肽水杨醛酯2和Arg34 GLP-1（11-37）之间的STL反应,最终确定在1:120比例的吡啶-醋酸缓冲体系（mol/mol）,反应温度为40°C,Arg34GLP-1（11-37）与2的当量比为1:3.76,以及不添加任何助溶剂的条件下,以85%的转化率成功制备索马鲁肽骨架;在此基础之上,进一步优化了索马鲁肽骨架中Lys26的侧链氨基与长链脂肪酸的选择性偶联反应条件,对反应体系的种类,反应液p H值以及酰化剂滴加速度进行了筛选,最终确定以50 m M H3BO3（p H=10.5）反应体系,酰化试剂滴加速度为0.5小时作为最佳条件,上述酰化反应的转化率大于99%;最后脱除保护基后,从质谱和细胞水平的生物活性方面证明利用本方法合成的索马鲁肽和原研药一致。
贾晓妮[2]（2021）在《罗汉果中两种G蛋白偶联受体靶向活性成分色谱筛选及评价》文中提出中药作为我国医药卫生领域长期临床实践的产物,具有安全性高、疗效确切和成本较低的优势,已成为创新药物研发的重要源泉。然而中药及其复方成分复杂,组方配伍灵活多变,具有多靶点、多途径、多成分协同起效的特点,使得中药新药创制面临巨大挑战。破解上述挑战的核心是如何从复杂的中药中筛选靶向活性成分,以探索中药的功效物质基础,进而阐明其作用机制并揭示其科学内涵。本论文在前期随意固定化β2-肾上腺素受体（β2-adrenergic receptor,β2-AR）色谱方法的基础上,通过建立β2-AR和M3-毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M3-muscarinic acetylcholine receptor,M3R）高活性定向固定化方法,开展罗汉果平喘活性成分筛选及评价研究,以期为受体色谱法在中药靶向活性成分筛选方面的推广和应用提供依据,对中药功效物质基础研究和新药创制具有一定的意义。全文共分5章,作者的主要贡献如下:1、建立了β2-AR及M3R定向固定化方法。在前期随意固定化方法的基础上,以提高固定化受体活性和稳定性为目标,基于卤代烷烃脱卤素酶与其底物卤代烷之间的特异性脱卤素反应,将Halo标签融合β2-AR和M3R通过一步反应分别定向固定至氨基微球表面制备两种受体色谱固定相。采用扫描电子显微镜表征受体色谱固定相形貌,能谱仪和X射线光电子能谱分析仪表征其元素组成;特布他林、甲氧那明和班布特罗三种配体色谱保留行为表征固定化β2-AR的配体识别活性和稳定性;阿托品、达非那新和毛果芸香碱三种配体色谱保留行为表征固定化M3R的配体识别活性和稳定性。结果表明,与随意固定化方法相比,所建立的一步固定化方法能显着提高受体的配体识别活性和稳定性,具有特异性更高的优点,固定化受体能依据配体的保留行为差异识别其特异性配体,为高活性中药成分筛选提供了方法。2、明确定向固定化β2-AR及M3R可用于评价配体与受体的相互作用。采用直接进样法、非线性色谱法研究配体与固定化β2-AR和M3R的相互作用,评价配体与受体相互作用强度;分子对接技术探讨其作用机制。结果显示,直接进样法测得特布他林、甲氧那明和班布特罗与β2-AR结合常数分别为1.51×104、1.23×104和1.93×104 L/mol,非线性色谱法测得三种配体与受体的结合常数分别为1.08?104、0.34?104和7.85?104 L/mol;两种方法测得阿托品、达非那新、毛果芸香碱与M3R的结合常数分别为0.28×105、1.92×105、1.19×105 L/mol,3.49?104、28.70?104、5.24?104 L/mol,上述结合常数的大小顺序与文献药物受体亲和力大小顺序一致:班布特罗>特布他林>甲氧那明;三种配体与β2-AR相互作用的主要氨基酸残基分别为Asn 312,Ser 203,Phe 193、Asn 312等;阿托品、达非那新、毛果芸香碱与M3R相互作用的主要氨基酸残基分别为Asn 152,Trp 192,Ala 235、Asn 507等,氢键和疏水作用为配体与β2-AR和M3R相互作用的主要推动力。上述研究为采用受体色谱法评价药物与β2-AR和M3R相互作用强度及机制提供了方法,有望为其它药物-受体相互作用快速评价提供借鉴。3、建立了罗汉果β2-AR及M3R靶向平喘活性成分筛选及快速评价方法。采用固定化β2-AR和M3R色谱对罗汉果提取液进行分析,收集保留成分,液相色谱多级质谱法鉴定其结构;直接进样法和非线性色谱法研究保留成分与β2-AR和M3R色谱的相互作用,评价其与β2-AR和M3R的相互作用活性;分子对接技术、离体气管实验探讨其作用机制。结果显示,11-O-罗汉果苷V为M3R靶向成分,罗汉果苷V为同时作用于β2-AR和M3R的活性成分;直接进样法、非线性色谱法测得罗汉果苷V与β2-AR的结合常数分别为8.21×104和1.60×104 L/mol,与M3R的结合常数分别为2.10×104和2.00×104 L/mol,罗汉果苷V与β2-AR及M3R发生相互作用的主要氨基酸残基分别为Thr 110、Thr 195和Ala 237、Leu 198等,为中药β2-AR和M3R靶向成分筛选提供了依据,能为中药其它受体靶向活性成分的筛选和快速活性评价提供方法学参考。4、明确罗汉果苷Ⅴ具有显着的平喘作用。制备哮喘小鼠模型,通过测定炎症细胞因子含量及观察肺组织形态学变化评价罗汉果苷Ⅴ的平喘作用;选择离子对质谱法研究罗汉果苷Ⅴ药代动力学行为,评价罗汉果苷Ⅴ的药代动力学特征。结果显示,罗汉果提取液、罗汉果苷Ⅴ、11-O-罗汉果苷Ⅴ、复合中剂量及高剂量均可降低哮喘小鼠IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、Ig E、OVA-Ig E、Ig G1水平,上调IFN-γ水平,纠正Th1和Th2的平衡,缓解哮喘模型小鼠气道炎症,减轻哮喘小鼠肺部炎性浸润情况,改善哮喘小鼠的肺组织形态,其中复合高剂量组效果最为明显,炎症细胞因子水平与正常组无统计学差异,肺组织形态与正常组相似;大鼠体内,罗汉果苷V在大鼠体内45 min达峰,吸收快、消除慢,表明罗汉果苷Ⅴ成药性良好。上述结果为明确罗汉果平喘功效物质提供了依据,对基于罗汉果苷V的中药创新药物研发具有积极意义。
王胜[3]（2021）在《双结构域双功能果胶甲酯酶/多聚半乳糖醛酸酶协同催化果胶的分子机制研究》文中进行了进一步梳理果胶是一类复杂的酸性杂多糖,广泛存在于高等植物的细胞壁中。果胶酶作为一类特异水解果胶底物的混合酶,广泛用于果汁澄清等众多工业中。根据作用底物方式的不同,可将其分为酯酶和解聚酶两大类。果胶甲酯酶作用于甲酯化的果胶底物,催化甲氧酯产生果胶酸和甲醇。多聚半乳糖醛酸酶则作用于多聚半乳糖醛酸链的α-1,4-D-糖苷键,产生单个或寡聚的半乳糖醛酸。对于双功能果胶酶高效协同降解果胶多糖的分子机制研究,将不仅加深双功能酶协同降解果胶的规律性认知,更为果胶酶的准确应用以及理性设计高效的双功能果胶酶提供坚实的科学依据。本研究以一个新颖的真菌斜卧青霉Penicillium oxalicum SX6来源的双结构域双功能果胶甲酯酶/多聚半乳糖醛酸酶S6A为核心材料,首先研究了N端结构域果胶甲酯酶S6PE的催化机理。基于已报道晶体结构信息,采用分子置换技术获得了S6PE与十糖底物的复合物结构模型,针对催化通道中与底物结合相关的残基进行统计分析,并对关键氨基酸位点进行功能验证。结果表明,催化通道内的位点（Q156、V199、F203、Q205、R261、W263、R264、W288和D124）共同维持底物分子的正确活性构象。基于关键氨基酸残基与底物分子间的相互作用网络分析,进一步确定了S6PE的底物特异性催化机理:-3到-1位糖环偏好侧链不带任何修饰的半乳糖醛酸分子,+1到+3位糖环偏好侧链带甲酯化修饰的半乳糖醛酸分子。然后,采用类似的策略研究了双功能酶S6A的C端结构域多聚半乳糖醛酸酶S6PG的催化机理。采用分子对接技术获得了S6PG与四糖底物Gal A4的复合物结构模型,并针对S6PG中与底物结合相关的氨基酸进行功能验证。结果表明,S6PG对于侧链不带任何修饰的果胶底物具有严格偏好性。位于+1,-2和-3位糖环Gal A羧基分别由R666、K668、H633、Y701、H551、S618和S595等氨基酸固定,将其分别突变成丙氨酸后酶活性大幅度降低或丧失,说明底物羧基基团的识别主要由上述氨基酸来实现。此外,底物上的羟基基团与关键氨基酸形成氢键网络,维持了糖环在催化过程中的构象稳定性。最后,对双功能酶S6A中S6PE和S6PG协同水解果胶分子的机制展开了研究。果胶甲酯酶S6PE作为果胶降解的限速酶,当其与S6PG组合时还原糖的产量较S6PG单独作用提高了5倍。双功能酶S6A中S6PE与S6PG同时作用于果胶底物,以分子内协同相互作用的方式极大的提高了果胶的水解效率,在第120 min时体系中总还原糖的量是S6PE与S6PG以1:1组合的1.6倍。以5 mg/m L的粗柑橘皮和苹果渣果胶为底物,双功能酶S6A所产还原糖的量分别为7,400和7,600μM,水解终产物为单糖、二糖和三糖以及末端带有一个甲酯化修饰的三糖和四糖,为食品加工副产物再利用提供了理论依据。
冷继雄[4]（2021）在《基于细胞工程改造哺乳动物细胞生产杂合型N-聚糖》文中指出蛋白质N-糖基化修饰是真核生物中最常见的翻译后修饰之一,其影响着蛋白质的结构和功能,包括蛋白质的折叠、分子识别、稳定性以及免疫原性等。然而,在哺乳动物细胞中表达生产重组蛋白仍然面临着一些难题。其中最主要问题是重组蛋白上N-聚糖的异质性,这会对重组蛋白的功能和稳定性产生不利影响,如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用以及重组蛋白在体内的半衰期等。目前,随着基因编辑技术,细胞工程以及糖工程等多门学科的发展,可针对蛋白质糖基化位点和其上修饰的聚糖结构进行改造,来减少甚至消除N-聚糖的异质性,进而改善重组蛋白的特性。因此,构建适用于生产均一糖基化修饰重组蛋白的哺乳动物细胞表达系统已成为生物药物行业的研究热门。本研究的主要结果如下:1.基于CRISPR Cas9基因编辑技术在人胚肾细胞293（HEK293）内首先敲除N-糖基化途径中高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ（MAN2A1/A2）,阻断复杂型N-聚糖的合成,得到双基因敲除细胞株M2D-KO。随后进一步敲除α1,6-岩藻糖基转移酶（FUT8）去除核心岩藻糖修饰,最终得到三基因敲除细胞株DF-KO。2.通过凝集素染色和细胞膜N-聚糖质谱分析技术鉴定敲除细胞株细胞膜上N-聚糖结构,结果表明两株敲除细胞均无法合成复杂型N-聚糖。双基因敲除细胞株M2D-KO细胞膜上N-聚糖以含有核心岩藻糖修饰的杂合型N-聚糖为主,而三基因敲除细胞株DF-KO细胞膜上N-聚糖以不含有核心岩藻糖修饰的杂合型N-聚糖为主。随后在两株敲除细胞株内表达分泌型重组蛋白溶酶体酸性脂肪酶（lysosomal acid lipase A,LIPA）和Fc。两种重组蛋白经纯化后,使用外切糖苷酶处理和质谱分析技术鉴定其N-糖基化修饰,结果显示M2D-KO和DF-KO细胞株表达的重组蛋白上N-聚糖分布与其细胞膜上的基本一致。3.为进一步降低DF-KO细胞株中高甘露糖型的水平,本研究分别通过在DF-KO细胞株中过表达编码曲霉Aspergillus saitoi菌株以及人源的α1,2-甘露糖苷酶的基因MsdS和MAN1A2。质谱结果显示过表达编码人源的α1,2-甘露糖苷酶基因MAN1A2降低了细胞中高甘露糖型的表达。因此,本研究成功构建了表达均一杂合型N-聚糖修饰的细胞株,为工业生产医药糖蛋白或重组蛋白提供了理论基础。
