一、新城疫病毒HB92株NP基因序列测定和分析（论文文献综述）
孟令宅[1]（2020）在《基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救》文中提出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病,世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的传染病,我国将其列为一类动物疫病。NDV只有单一血清型,但存在多种基因型,目前我国主要流行的是Class Ⅱ类型中基因Ⅶ毒株,