张华新[5]（2021）在《蛋白质与药物及硅基材料的相互作用及应用研究》文中提出蛋白质是人体细胞和组织的重要组分,是生命活动的物质基础。血液中约一半的蛋白质是白蛋白,其与药物分子及各种生物医用材料的相互作用是生物物理化学的重要研究内容之一,对于评价药物及材料的性能、生物相容性等至关重要。本论文通过系统研究血清白蛋白与药物分子及不同维度硅基材料（包括硅量子点、介孔二氧化硅纳米棒、多级孔分子筛微球等）之间的相互作用,为蛋白质主-客体化学在药物设计、药物传递、蛋白质分离、酶固定化等方面的应用提供了基础数据和理论参考。论文具体内容如下:第1章,概述了课题的研究背景。第2章,采用多重光谱及分子对接技术,研究了人血清白蛋白（HSA）对拉米夫定（3TC）、隐丹参酮（CTSO）、次黄嘌呤核苷（HXR）等3种不同类型药物的分子识别作用。测定了不同温度下药物与HSA作用的平衡常数、热力学参数、结合位点数、相互作用力等;采用荧光探针技术确定了药物分子在HSA中的结合位点;利用同步发射和圆二色谱技术分析了药物对HSA二级结构造成的影响;通过分子对接模拟了药物-蛋白复合物的结构。第3章,由2-氨基苯并噻唑（ABT）制备了N-2-苯并噻唑基甲酰胺（MABT）,并通过光谱、分子模拟和密度泛函理论（DFT）计算,系统地研究和比较了ABT和MABT与蛋白的作用机理、作用热力学和几何特征。通过DFT计算初步解释了ABT和MABT与蛋白之间能量转移效率的差异。揭示了氨基甲酰化对苯并噻唑衍生物蛋白亲合性的影响,为2位N原子取代的苯并噻唑类药物及农药的设计提供了一定的依据。第4章,在不添加还原剂或催化剂的条件下,通过水热法合成了氨基功能化的蓝光硅量子点（Si QDs）。通过XRD,TEM,XPS,IR,UV,TG,表面电位,荧光寿命,三维荧光、圆二色谱、分子表面模拟和细胞试验等讨论了其结构特征、光学性质、蛋白结合及细胞成像性质。结果表明Si QDs与HSA通过氢键结合,蛋白结合对Si QDs的荧光寿命没有明显影响;Si QDs细胞毒性小,可用于细胞荧光成像。第5章,将内源性蛋白HSA连接到两性离子修饰的介孔二氧化硅纳米棒（MSNR）表面构建了p H敏感型药物传递系统,并测定了其在含蛋白的介质中的释放行为。两性离子有效改善了MSNR的分散性和稳定性,并抑制了其对蛋白质的非特异性吸附,苯甲酰亚胺键实现了释放过程的p H响应。以3TC为模型药物,利用紫外光谱及同步荧光猝灭光谱,分别测定了其在不含蛋白和含有蛋白的模拟体液中的释放过程。结果表明,真实体液中的蛋白质会改变载体的药物释放行为,蛋白“门控”可以有效减少药物提前释放,并改善材料的生物相容性。第6章,研究了MWW纳米片层构建的多级孔分子筛微球（HSZ-Cal）及其功能化衍生物（HSZ-OH、HSZ-NH2和HSZ-CHO）与白蛋白BSA的相互作用。由于纳米片表面独特的十二元杯状开口,纳米片层交错生长形成的高外比表面以及有利于大分子扩散的堆积介孔和大孔,HSZ材料比普通微孔沸石具有更高的BSA负载量,且其对BSA的组装和释放性质可通过表面官能团调节。从表面性质、作用力和热力学等角度分析了HSZ对蛋白的组装机理。最后,尝试了将HSZ-NH2应用于辣根过氧化物酶的固定化。第7章,结论与展望。
王舒越[6]（2020）在《人血浆及其外泌体组分的糖基化蛋白质组学研究》文中研究说明蛋白质糖基化是生命体最重要的翻译后修饰之一,糖蛋白几乎参与了所有重要的生命过程。蛋白质糖基化主要常见的类型有N-糖基化和O-糖基化。糖基化的修饰情况与蛋白质本身和外部客观环境紧密相关,本论文致力于发展不同生物样本的糖基化修饰分析方法,针对血浆中的唾液酸化糖肽、内源性糖基化肽段以及尿液外泌体的提取、富集及鉴定等问题展开工作,实现了对血清唾液酸糖肽的特异性富集鉴定、血浆内源性完整N/O-糖基化肽段首次大规模鉴定分析,建立了尿液外泌体与血浆外泌体蛋白之间的相关性,并将其应用于临床肝癌患者的样品分析。针对血清中唾液酸糖基化修饰丰度低和富集特异性低的问题,我们发展了一种多组氨酸修饰的聚合物微球,利用其具有的静电作用、亲水作用以及多组氨酸之间的协同作用,可以实现对唾液酸糖基化肽段的特异性富集,并成功从4mL人源血清样品中富集到510条完整糖基化肽段,其中唾液酸化糖基化肽段的特异性高达94.7%,实现了复杂生物样本中唾液酸糖基化修饰的特异性富集和分析。针对人源血清中的内源性糖基化肽段的低丰度以及难鉴定的问题,我们发展了一种利用酸热和超滤的方法提取内源性肽段,再利用亲水相互作用实现对糖基化肽段的高效富集。并利用“twin spectra scheme”和理论去糖的策略,分别实现对非特异性酶切的223条内源性完整N-糖基化肽段和51条内源性完整O-糖基化肽段的有效鉴定。实现了对血清样品中的内源性完整N-糖基化肽段和内源性完整O-糖基化肽段的首次分析。利用定量蛋白质组学技术,建立人源尿液和血浆的外泌体蛋白表达上的相关性,结合临床上肝癌患者的尿液和血浆,获得肝癌患者尿液和血浆外泌体中发生上调和下调的蛋白,通过比对不同来源生物样本之间的差异变化,共获得67个蛋白在尿液和血浆外泌体之间存在明显差异,并且具有相同或相反的丰度变化,其中包括如可调控肝癌细胞中癌基因c-Myc表达的激酶LYN,充分说明尿液外泌体蛋白与血浆外泌体蛋白之间确实存在一种相关性,为肝癌甚至其他疾病的检测诊断提供新思路。同时,利用定量糖基化蛋白质组学技术,进一步对肝癌患者尿液外泌体糖基化进行定量分析,从具有差异的完整糖肽的角度在患者尿液外泌体糖蛋白中得到81个表达量上调和103个表达量下调的完整糖肽,共计对应90个差异糖蛋白,其中39个糖蛋白在全蛋白定量分析时均不具有显着性差异。因此,我们利用糖基化蛋白质组定量分析,为全蛋白组定量数据进行了补充,也为肝癌患者的临床诊断和机制探究提供更多的理论支撑。综上,本文根据不同生物样品的特征,发展了针对不同生物样品蛋白质组和糖基化蛋白质组研究的方法。实验证明,利用唾液酸糖肽带负电荷的特征,发展了多组氨酸修饰微球MHM实现了对血清中唾液酸糖肽的特异性富集;利用内源性糖肽的低分子量特征,发展了将酸热变性和超滤集成为一体的提取方法,并利用“twin spectra scheme”和理论去糖策略实现内源性糖肽的有效鉴定;利用外泌体的亲脂性,采用EVTRAP磁珠建立肝癌患者尿液和血浆之间的外泌体蛋白质组的相关性,并采用定量糖基化蛋白质组技术从完整糖肽的角度进一步补充分析。这些针对不同生物样品的蛋白质组和糖基化蛋白质组研究策略,从蛋白质组学的角度为临床疾病的发生发展提供更多方法和数据支撑。
仇红燕[7]（2020）在《定量糖组学揭示人血清白蛋白非酶糖基化影响不同抗凝药在糖尿病中的药效》文中提出糖尿病是由不同发病机制和病因引起的体内胰岛素绝对或相对不足,从而导致糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱,并以严重高血糖为主要临床表现的代谢性疾病。尽管现代医疗技术已在糖尿病的诊断和治疗中取得了很大进步,但糖尿病及其并发症的发病率在世界范围内仍然仅次于心脑血管疾病和肿瘤。随着国民生活水平的提高,糖尿病的发病率也呈现上升趋势。流行病学调查显示,2017年全球糖尿病患者人数为4.25亿,预计到2045年将突破6.29亿。仅在中国,20-79岁的成人糖尿病患者就有1.14亿,位居世界第一。糖尿病引发的心脑血管疾病是导致患者死亡的主要原因,因此对糖尿病的早期诊断、病程监测及其干预治疗显得十分重要。糖尿病患者血液中葡萄糖浓度的异常升高使得人体内蛋白质在没有糖基转移酶参与的情况下与葡萄糖发生一种名为非酶糖基化的反应,此反应是引起糖尿病以及相关并发症的始动因素。人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）是血浆中的高丰度蛋白,主要负责结合及运输各类药物,对多种药物的药代动力学特性及药效发挥有着深远影响。糖尿病患者的高血糖使HSA发生非酶糖基化的概率比其它蛋白高,较高水平的非酶糖基化修饰不仅会导致HSA结构和功能发生改变,而且对于机体的正常生理活动也将产生严重的影响。HSA上多个非酶糖基化位点在其三维结构上的不同分布,使得它们在不同葡萄糖浓度水平下发生非酶糖基化的程度也有所差异。位于主要药物结合区域位点的非酶糖基化修饰,将显着影响此区域结合药物的能力,从而影响药物的药代动力学特性和药效。糖尿病患者心脑血管疾病的发生率远远高于正常人群,因此使用抗凝药物的几率也大于非糖尿病患者。华法林和肝素是临床抗凝治疗中常用的两种抗凝药,如果使用不当则会引起严重的出血等副反应,因此需要严格检测相关指标。为了解糖尿病患者中HSA非酶糖基化对这两种抗凝药物的结合、运输及药效变化影响,我们有必要从早期HSA非酶糖基化产物入手,通过对其非酶糖基化位点的定性、定量以及功能变化研究,了解HSA非酶糖基化在临床抗凝给药治疗中的作用及意义。本论文利用液相色谱与质谱联用技术,定性和定量分析了健康受试者与糖尿病患者的血浆样本中HSA非酶糖基化位点。同时在体外和体内分别研究了 HSA的非酶糖基化对抗凝药物（华法林和肝素）的结合、药代动力学特性及药效的影响。以计算机模拟对接结合氨基酸突变技术为辅助工具,了解特定位点的非酶糖基化对整个HSA结合药物的影响。本论文更加全面地鉴定了 HSA的非酶糖基化位点,并将同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）技术与三级质谱相结合,建立了准确而又高通量的非酶糖基化位点定量方法。随后在体外和体内均证明糖尿病HSA非酶糖基化对华法林的药效改变产生影响。本论文研究成果,有助于加深我们对糖尿病及其并发症的发病机理了解,并且为糖尿病的临床早期诊断与指导用药提供有力的理论依据。本论文的主要研究成果如下:1.定性比较糖尿病及健康受试者血浆中HSA非酶糖基化位点应用纳升液相色谱与多级质谱联用技术（nano-liquid chromatography multi-stage mass spectrometry,nLC-MSn）的高效分离效果与高分辨率,对健康组与糖尿病组HSA非酶糖基化位点进行定性分析。共鉴定到49个HSA非酶糖基化位点,其中7个位点为首次鉴定。健康组和糖尿病组分别鉴定到40和47个非酶糖基化修饰位点。相比于健康组,糖尿病组非酶糖基化位点数目较多,这与糖尿病患者的高血糖有必然联系。通过探讨HSA非酶糖基化位点在其三维结构上的分布,发现大部分位点均分布在HSA三维结构表面,并且靠近于碱性氨基酸。本论文中鉴定到的非酶糖基化位点,较目前报道的位点更全面,丰富了对现有体内非酶糖基化位点的报道,并扩展了我们对糖尿病及其并发症发生发展的进一步认识。2.定量比较糖尿病及健康受试者血浆中HSA的非酶糖基化位点应用iTRAQ标记技术的高通量,结合纳升液相色谱与三级质谱联用技术（nLC-MS3）的高分辨率和高准确度,对健康组与糖尿病组HSA非酶糖基化位点进行定量分析。该部分首次将iTRAQ标记技术、硼酸盐亲和色谱和三级质谱法相结合,建立了一种新的非酶糖基化肽段定量方法。共定量到21个非酶糖基化位点,其中19个位点在糖尿病组与健康组之间具有显着性差异（p<0.05）。7个位点位于HSA主要药物结合区域Subdomains ⅡA和ⅢA,因此推测这些位点在糖尿病患者体内的异常非酶糖基化,将导致HSA药物结合功能改变。K199肽段的非酶糖基化变化程度最为显着（p<0.01）,进一步采用高灵敏的nLC-MS/MS-多反应监测模式（multiple reaction monitoring,MRM）验证后,发现其非酶糖基化变化趋势与iTRAQ-nLC-MS3中的一致,且仍具有极显着差异（p<0.0001）。进一步说明K199对血糖浓度的变化比其它位点更敏感,故糖化K199肽段可作为临床糖尿病诊断的候选预警标志物。从空间分布看,位点K199不仅位于药物结合区域Subdomains ⅡA,而且临近于Subdomains ⅢA,因此K199的非酶糖基化可能对糖尿病患者的药物转运和疗效有重要影响,这为研究糖尿病HSA药物运输功能的改变提供进一步研究方向。3.K199非酶糖基化修饰对HSA结合抗凝药物的影响以定量结果中差异最显着的位点K199为主要研究对象,采用模拟对接技术研究了 K199非酶糖基化对HSA结合抗凝药华法林和肝素的影响。结果表明K199非酶糖基化对于华法林的亲和力增加了近两倍,而对于肝素结合并没有显着影响。考虑到除K199外,其他位于或者靠近HSA药物结合区域位点的非酶糖基化也会影响华法林的结合。我们将模拟对接技术与nLC-MS/MS-MRM定量技术相结合,比较了位于或靠近于药物结合区域位点的非酶糖基化对华法林结合的贡献,发现K199的非酶糖基化是引起华法林结合改变的主要原因。PCR突变技术被用来进一步验证K199位点的非酶糖基化对华法林结合的影响,结果表明HSA（K199M）是否发生糖化对华法林的结合并无显着影响。原因是HSA（K199M）的K199位点突变为M后,此位点将不会发生非酶糖基化修饰,而HSA（K199M）上除K199外其他位点的非酶糖基化修饰对华法林的结合影响不大。相反,位点K199非酶糖基化对糖尿病患者与华法林结合亲和力的增加贡献最大。本章证明了 K199非酶糖基化在HSA结合不同抗凝药中的作用,为研究非酶糖基化对糖尿病患者体内抗凝药物分配的影响提供了理论指导。4.HSA非酶糖基化对抗凝药物结合和运输的影响采用超滤与LC-MS/MS-MRM技术相结合,体外和体内研究了 HSA非酶糖基化对华法林和依诺肝素钠结合的影响。首次建立了基于超滤和2-氨基吖啶酮（2-aminoacridone,AMAC）标记技术的肝素类多糖药物在血浆中的分析方法。将糖尿病与健康受试者新鲜血浆分别与抗凝药物华法林和依诺肝素钠进行体外孵育,测定游离药物浓度。糖尿病患者血浆中游离华法林浓度相对于健康组明显减少（p<0.005）,而对于游离依诺肝素钠则没有显着性差异（p=0.17）。说明糖尿病中非酶糖基化HSA对华法林的结合作用增强,而对依诺肝素的结合没有影响。为在体内验证以上结果,选择模型糖尿病大鼠进行给药,通过测定血浆中各时间点游离华法林与依诺肝素钠浓度,比较两种抗凝药在正常和糖尿病大鼠中的药代动力学特性变化。结果表明华法林在糖尿病大鼠体内的游离药物浓度曲线不同于正常大鼠,在给药8小时后游离华法林浓度明显低于正常组。相比之下,依诺肝素钠在两组之间并没有显着性差异。进一步证实了糖尿病患者体内非酶糖基化白蛋白与华法林结合增强,导致游离华法林的量减少。在药物药效发挥过程中只有游离药物分子具有药理学作用,因此HSA对药物分子的结合力将决定游离药物分子水平,进而影响药效。考虑到心脑血管疾病在糖尿病患者中的高发性,华法林在临床上糖尿病患者的抗凝药效也可能受到影响。本实验研究结果将为糖尿病合并心脑血管疾病患者的临床抗凝药物选择提供一定的参考,并对华法林给药治疗的药效变化进行了预估。此外,本实验建立的血浆中的依诺肝素钠分析方法,将为分析动物疾病模型或临床样本中的多糖药物提供有价值的参考。5.糖尿病患者抗凝药物疗效的初步临床回顾性研究为评估非酶糖基化修饰对糖尿病患者抗凝药物的疗效影响,进行了一项包括53名受试者的初步临床回顾性研究。对使用华法林和肝素的糖尿病和非糖尿病患者进行比较,发现糖尿病患者服用华法林后24 h的国际标准化比值（international normalized ratio,INR）和服用前后INR差值均显着小于非糖尿病患者（p<0.05）,而使用肝素后的INR 24 h与INR差值均与非糖尿病患者之间无显着性差异（p>0.05）。服用华法林后糖尿病患者INR值降低,说明糖尿病患者的血浆中游离华法林浓度降低进而降低药效,使糖尿病患者更容易凝血。加之糖尿病患者本身处于高凝状态,因此服用华法林需要时刻调整和密切关注INR值。此外,结合华法林对糖尿病和非糖尿病大鼠的药代动力学行为差异的事实,临床上对心脑血管疾病合并糖尿病患者使用华法林作为抗凝药物时必须格外谨慎。从糖尿病患者和非糖尿病患者的药物等效性来说,肝素相对于华法林更安全有效。本实验为糖尿病患者使用特定抗凝药物治疗的安全与风险做出了评估,同时为临床糖尿病抗凝药指导用药提供了参考价值。
黎晓[8]（2019）在《基于铁蛋白笼的金属配合物药物输送研究》文中提出功能性金属配合物和金属药物越来越广泛地应用到生物医药领域,但也存在生物相容性差和无靶向性等现实问题。铁蛋白作为一种普遍存在于生物体中维持体内环境铁平衡的金属结合性功能蛋白,在药物靶向递送领域具有重要研究意义。本文探究了去铁蛋白对不同类型的功能性金属配合物和金属药物的有效包载方法,考察了这些蛋白纳米颗粒在细胞摄取、细胞成像和癌症治疗中的潜在应用价值。本论文的内容主要分为以下四个部分:第一部分:制备了亲疏水性不同的三种钌配合物,载入去铁蛋白形成钌-去铁蛋白复合物,并递送至细胞内进行光学成像。为防止钌配合物诱导的聚集体的形成,在有机溶剂存在条件下实现了去铁蛋白对一系列钌配合物的包载,而且包载量随钌配合物疏水性的增加而提高。具有dppz配体的钌配合物（Ru-dppz）的“光开关”效应揭示了去铁蛋白内腔的疏水环境。钌蛋白复合物在水溶液中表现出规整的颗粒形状和优良的稳定性。升高温度能够触发钌配合物的释放,比如在37℃,钌复合物从去铁蛋白内释放的半衰期（t1/2）约6小时。细胞活性测试结果表明,去铁蛋白包载后的钌配合物非特异性毒性显着降低。在铁蛋白表面修饰叶酸配体进一步增强钌蛋白复合物的肿瘤靶向能力和细胞摄取效率。上述钌配合物的递送方法解决了疏水性金属配合物水溶性低和生物相容性差等问题,有利于扩展铁蛋白笼在生物医学领域中的应用。第二部分:罗森黑盐（RBS）是一种对水和光敏感的一氧化氮（NO）供体,本部分工作通过在去铁蛋白中高载入量结合RBS构建了 一种光控NO释放体系。去铁蛋白是铁储存蛋白,铁配合物与去铁蛋白,特别是去铁蛋白内腔,具有很好的结合亲和力。去铁蛋白宽敞的空腔中能够容纳大量RBS分子,通过屏蔽RBS与水接触而显着提高Fe-NO配位键的稳定性,在低光照水平的水溶液或细胞中均可保持NO的光敏感性,并使细胞光毒性受光通量的调控。为了增强递送系统对长波长区域的光敏感性,进一步将金属卟啉配合物ZnPPIX与RBS共包载到去铁蛋白笼中,锌卟啉作为能量供体将吸收的能量转移至RBS并诱导Fe-NO键的解离。由此可通过580 nm光激发多组分纳米复合物实现NO的释放,扩大了RBS在可见光区域的光控释放范围。这是一种简单有效的递送系统,有望用于光控释放气体信号分子的研究。第三部分:3-甲基-（三嗪-1-）咪唑-4-甲酰胺（MTIC）是替莫唑胺降解的高活性中间体,也是很强的核酸甲基化试剂,我们使用铜离子与MTIC形成金属配合物的方法,在溶液以及去铁蛋白中实现MTIC的稳定化以及可控释放。作为治疗胶质母细胞瘤（GBM）的一线化疗药物,替莫唑胺在碱性pH下快速水解、被广泛用作MTIC的前药。然而,在大多数情况的生理pH条件下,替莫唑胺转化为MTIC是缓慢且低效的,这限制了替莫唑胺在其他疾病治疗中的应用。在本研究中,我们发现MTIC能选择性地与铜离子发生配位作用并形成在生理pH的水溶液中稳定存在的新型金属药物Cu-MTIC。有趣的是,该金属药物在蛋白环境的保护下于弱酸性和碱性条件下都具有优良的稳定性,同时可以被细胞中最为丰富的内源性硫醇物质谷胱甘肽选择性激活。此外,通过配位相互作用可在去铁蛋白中原位地生成金属药物Cu-MTIC而构建MTIC递送体系,该体系具有高负载效率（～92.9%）和高包载量（每分子去铁蛋白包载185个MTIC）等优点。并且,该递送系统可以诱导替莫唑胺敏感性和耐药性肿瘤细胞的凋亡,IC50值显着降低;更重要的是,活体实验结果表明其具有低肝代谢毒性、增强的肿瘤积累能力和抗癌作用。该体系在解决替莫唑胺耐药性问题和提高GBM治疗效果方面具有潜在的应用价值。第四部分:利用去铁蛋白的铜结合能力,将去铁蛋白作为铜离子与双硫仑分解产物（二乙基二硫代氨基甲酸酯,DTC）以1:2计量比形成的配合物CuET的载体,用于DTC的抗肿瘤研究。双硫仑是众所周知的戒酒药,因其与铜离子结合后的优异抗癌作用而进入大量的临床试验研究。CuET在谷胱甘肽、半胱氨酸或者过氧化氢等内源性活性分子存在下表现出优异的氧化还原稳定性。然而,CuET存在水溶性差、因缺乏靶向能力引发非特异性毒性等问题,限制了其作为药物直接应用。我们系统表征了 CuET载入去铁蛋白形成的纳米复合物的结构,发现极低浓度的复合物即可诱导多种恶性细胞凋亡。此外,通过铜的配位作用,去铁蛋白可对阿霉素和DTC进行共包载（包载效率>97%）,体系中的Dox可通过GSH响应性释放,进一步增强体系的抗肿瘤效果。上述对基于去铁蛋白的递送体系的研究为金属配合物的靶向递送以及联合治疗提供了坚实的基础。
李丽敏[9]（2019）在《肝病血清结合珠蛋白O-糖基化修饰的研究及临床意义》文中研究表明糖基化是一种功能多样、形式复杂的蛋白质翻译后修饰,其在细胞黏附,分子运输和清除,受体激活,信号转导,恶性肿瘤的发生和转移等过程中发挥重要作用。糖基化异质性又对肿瘤显着响应,变化迅速,预示着糖链/糖蛋白标志物具有巨大的潜力。结合珠蛋白（Haptoglobin,Hp）是我们早期运用传统的双向电泳技术在肝病血清中发现的重要差异糖蛋白,并对其N-糖基化修饰进行了详细的研究:发现其Asn241糖基化位点的占有率和整体岩藻糖基化聚糖含量在肝癌患者血清中显着升高,表明Hp作为聚糖标志物在肝癌的诊断中具有潜在应用价值;而其O-糖基化修饰却罕见报道。本研究通过抗体亲和层析的方法纯化健康对照者、肝硬化患者和肝癌患者血清Hp,采用超高分辨质谱Fusion Orbitrap鉴定其O-完整糖肽,包括O-糖基化位点和结构信息;联合凝集素亲和印迹确认肝病中Hp的O-糖基化修饰的存在。由于糖蛋白聚糖的结构特征及其动态变化与其功能和疾病病程息息相关,鉴定和确认肝病血清中Hp的O-糖基化修饰对完整揭示其糖基化修饰参与的生物学功能和挖掘潜在临床应用价值尤为重要。第一部分肝病血清结合珠蛋白的O-完整糖肽鉴定本部分研究旨在鉴定肝病患者血清Hp的O-完整糖肽。利用抗体亲和层析纯化健康对照、肝硬化和肝癌血清Hp,SDS-PAGE电泳分离Hp的亚基,PNGase F酶解切除N-糖,采用超高分辨质谱Fusion Orbitrap联合Byonic软件,鉴定其O-完整糖肽,获得位点特异的O-聚糖结构信息。质谱结果发现,健康对照者,肝硬化和肝癌患者血清中纯化的Hp均鉴定到O-完整糖肽:HYEGST316/317VPEKK的Ser/Thr上存在O-糖基化位点,糖链结构组成为H1N1S1;肝硬化血清Hp中鉴定到HYEGST316/317VPEKK的Ser/Thr上存在另一种糖链结构组成H1N1S2。结果表明,血清Hp存在O-糖基化修饰,并且在不同的肝病中,鉴定到的O-完整糖肽存在差异。确认肝病中Hp的O-糖基化修饰对完整揭示其糖基化修饰参与的生物学功能和挖掘潜在临床应用价值尤为重要。第二部分肝病血清结合珠蛋白的凝集素亲和印迹本部分的研究旨在验证血清Hp存在O-糖基化修饰。利用抗体亲和层析纯化肝硬化和肝癌患者血清Hp,选取亲和O-聚糖结构的凝集素Jacalin、GSL-I、VVA、ACA和WFA进行凝集素亲和印迹。凝集素亲和印迹结果显示,肝癌患者血清Hp的β链对凝集素Jacalin、GSL-I、VVA、ACA和WFA特异性结合能力显着高于肝硬化患者（P<0.05）;肝癌患者血清Hp的α2链对Jacalin、VVA和ACA特异性结合能力显着高于肝硬化患者（P<0.05）。通过这些凝集素亲和的O-聚糖结构推断,肝癌患者血清Hp中末端GalNAcα-Ser/Thr（Tn 抗原）,Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr（T 抗原）,Sialyl-T（sT 抗原）,GlcNAcβ1-3GalNAcα-Ser/Thr（core 3 型核心结构）,N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）,α半乳糖（α-Gal）,GalNAcαl-3/6Gal 和 GalNAcβ4GlcNAc 结构增加,提示肝癌的发生发展与Hp异常的O-糖基化修饰密切相关。结论1.在健康对照组、肝硬化组和肝癌组血清中纯化的Hp均鉴定到O-完整糖肽:HYEGST316/317VPEKK的Ser/Thr上存在O-糖基化位点,糖链结构组成H1N1S1;肝硬化血清Hp中鉴定到HYEGST316/317VPEKK的Ser/Thr上存在另一种糖链结构组成H1N1S2。2.肝癌患者血清Hp的β链对凝集素Jacalin、GSL-I、VVA、ACA和WFA特异性结合能力显着高于肝硬化患者;肝癌患者血清Hp的α2链对Jacalin、VVA和ACA特异性结合能力显着高于肝硬化患者。创新点鉴定并验证Hp存在O-糖基化修饰,并发现在不同肝病血清Hp中存在异常O-糖基化修饰。潜在临床意义确认肝病中Hp的O-糖基化修饰对完整揭示其糖基化修饰参与的生物学功能和挖掘潜在临床应用价值尤为重要。
刘俊[10]（2018）在《超声波辅助糖基化修饰对蛋白质功能性质的影响及机制初探》文中研究说明食品中蛋白质不仅能够提供人体所必需的营养元素,且能提供不同的食物所需的色泽、气味、状态、口感等,蛋白质的这些作用很大程度上取决于蛋白质的功能特性,加工技术对蛋白质功能性质的影响一直是国内外研究的焦点和热点。超声波可促进蛋白质的糖基化反应,但超声前后的糖基化蛋白质结构与功能性质之间的关系、超声波影响糖基化蛋白质功能性质的机制仍然不清楚。因此,研究超声波辅助糖基化修饰对蛋白质功能性质的影响及其机制,可为实现蛋白质的定向改性提供理论支持和技术指导,对提高加工食品营养性具有重要意义。本文以牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）和α-乳白蛋白（α-Lactalbumin,α-La）为研究对象,采用光谱学、色谱学、质谱学和蛋白质组学等研究方法,对超声波、超声波辅助糖基化修饰处理前后的BSA和α-La结构及功能性质进行测定,分析其改善BSA和α-La功能性质的原因,并从分子水平探索超声波辅助糖基化修饰影响α-La的糖基化特性以及降低α-La致敏性、提高α-La抗氧化能力的内在分子机制,得出以下主要结论:（1）研究不同的超声时间、功率和温度辅助糖基化（半乳糖）修饰对BSA功能性质的影响。结果表明:不同的超声时间、功率和温度辅助糖基化修饰能增加BSA的分子量、降低其内源荧光强度;随超声功率和温度的增加,BSA-半乳糖轭合物的自由氨基酸含量逐渐降低、而接枝度、表面疏水性、乳化能力、热稳定性逐渐升高,随超声时间的延长,其自由氨基酸含量、表面疏水性、乳化能力、热稳定性先增加后减少;此外,随超声功率和时间的增加,BSA-半乳糖轭合物的起泡能力逐渐增加,而随超声温度的升高,其起泡能力先增加后减少;说明超声波预处理辅助糖基化修饰通过改变BSA的结构来改善其功能性质,且不同的超声参数对其功能性质影响较大。（2）研究相同功率的超声波辅助糖基化（互为同分异构体的葡萄糖、半乳糖）修饰对BSA功能性质的影响。结果表明:超声波使BSA的自由氨基酸含量、乳化性和起泡性显着增加;BSA-半乳糖轭合物的分子量、褐变度大于BSA-葡萄糖轭合物的分子量、褐变度,超声波预处理促使其显着增加;BSA-半乳糖轭合物的自由氨基酸含量、内源荧光强度、表面疏水性、乳化性和起泡能力分别低于BSA-葡萄糖轭合物的自由氨基酸含量、内源荧光强度、自由氨基酸含量、内源荧光强度、表面疏水性、乳化性和起泡能力,超声波预处理促使其显着降低;BSA与互为同分异构体的半乳糖、葡萄糖发生糖基化反应,其反应速率为半乳糖>葡萄糖,超声波能显着提高其反应速率;说明超声处理和不同构型的糖均能显着影响蛋白质糖基化反应,能改变蛋白质的结构,进一步改善蛋白质的功能性质。（3）以IgG/IgE结合能力为评价指标研究不同超声功率处理的α-La致敏性的变化,揭示超声波对α-La结构及致敏性的影响。结果表明:超声波处理会使α-La致敏性显着增强,随功率的增加,其致敏性逐渐增强;超声波处理不会改变α-La的分子量、也不易使其发生聚合反应;超声波处理会使α-La发生去折叠,同时增加其表面疏水性和α-螺旋含量;ESI-MS揭示α-La可能含有钙离子、丁二酰赖氨酸、乙酰氨基葡糖、N-乙酰神经氨酸四个组分,而超声波处理能影响它们的相对丰度,这些结构的改变导致了α-La致敏性的显着增加。（4）以抑制性ELISA法检测的IgG/IgE结合能力为指标,评价超声波辅助糖基化修饰处理前后α-La致敏性的变化,运用高分辨质谱技术分析其糖基化位点和数量、每个糖基化肽段的糖基化程度（DSP值）。当超声功率为150 W/cm2时,超声处理α-La-半乳糖混合物后其糖基化位点有7个,且有最高的结合率、DSP值和最低的IgG/IgE结合能力。因此,超声波辅助糖基化修饰降低α-La致敏性的原因主要是通过糖基化位点Lys13、Lys16、Lys58、Lys93和Lys98掩盖α-La的致敏线性表位,和增加α-La的糖基化程度（结合率、糖基化位点和数量、DSP值）。此外,超声波辅助糖基化修饰处理过敏蛋白与单糖的混合物,是一种有效降低α-La致敏性的方法。（5）以ABTS自由基清除能力为指标,评价超声波辅助糖基化修饰处理前后α-La抗氧化能力的变化,并采用高分辨质谱技术分析其结构的变化。结果表明:超声波辅助糖基化修饰能显着降低α-La的内源荧光强度和提高其抗氧化能力;超声波处理会增加α-La糖基化位点,未经超声波处理的α-La有3个糖基化位点发生修饰,而经超声功率60、90、120、150 W/cm2预处理α-La后其糖基化位点分别增加到了4、4、5、6个;超声波处理提高了所有样品的DSP值。因此,超声波辅助糖基化修饰通过改变α-La空间构象、α-La的肽段及增加α-La的糖基化程度等来提高α-La的抗氧化能力。（6）采用不同超声时间处理α-La,处理后的α-La与甘露糖糖基化反应,分析其糖基化特性（分子量、糖基化位点和数量、糖基化肽段的程度等）的变化。结果表明:不同超声时间预处理辅助糖基化修饰能显着改变α-La的分子量、三级结构;不同超声时间0、5、10、15、20 min预处理α-La后其糖基化位点分别为3、4、4、5、5个。超声波处理使所有样品中糖基化肽段的糖基化程度显着增高。因此,不同超声处理时间辅助糖基化修饰能显着影响α-La的糖基化特性,且超声处理时间的延长对其影响较大。
二、半乳糖修饰人血清白蛋白的质谱分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、半乳糖修饰人血清白蛋白的质谱分析（论文提纲范文）
（1）长效化胰高血糖素样肽-1类似物设计、合成及降糖活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 二型糖尿病 |
| 1.1.1 二型糖尿病的定义 |
| 1.1.2 二型糖尿病的发病机制 |
| 1.1.3 二型糖尿病的流行病学 |
| 1.2 GLP-1 多肽药物 |
| 1.2.1 GLP-1和Exendin-4 简介 |
| 1.2.2 GLP-1和Exendin-4 的药理学作用 |
| 1.2.3 GLP-1和Exendin-4 构效关系研究 |
| 1.2.4 GLP-1和Exendin-4在T2DM治疗中的优劣势 |
| 1.3 长效GLP-1 RAs的研究进展 |
| 1.3.1 氨基酸序列改造以及非天然氨基酸的引入 |
| 1.3.2 糖基化修饰 |
| 1.3.3 PEG化修饰 |
| 1.3.4 脂肪酸修饰 |
| 1.3.5 白蛋白修饰 |
| 1.3.6 Fc融合 |
| 1.3.7 缓释给药系统 |
| 1.3.8 口服制剂开发 |
| 1.4 内源性抗体 |
| 1.4.1 内源性抗体简介 |
| 1.4.2 内源性抗体应用 |
| 1.5 本论文的立题依据、研究意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据与研究意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 葡聚糖-Ex4 偶联物的设计、合成和生物活性评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和细胞株 |
| 2.2.2 原料与试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 Ex4 及其类似物的合成 |
| 2.2.6 葡聚糖-Ex4 偶联物的合成 |
| 2.2.7 葡聚糖-Ex4 偶联物的表征 |
| 2.2.8 胞内c AMP含量测定实验 |
| 2.2.9 STZ联合高脂饲料建立二型糖尿病小鼠模型 |
| 2.2.10 腹腔糖耐量实验 |
| 2.2.11 长效降血糖实验 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Ex4、Ex4-12K*、Ex4-27K*以及Ex4-12K*-27K*的制备和表征 |
| 2.3.2 葡聚糖-Ex4 偶联物的制备和表征 |
| 2.3.3 葡聚糖-Ex4 偶联物体外GLP-1R结合能力评价 |
| 2.3.4 葡聚糖-Ex4 偶联物体内急性降血糖能力评价 |
| 2.3.5 葡聚糖-Ex4 偶联物体内长效降血糖能力评价 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 Ex4-DNP偶联物的设计、合成和生物活性评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和细胞株 |
| 3.2.2 原料与试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.2.5 带有Srt A识别信号肽的Ex4 类似物的合成 |
| 3.2.6 Srt A介导的Ex4 类似物与DNP衍生物的偶联反应 |
| 3.2.7 胞内c AMP含量测定实验 |
| 3.2.8 药代动力学实验 |
| 3.2.9 腹腔糖耐量实验 |
| 3.2.10 预免疫前后长效降糖实验 |
| 3.2.11 长期实验 |
| 3.2.12 组织学分析 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 C端带有Srt A酶识别信号肽的Ex4 类似物的制备和表征 |
| 3.3.2 Ex4-DNP偶联物的制备和表征 |
| 3.3.3 Ex4-DNP偶联物体外GLP-1R结合能力评价 |
| 3.3.4 Ex4-DNP偶联物体内半衰期评价 |
| 3.3.5 Ex4-DNP偶联物体内急性降血糖能力评价 |
| 3.3.6 Ex4-DNP偶联物体内长效降血糖能力评价 |
| 3.3.7 长期治疗理化指标和安全性初步评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 Ex4-Lipid-Rha偶联物的设计、合成和生物活性评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和细胞株 |
| 4.2.2 原料与试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要试剂配制 |
| 4.2.5 带有Srt A识别信号肽的Ex4 类似物的合成 |
| 4.2.6 Srt A介导的Ex4 类似物与Lipid-Rha衍生物的偶联反应 |
| 4.2.7 胞内c AMP含量测定实验 |
| 4.2.8 腹腔糖耐量实验 |
| 4.2.9 预免疫前后长效降糖实验 |
| 4.2.10 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 C端带有Srt A识别信号肽Ex4 类似物的制备和表征 |
| 4.3.2 Ex4-Lipid-Rha偶联物的制备和表征 |
| 4.3.3 Ex4-Lipid-Rha偶联物体外GLP-1R结合能力评价 |
| 4.3.4 Ex4-Lipid-Rha偶联物体内急性降血糖能力评价 |
| 4.3.5 Ex4-Lipid-Rha偶联物体内长效降血糖能力评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 新一代GLP-1 RA索玛鲁肽半合成方法开发 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和细胞株 |
| 5.2.2 原料与试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.2.5 水杨醛二甲缩醛(1)的合成 |
| 5.2.6 四肽水杨醛酯(NH_2-HAibEG-SAL,2)的合成 |
| 5.2.7 通过苏氨酸结扎反应进行Aib~8,Arg~(34)GLP-1(7-37)(4)的合成 |
| 5.2.8 Aib~8,Arg~(34)GLP-1(7-37)(4)的二级质谱分析 |
| 5.2.9 侧链活化酯5 的制备 |
| 5.2.10 肽骨架Aib~8,Arg~(34)GLP-1(7-37)的酰化反应 |
| 5.2.11 化合物6 的二级质谱分析 |
| 5.2.12 化合物7 的合成及纯化 |
| 5.2.13 化合物7 的体外生物活性测定 |
| 5.2.14 统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 四肽水杨醛酯(NH_2-HAibEG-SAL,2)的合成 |
| 5.3.2 通过STL连接反应进行Aib~8,Arg~(34)GLP-1(7-37)(4)的合成 |
| 5.3.3 酰化产物6 的合成与制备 |
| 5.3.4 酰化产物6 的脱保护反应 |
| 5.3.5 化合物7 的生物活性测定 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 附图 |
| 附录 Ⅱ 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）罗汉果中两种G蛋白偶联受体靶向活性成分色谱筛选及评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 药物活性成分筛选方法 |
| 1.2.1 以药理作用为导向的活性成分筛选方法 |
| 1.2.2 基于血清药物化学的活性成分筛选方法 |
| 1.2.3 基于计算机辅助虚拟技术的活性成分筛选方法 |
| 1.2.4 基于亲和毛细管电泳的活性成分筛选方法 |
| 1.2.5 基于生物色谱的活性成分筛选方法 |
| 1.3 药物与蛋白相互作用的研究方法 |
| 1.3.1 光谱法 |
| 1.3.2 毛细管电泳技术 |
| 1.3.3 分子对接技术 |
| 1.3.4 亲和色谱法 |
| 1.3.5 受体色谱法 |
| 1.4 哮喘的研究现状 |
| 1.4.1 哮喘的发病机制 |
| 1.4.2 哮喘的诱因 |
| 1.4.3 哮喘的治疗 |
| 1.5 罗汉果简介 |
| 1.5.1 化学成分研究 |
| 1.5.2 药理作用 |
| 1.5.3 毒理作用 |
| 1.5.4 罗汉果平喘成分筛选方法 |
| 1.6 本论文的研究内容和意义 |
| 第二章 定向固定化β_2-AR和 M_3R色谱方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器及试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Halo标签融合β_2-AR、M_3R的诱导表达 |
| 2.3.2 固定化β_2-AR和 M_3R色谱固定相的制备 |
| 2.3.3 固定化β_2-AR和 M_3R色谱柱的制备 |
| 2.3.4 固定化β_2-AR和 M_3R色谱固定相的形态学表征 |
| 2.3.5 固定化β_2-AR和 M_3R色谱柱的特异性表征 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 Halo标签融合β_2-AR、M_3R的表达量及纯度 |
| 2.4.2 固定化β_2-AR和 M_3R色谱固定相的形态学表征 |
| 2.4.3 三种配体β_2-AR色谱保留行为 |
| 2.4.4 三种配体M_3R色谱保留行为 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 固定化β_2-AR和 M_3R在配体-受体相互作用评价中的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.3 理论 |
| 3.3.1 直接进样法 |
| 3.3.2 非线性色谱法 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 三种配体与β_2-AR的相互作用研究 |
| 3.4.2 三种配体与M_3R的相互作用研究 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 三种配体与β_2-AR相互作用的研究 |
| 3.5.2 三种配体与M_3R相互作用的研究 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 固定化β_2-AR和 M_3R在罗汉果受体靶向活性成分筛选中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与试剂 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.3 实验动物 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 HPLC-MS/MS分析罗汉果化学成分 |
| 4.4.2 罗汉果活性成分β_2-AR、M_3R色谱筛选与鉴定 |
| 4.4.3 罗汉果β_2-AR靶向活性成分与β_2-AR相互作用研究 |
| 4.4.4 罗汉果M_3R靶向活性成分与M_3R相互作用研究 |
| 4.4.5 离体气管法研究罗汉果活性成分的舒张作用 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 罗汉果化学成分 |
| 4.5.2 罗汉果活性成分β_2-AR、M_3R色谱筛选与鉴定 |
| 4.5.3 罗汉果靶向β_2-AR活性成分与β_2-AR相互作用研究 |
| 4.5.4 罗汉果靶向M_3R活性成分与M_3R相互作用研究 |
| 4.5.5 离体气管法研究罗汉果活性成分的舒张作用 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 罗汉果靶向活性成分的药效学评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 仪器与试剂 |
| 5.2.1 仪器 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.3 实验动物 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 罗汉果活性成分对OVA诱导的哮喘小鼠模型的影响 |
| 5.4.2 罗汉果苷Ⅴ药代动力学研究 |
| 5.5 结果与讨论 |
| 5.5.1 哮喘小鼠给药剂量的确定 |
| 5.5.2 罗汉果活性成分对OVA诱导的哮喘小鼠模型外观及行为学影响 |
| 5.5.3 罗汉果活性成分对OVA诱导的哮喘小鼠模型的气道炎症的影响 |
| 5.5.4 罗汉果活性成分对OVA诱导的哮喘小鼠模型肺组织病理学的影响 |
| 5.5.5 罗汉果苷Ⅴ药代动力学研究 |
| 5.6 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）双结构域双功能果胶甲酯酶/多聚半乳糖醛酸酶协同催化果胶的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 果胶 |
| 1.1.1 果胶概况 |
| 1.1.2 果胶结构 |
| 1.2 果胶酶 |
| 1.2.1 果胶酶的来源 |
| 1.2.2 果胶酶的分类 |
| 1.3 果胶甲酯酶的研究进展 |
| 1.3.1 果胶甲酯酶的蛋白结构 |
| 1.3.2 果胶甲酯酶的催化机制 |
| 1.3.3 底物结合方式以及底物特异性 |
| 1.4 多聚半乳糖醛酸酶的研究进展 |
| 1.4.1 多聚半乳糖醛酸酶的蛋白结构 |
| 1.4.2 多聚半乳糖醛酸酶的催化域 |
| 1.4.3 多聚半乳糖醛酸酶的催化机制 |
| 1.5 双功能糖苷水解酶研究进展 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 S6A中 N端结构域果胶甲酯酶S6PE的催化机理研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 培养基和试剂的配制 |
| 2.1.3 试剂以及试剂盒 |
| 2.1.4 实验仪器设备 |
| 2.1.5 引物合成以及核酸测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 同源建模 |
| 2.2.2 分子对接 |
| 2.2.3 N端结构域果胶甲酯酶S6PE的定点突变 |
| 2.2.4 果胶甲酯酶S6PE及其突变体的诱导表达与纯化 |
| 2.2.5 果胶甲酯酶S6PE及其突变体的活性测定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 S6PE同源建模 |
| 2.3.2 分子置换获得S6PE与六糖底物的复合物结构模型 |
| 2.3.3 S6PE与十糖底物结合相关残基分布情况分析 |
| 2.3.4 底物结合残基丙氨酸扫描分析 |
| 本章小结 |
| 第三章 S6A中C端结构域多聚半乳糖醛酸酶的催化机理研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和载体 |
| 3.1.2 培养基和试剂的配制 |
| 3.1.3 试剂以及试剂盒 |
| 3.1.4 实验仪器设备 |
| 3.1.5 引物合成以及核酸测序 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 同源建模 |
| 3.2.2 分子对接 |
| 3.2.3 C端结构域多聚半乳糖醛酸酶S6PG的定点突变 |
| 3.2.4 S6PG以及突变体酶的诱导表达以及纯化 |
| 3.2.5 多聚半乳糖醛酸酶的活性标准曲线的制作 |
| 3.2.6 S6PG以及突变体的活性测定 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 S6PG的同源建模 |
| 3.3.2 分子对接获得S6PG与四聚半乳糖醛酸复合物结构 |
| 3.3.3 S6PG与四糖底物结合相关残基分布情况分析 |
| 3.3.4 底物结合相关残基的功能分析 |
| 本章小结 |
| 第四章 S6A中 S6PE与 S6PG协同降解果胶分子机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和载体 |
| 4.1.2 培养基和试剂的配制 |
| 4.1.3 试剂以及试剂盒 |
| 4.1.4 实验仪器设备 |
| 4.1.5 引物合成以及核酸测序 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 S6PE、S6PG和 S6A的定点突变 |
| 4.2.2 S6A以及突变体活性测定 |
| 4.2.3 S6PE与 S6PG最佳水解方式分析 |
| 4.2.4 S6A中 S6PE与 S6PG协同水解果胶产物的时程分析 |
| 4.2.5 柑橘以及苹果中粗果胶的提取 |
| 4.2.6 粗提柑橘果胶以及苹果果胶水解产物质谱分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 双功能酶 S6A与单酶 S6PE,S6PG水解果胶效果分析 |
| 4.3.2 S6A中 S6PE与 S6PG结构域分子内协同相互作用验证 |
| 4.3.3 S6A水解柑橘与苹果粗提果胶效果分析 |
| 4.3.4 粗提柑橘果胶以及苹果果胶水解产物质谱分析 |
| 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）基于细胞工程改造哺乳动物细胞生产杂合型N-聚糖（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物药物与医药重组蛋白 |
| 1.1.1 生物药物简介 |
| 1.1.2 医药重组蛋白简介 |
| 1.1.3 医药重组蛋白的表达生产 |
| 1.2 蛋白质的N-糖基化与均一性糖基化 |
| 1.2.1 蛋白质的N-糖基化 |
| 1.2.2 均一性糖基化 |
| 1.3 本论文研究意义与主要内容 |
| 1.3.1 本论文研究意义 |
| 1.3.2 本论文主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试剂、酶及耗材 |
| 2.1.4 主要培养基和溶液的配制 |
| 2.1.5 主要设备与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 编码α1,2-甘露糖苷酶的基因MsdS表达质粒的构建 |
| 2.2.2 贴壁型哺乳动物细胞培养 |
| 2.2.3 CRISPR Cas9基因编辑技术介导的基因敲除 |
| 2.2.4 凝集素染色分析细胞膜N-聚糖 |
| 2.2.5 质谱分析细胞膜N-聚糖 |
| 2.2.6 重组蛋白LIPA的瞬时表达与纯化 |
| 2.2.7 外切糖苷酶处理 |
| 2.2.8 重组蛋白Fc的稳定表达 |
| 2.2.9 重组蛋白Fc的纯化 |
| 2.2.10 重组蛋白上N-聚糖的质谱分析 |
| 2.2.11 蛋白质印迹法 |
| 2.2.12 MsdS的稳定表达 |
| 2.2.13 免疫荧光定位 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 HEK293野生型细胞内复杂型糖型合成的阻断 |
| 3.1.1 双基因敲除细胞株M2D-KO的构建 |
| 3.1.2 凝集素PHA-L4、ConA以及LCA分析M2D-KO细胞膜N-聚糖 |
| 3.1.3 质谱分析M2D-KO细胞膜N-聚糖 |
| 3.2 M2D-KO细胞内核心岩藻糖的去除 |
| 3.2.1 三基因敲除细胞株DF-KO的构建 |
| 3.2.2 凝集素LCA分析DF-KO细胞膜N-聚糖 |
| 3.2.3 质谱分析DF-KO细胞膜N-聚糖 |
| 3.3 M2D-KO和DF-KO细胞所表达分泌型重组蛋白上N-聚糖的鉴定 |
| 3.3.1 外切糖苷酶鉴定重组蛋白LIPA的N-聚糖 |
| 3.3.2 质谱分析重组蛋白LIPA的N-聚糖 |
| 3.3.3 质谱分析重组蛋白Fc的N-聚糖 |
| 3.4 DF-KO细胞内高甘露糖型含量的降低 |
| 3.4.1 DF-KO细胞内过表达编码α1,2-甘露糖苷酶的基因MsdS和MAN1A2 |
| 3.4.2 DF-KO细胞膜高甘露糖型含量的变化 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:质谱数据分析结果 |
| 附录B:作者在攻读硕士学位期间发表的文章 |
（5）蛋白质与药物及硅基材料的相互作用及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质的结构、功能及应用 |
| 1.1.1 血清白蛋白(SA)的生理功能 |
| 1.1.2 人血清白蛋白(HSA) |
| 1.1.3 牛血清白蛋白(BSA) |
| 1.1.4 白蛋白的主要应用 |
| 1.2 硅基材料在生物医药领域的应用 |
| 1.2.1 硅量子点(SiQDs) |
| 1.2.2 介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs) |
| 1.2.3 分子筛晶体材料 |
| 1.3 蛋白质与药物及硅基材料的相互作用 |
| 1.3.1 蛋白质与药物分子的作用 |
| 1.3.2 蛋白质与硅量子点的作用 |
| 1.3.3 蛋白质与介孔二氧化硅的作用 |
| 1.3.4 蛋白质与分子筛的作用及应用 |
| 1.4 本论文的研究目的、意义及研究内容 |
| 1.4.1 本论文选题目的及意义 |
| 1.4.2 本论文的主要研究内容 |
| 第2章 血清蛋白与药物分子的结合作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 内滤光的校正 |
| 2.2.4 荧光数据处理 |
| 2.2.5 圆二色谱数据的处理 |
| 2.2.6 分子对接方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 拉米夫定(3TC)与HSA的相互作用 |
| 2.3.2 隐丹参酮(CTSO)与HSA的相互作用 |
| 2.3.3 次黄嘌呤核苷(HXR)与HSA的相互作用 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 氨基甲酰化对2-氨基苯并噻唑蛋白结合性质的影响研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 MABT的合成与表征 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 荧光数据处理 |
| 3.2.5 圆二色谱数据的处理 |
| 3.2.6 分子对接方法 |
| 3.2.7 密度泛函理论(DFT)计算 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 荧光发射光谱 |
| 3.3.2 猝灭机理分析 |
| 3.3.3 结合平衡热力学 |
| 3.3.4 结合作用力分析 |
| 3.3.5 蛋白质构象的变化 |
| 3.3.6 结合部位研究 |
| 3.3.7 分子对接模拟 |
| 3.3.8 密度泛函理论(DFT)计算 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 水溶性氨基硅量子点的制备、蛋白结合及生物成像性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 硅量子点的合成 |
| 4.2.3 样品制备 |
| 4.2.4 荧光数据处理 |
| 4.2.5 圆二色谱数据的处理 |
| 4.2.6 细胞毒性试验 |
| 4.2.7 分子模拟 |
| 4.2.8 细胞成像 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 硅量子点的合成与表征 |
| 4.3.2 硅量子点的光学性质 |
| 4.3.3 硅量子点的发光稳定性 |
| 4.3.4 硅量子点对HSA荧光的影响 |
| 4.3.5 硅量子点对HSA的猝灭机理 |
| 4.3.6 相互作用热力学 |
| 4.3.7 表面性质模拟 |
| 4.3.8 硅量子点对蛋白质结构的影响 |
| 4.3.9 硅量子点的细胞毒性 |
| 4.3.10 硅量子点的细胞成像 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 白蛋白修饰的pH响应型介孔二氧化硅纳米棒载药系统的制备 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 MSNR1 的合成 |
| 5.2.3 MSNR6 的合成 |
| 5.2.4 MSNR8 的合成 |
| 5.2.5 HSA溶液中的药物释放 |
| 5.2.6 细胞毒性试验 |
| 5.3 结果和讨论 |
| 5.3.1 MSNR1 的合成与表征 |
| 5.3.2 MSNR2 的表面优化 |
| 5.3.3 MSNR载药系统的制备和表征 |
| 5.3.4 MSNR的分散性和稳定性 |
| 5.3.5 MSNR材料与HSA的作用 |
| 5.3.6 组装模型药物3TC |
| 5.3.7 MSNR的药物释放 |
| 5.3.8 MSNR材料的细胞毒性 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 血清蛋白与多级孔分子筛微球的相互作用及应用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 试剂和仪器 |
| 6.2.2 分子筛母体的合成 |
| 6.2.3 HSZ-Cal的修饰 |
| 6.2.4 HSZ对 BSA的组装 |
| 6.2.5 BSA吸附等温线 |
| 6.2.6 BSA的释放 |
| 6.2.7 HSZ-NH_2对HRP的固定化 |
| 6.2.8 酶催化活性的测定 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 HSZ材料的表征 |
| 6.3.2 HSZ材料的形貌 |
| 6.3.3 BSA的组装 |
| 6.3.4 材料的质地评价 |
| 6.3.5 吸附等温线和热力学 |
| 6.3.6 BSA的释放 |
| 6.3.7 BSA构象的变化 |
| 6.3.8 相互作用机理分析 |
| 6.3.9 HSZ固定化酶的应用探索 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 研究结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录:作者攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）人血浆及其外泌体组分的糖基化蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质组学 |
| 1.1.1 蛋白质组学概述 |
| 1.1.2 蛋白质组学的研究策略 |
| 1.1.3 基于质谱技术的蛋白质组学研究策略 |
| 1.1.4 基于质谱技术的蛋白质组学定量技术 |
| 1.2 糖基化蛋白质组学 |
| 1.2.1 糖基化蛋白质组学概述 |
| 1.2.2 糖基化蛋白质组学的研究策略 |
| 1.3 外泌体蛋白质组学 |
| 1.3.1 外泌体蛋白质组学概述 |
| 1.3.2 外泌体蛋白质组学的研究策略 |
| 1.3.3 外泌体糖基化蛋白质组学的研究策略 |
| 1.4 论文设计思路 |
| 第2章 唾液酸化糖肽富集新材料的制备及应用 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 材料制备与表征 |
| 2.2.3 标准蛋白和血清样品的前处理 |
| 2.2.4 唾液酸化糖肽富集 |
| 2.2.5 MHM回收率和富集容量评价 |
| 2.2.6 唾液酸糖肽质谱分析 |
| 2.2.7 数据检索与分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 制备MHM材料的合成和表征 |
| 2.3.2 MHM材料富集唾液酸糖肽的可行性评估 |
| 2.3.3 MHM材料富集复杂样品的应用 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 内源性完整糖肽的规模化鉴定 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 内源性肽段的提取 |
| 3.2.3 内源性糖基化肽段的富集 |
| 3.2.4 质谱分析 |
| 3.2.5 数据检索和分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 内源性糖基化肽段研究策略 |
| 3.3.2 内源性糖基化肽段样品处理及鉴定 |
| 3.3.3 内源性糖基化肽段的生物信息分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 血浆与尿液外泌体蛋白质组相关性及其糖基化修饰的研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 外泌体提取与蛋白质酶解 |
| 4.2.3 外泌体糖基化肽段富集 |
| 4.2.4 质谱分析 |
| 4.2.5 数据检索与分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 尿液与血浆外泌体蛋白质组相关性建立与评价 |
| 4.3.2 肝癌患者尿液与血浆外泌体蛋白质组相关性建立与分析 |
| 4.3.3 肝癌患者尿液外泌体糖基化定量蛋白质组分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介在学期内发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（7）定量糖组学揭示人血清白蛋白非酶糖基化影响不同抗凝药在糖尿病中的药效（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 糖基化修饰概述 |
| 1.1.1 酶促反应的糖基化修饰 |
| 1.1.2 非酶糖基化修饰 |
| 1.2 糖尿病 |
| 1.2.1 糖尿病分类 |
| 1.2.2 糖尿病的常规检测方法 |
| 1.2.3 糖尿病及其并发症与非酶糖基化 |
| 1.3 人血清白蛋白 |
| 1.3.1 人血清白蛋白的结构与功能 |
| 1.3.2 人血清白蛋白的非酶糖基化修饰 |
| 1.4 人血清白蛋白非酶糖基化对药物结合的影响 |
| 1.4.1 人血清白蛋白非酶糖基化对抗凝药的影响 |
| 1.4.2 人血清白蛋白非酶糖基化对其他药物的影响 |
| 1.4.3 蛋白与药物结合率测定技术 |
| 1.5 基于质谱技术的非酶糖基化分析策略 |
| 1.5.1 质谱技术概述 |
| 1.5.2 非酶糖基化定性分析 |
| 1.5.3 非酶糖基化定量分析 |
| 1.6 论文大纲 |
| 第二章 人血清白蛋白非酶糖基化位点的定性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂及耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 色谱柱 |
| 2.2.4 缓冲液及流动相配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 血浆制备及球蛋白的去除 |
| 2.3.2 硼酸盐亲和色谱 |
| 2.3.3 蛋白浓度测定 |
| 2.3.4 蛋白酶解 |
| 2.3.5 NanoLC-MS/MS分析 |
| 2.3.6 数据处理 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 亲和色谱分离 |
| 2.4.2 非酶糖基化位点鉴定 |
| 2.4.3 非酶糖基化位点在HSA上的分布 |
| 2.4.4 体内条件下HSA非酶糖基化位点总结 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 定量比较HSA的非酶糖基化水平 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂及耗材 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 色谱柱 |
| 3.2.4 缓冲液及流动相配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 血浆制备及球蛋白的去除 |
| 3.3.2 蛋白浓度测定 |
| 3.3.3 蛋白酶解及iTRAQ标记 |
| 3.3.4 硼酸盐亲和色谱分离糖化肽段 |
| 3.3.5 NanoLC-MS~3分析 |
| 3.3.6 K199糖化位点的MRM验证 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 糖尿病患者HSA非酶糖基化变化的定量研究 |
| 3.4.2 K199糖化位点的MRM定量 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 K199非酶糖化修饰影响HSA与抗凝药物的结合 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要软件与试剂及耗材 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 色谱柱 |
| 4.2.4 缓冲液及流动相配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 非酶糖基化HSA的结构准备 |
| 4.3.2 抗凝药物结构准备 |
| 4.3.3 对接分析 |
| 4.3.4 HSA药物结合区域及附近位点的非酶糖基化定量 |
| 4.3.5 突变HSA (K199M) |
| 4.3.6 HSA (K199M)非酶糖基化对华法林结合的影响 |
| 4.3.7 数据处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 K199非酶糖基化对HSA结合华法林与依诺肝素钠的影响 |
| 4.4.2 HSA药物结合区域及附近位点糖化对华法林结合的影响 |
| 4.4.3 氨基酸突变验证K199对HSA结合华法林的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 HSA非酶糖基化对抗凝药物结合和运输的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料及动物 |
| 5.2.1 试剂及耗材 |
| 5.2.2 动物类型 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 色谱柱 |
| 5.2.5 缓冲液及流动相配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 体外新鲜血浆制备 |
| 5.3.2 血浆与抗凝药物的孵育 |
| 5.3.3 体外华法林的分离与测定 |
| 5.3.4 体外依诺肝素钠的分离与测定 |
| 5.3.5 标准曲线构建 |
| 5.3.6 2型糖尿病大鼠模型的建立 |
| 5.3.7 白蛋白的完整分子量测定 |
| 5.3.8 大鼠体内华法林药物浓度测定 |
| 5.3.9 大鼠体内依诺肝素钠游离浓度测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 体外血浆中游离抗凝药物测定 |
| 5.4.2 白蛋白完整分子量测定 |
| 5.4.3 不同抗凝药物在大鼠体内的药动学特征 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 糖尿病患者抗凝药物疗效的初步临床回顾性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 电子医疗数据库用药记录检索 |
| 6.3 数据处理 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 回顾本论文的内容 |
| 本文取得的创新成果 |
| 本文不足之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及申请的专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）基于铁蛋白笼的金属配合物药物输送研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| List of Abbreviations |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 金属药物和金属配合物 |
| 1.1.1 金属药物和金属配合物的作用原理 |
| 1.1.1.1 化学疗法 |
| 1.1.1.2 光动力疗法 |
| 1.1.1.3 光热疗法 |
| 1.1.1.4 其他作用疗法 |
| 1.1.2 金属药物和金属配合物的载送 |
| 1.1.2.1 无机纳米载体 |
| 1.1.2.2 聚合物载体 |
| 1.1.2.3 脂质体 |
| 1.1.2.4 其他类型载体 |
| 1.2 金属结合蛋白-铁蛋白 |
| 1.2.1 铁蛋白的结构 |
| 1.2.1.1 外壳结构 |
| 1.2.1.2 通道结构 |
| 1.2.1.3 内腔结构 |
| 1.2.2 铁蛋白的应用 |
| 1.2.2.1 载体材料 |
| 1.2.2.2 多功能成像 |
| 1.2.2.3 光热疗法和光动力疗法 |
| 1.2.2.4 有机和生物催化 |
| 1.2.2.5 组装和有序排列 |
| 1.3 论文立题依据 |
| 参考文献 |
| 第二章 钌配合物的载送及细胞成像研究 |
| 2.1 引论 |
| 2.2 实验与方法 |
| 2.2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1.1 实验仪器 |
| 2.2.1.2 实验试剂 |
| 2.2.2 Ru配合物的合成 |
| 2.2.2.1 合成路线 |
| 2.2.2.2 配体dppz的合成 |
| 2.2.2.3 Ru配合物的合成 |
| 2.2.2.4 Ru配合物的亲脂性测试 |
| 2.2.3 Ru-NP的制备和结构表征 |
| 2.2.3.1 去铁蛋白纳米载体的制备 |
| 2.2.3.2 Ru配合物纳米颗粒的制备和修饰 |
| 2.2.3.3 Ru配合物包载量分析 |
| 2.2.3.4 透射电子显微镜形貌表征 |
| 2.2.3.5 粒径和ζ-电位表征 |
| 2.2.3.6 圆二色谱表征 |
| 2.2.4 Ru-NP的性能表征 |
| 2.2.4.1 量子产率测定 |
| 2.2.4.2 Ru配合物释放曲线测定 |
| 2.2.4.3 细胞培养 |
| 2.2.4.4 MTT细胞活性测试 |
| 2.2.4.5 激光共聚焦显微镜细胞成像测试 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Ru配合物的结构和亲疏水性质表征 |
| 2.3.2 Ru-NP的制备方法 |
| 2.3.3 Ru-NP的结构表征 |
| 2.3.4 Ru-NP的性质表征 |
| 2.3.5 Ru配合物的释放 |
| 2.3.6 细胞活性测试 |
| 2.3.7 细胞摄取和成像 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 铁硫簇型一氧化氮供体分子的载送及抗肿瘤研究 |
| 3.1 引论 |
| 3.2 实验与方法 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1.1 实验仪器 |
| 3.2.1.2 实验试剂 |
| 3.2.2 RBS的合成和包载 |
| 3.2.2.1 Fe-S簇配合物RBS和RRS的合成 |
| 3.2.2.2 去铁蛋白的制备和RBS的包载 |
| 3.2.2.3 RBS-NP的结构性质测定 |
| 3.2.3 光控释放一氧化氮 |
| 3.2.3.1 RBS-NP的稳定性测试 |
| 3.2.3.2 RBS-NP光控释放NO检测 |
| 3.2.3.3 细胞培养 |
| 3.2.3.3 细胞摄取 |
| 3.2.3.4 In vitro光控释放NO |
| 3.2.3.5 ROS测定 |
| 3.2.3.6 MTT细胞活性测试 |
| 3.2.3.7 ZnPPIX对RBS-NP光控释放NO的影响 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 RBS-NP的制备和结构表征 |
| 3.3.2 光控释放NO |
| 3.3.3 细胞内光控释放NO |
| 3.3.4 细胞活性测试 |
| 3.3.5 PPIX增长NO光控释放波长 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 替莫唑胺与铜的作用、载送及抗肿瘤研究 |
| 4.1 引论 |
| 4.2 实验与方法 |
| 4.2.1 实验仪器与试剂 |
| 4.2.1.1 实验仪器 |
| 4.2.1.2 实验试剂 |
| 4.2.2 Cu-MTIC的制备和稳定性表征 |
| 4.2.2.1 Cu-MTIC的制备 |
| 4.2.2.2 紫外-可见吸收光谱测定 |
| 4.2.2.3 UPLC分析 |
| 4.2.2.4 质谱分析 |
| 4.2.2.5 Job plot曲线测定 |
| 4.2.3 CuNPs的制备和结构表征 |
| 4.2.3.1 CuNPs的制备 |
| 4.2.3.2 CuNPs的结构性能检测 |
| 4.2.3.3 CuNPs的稳定性 |
| 4.2.3.4 铜含量分析 |
| 4.2.4 CuNPs in vitrio性能表征 |
| 4.2.4.1 细胞培养 |
| 4.2.4.2 去铁蛋白的荧光标记 |
| 4.2.4.3 去铁蛋白的细胞摄取成像 |
| 4.2.4.4 MTT细胞活性测试 |
| 4.2.4.5 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染流式检测 |
| 4.2.4.6 Caspase 3 活性检测 |
| 4.2.5 CuNPs in vivo性能表征 |
| 4.2.5.1 小鼠肿瘤模型的构建 |
| 4.2.5.2 小动物活体成像 |
| 4.2.5.3 H&E染色 |
| 4.2.5.4 TUNEL染色 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Cu-TMZ的相互作用及Cu作为受体对MTIC的稳定作用 |
| 4.3.2 CuNPs的制备和结构性能表征 |
| 4.3.3 GSH响应性释放MTIC |
| 4.3.4 GBM细胞摄取成像 |
| 4.3.5 细胞水平上的细胞毒性分析 |
| 4.3.6 CuNPs在活体水平上的性能 |
| 4.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 双硫仑与铜的作用、载送及抗肿瘤研究 |
| 5.1 引论 |
| 5.2 实验与方法 |
| 5.2.1 实验仪器与试剂 |
| 5.2.1.1 实验仪器 |
| 5.2.1.2 实验试剂 |
| 5.2.2 CuET及其蛋白纳米复合物的制备和表征 |
| 5.2.2.1 紫外-可见吸收光谱测定 |
| 5.2.2.2 纳米复合物的制备 |
| 5.2.2.3 纳米复合物的结构表征 |
| 5.2.2.4 纳米复合物的稳定性表征 |
| 5.2.2.5 细胞培养 |
| 5.2.2.6 细胞摄取表征 |
| 5.2.2.7 细胞活性和凋亡检测 |
| 5.2.3 CuET和Dox的共包载 |
| 5.2.3.1 CuET和Dox的共包载及性质测定 |
| 5.2.3.2 细胞活性测试 |
| 5.2.3.3 GSH触发Dox的释放 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 CuET的结构和性质 |
| 5.3.2 纳米复合物的制备和结构表征 |
| 5.3.3 细胞摄取成像 |
| 5.3.4 纳米复合物的细胞毒性 |
| 5.3.5 CuET与Dox的联用治疗 |
| 5.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 结与展望 |
| 博士期已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（9）肝病血清结合珠蛋白O-糖基化修饰的研究及临床意义（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 肝病血清结合珠蛋白的O-完整糖肽鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肝病血清结合珠蛋白的凝集素亲和印迹 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 综述 O-糖基化修饰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（10）超声波辅助糖基化修饰对蛋白质功能性质的影响及机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词与符号 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 牛血清白蛋白 |
| 1.2 α-乳白蛋白 |
| 1.3 食品加工技术对蛋白质改性的研究现状 |
| 1.3.1 糖基化修饰 |
| 1.3.2 超声波 |
| 1.3.3 复合修饰 |
| 1.4 生物质谱技术在蛋白质中的应用现状 |
| 1.4.1 生物质谱技术的概述 |
| 1.4.2 生物质谱技术在糖基化蛋白结构中的运用 |
| 1.5 本论文的研究意义 |
| 1.6 本论文的研究内容 |
| 1.7 本论文的主要创新点 |
| 第二章 超声波(功率、时间、温度)辅助糖基化(半乳糖)修饰对牛血清白蛋白功能性质的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 制备超声的样品 |
| 2.3.2 制备糖基化样品 |
| 2.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.3.4 尺寸排阻色谱(SEC) |
| 2.3.5 游离氨基酸测定 |
| 2.3.6 内源荧光强度测定 |
| 2.3.7 表面疏水性测定 |
| 2.3.8 乳化性测定 |
| 2.3.9 起泡性测定 |
| 2.3.10 热稳定性测定 |
| 2.3.11 数据统计与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 SDS-PAGE分析 |
| 2.4.2 SEC分析 |
| 2.4.3 接枝度分析 |
| 2.4.4 内源荧光强度分析 |
| 2.4.5 表面疏水性分析 |
| 2.4.6 乳化性分析 |
| 2.4.7 起泡性分析 |
| 2.4.8 热稳定性分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 超声波辅助糖基化(葡糖糖、半乳糖)修饰对牛血清白蛋白功能性质的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 制备超声的BSA |
| 3.3.2 糖基化样品的制备 |
| 3.3.3 质谱测定 |
| 3.3.4 褐变度测定 |
| 3.3.5 自由氨基酸测定 |
| 3.3.6 内源荧光强度测定 |
| 3.3.7 表面疏水性测定 |
| 3.3.8 乳化性测定 |
| 3.3.9 起泡性测定 |
| 3.3.10 数据统计与分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 分子量分析 |
| 3.4.2 褐变度分析 |
| 3.4.3 自由氨基酸分析 |
| 3.4.4 内源荧光强度分析 |
| 3.4.5 表面疏水性分析 |
| 3.4.6 乳化性分析 |
| 3.4.7 起泡性分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 超声波对α-乳白蛋白IgE/IgG结合能力的影响及其机制初探 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 制备超声的α-La |
| 4.3.2 IgE/IgG结合能力的测定 |
| 4.3.3 分子量测定 |
| 4.3.4 圆二色谱测定 |
| 4.3.5 内源荧光强度测定 |
| 4.3.6 表面疏水性测定 |
| 4.3.7 SEC测定 |
| 4.3.8 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 IgE/IgG结合能力分析 |
| 4.4.2 分子量分析 |
| 4.4.3 二级结构分析 |
| 4.4.4 内源荧光强度分析 |
| 4.4.5 表面疏水性分析 |
| 4.4.6 SEC分析 |
| 4.4.7 ESI-MS分析 |
| 4.4.8 超声波对α-乳白蛋白IgG/IgE结合能力的影响机制分析 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 超声波辅助糖基化(半乳糖)修饰降低α-乳白蛋白IgE/IgG结合能力及其机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 超声波处理α-La |
| 5.3.2 制备糖基化样品 |
| 5.3.3 IgE/IgG结合能力测定 |
| 5.3.4 MALDI-TOF-MS测定 |
| 5.3.5 FASP酶解 |
| 5.3.6 ETD/Q-Exactive-MS/MS测定 |
| 5.3.7 数据库搜索 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 IgE/IgG结合能力分析 |
| 5.4.2 半乳糖与α-La结合物的平均分子量和结合率 |
| 5.4.3 糖基化位点和数目 |
| 5.4.4 DSP值分析 |
| 5.4.5 超声波辅助糖基化修饰降低α-La致敏性的机制分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 超声波辅助糖基化(葡萄糖)修饰提高α-乳白蛋白抗氧化能力及其机制 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 超声波处理α-La |
| 6.3.2 制备糖基化样品 |
| 6.3.3 SEC测定 |
| 6.3.4 内源荧光强度测定 |
| 6.3.5 ABTS+清除能力测定 |
| 6.3.6 FASP酶解 |
| 6.3.7 ETD/Q-Exactive-MS/MS测定 |
| 6.3.8 数据库搜索 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 SEC分析 |
| 6.4.2 内源荧光强度分析 |
| 6.4.3 抗氧化能力分析 |
| 6.4.4 糖基化位点分析 |
| 6.4.5 DSP值分析 |
| 6.4.6 超声波辅助糖基化修饰提高α-La抗氧化能力的机制分析 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 超声波辅助糖基化(甘露糖)修饰对α-乳白蛋白糖基化特性的影响.. |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验仪器与设备 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 超声波处理α-La |
| 7.3.2 制备糖基化样品 |
| 7.3.3 SEC测定 |
| 7.3.4 内源荧光强度测定 |
| 7.3.5 CID/FTCIR-MS/MS测定 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 SEC分析 |
| 7.4.2 内源荧光强度分析 |
| 7.4.3 糖基化位点分析 |
| 7.4.4 糖基化程度分析 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读博士学位期间发表的论文 |
四、半乳糖修饰人血清白蛋白的质谱分析（论文参考文献）
- [1]长效化胰高血糖素样肽-1类似物设计、合成及降糖活性研究[D]. 戴士杰. 江南大学, 2021(01)
- [2]罗汉果中两种G蛋白偶联受体靶向活性成分色谱筛选及评价[D]. 贾晓妮. 西北大学, 2021(12)
- [3]双结构域双功能果胶甲酯酶/多聚半乳糖醛酸酶协同催化果胶的分子机制研究[D]. 王胜. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]基于细胞工程改造哺乳动物细胞生产杂合型N-聚糖[D]. 冷继雄. 江南大学, 2021(01)
- [5]蛋白质与药物及硅基材料的相互作用及应用研究[D]. 张华新. 湖北大学, 2021(01)
- [6]人血浆及其外泌体组分的糖基化蛋白质组学研究[D]. 王舒越. 吉林大学, 2020(01)
- [7]定量糖组学揭示人血清白蛋白非酶糖基化影响不同抗凝药在糖尿病中的药效[D]. 仇红燕. 山东大学, 2020(12)
- [8]基于铁蛋白笼的金属配合物药物输送研究[D]. 黎晓. 南京大学, 2019(01)
- [9]肝病血清结合珠蛋白O-糖基化修饰的研究及临床意义[D]. 李丽敏. 广西医科大学, 2019(08)
- [10]超声波辅助糖基化修饰对蛋白质功能性质的影响及机制初探[D]. 刘俊. 江西师范大学, 2018(12)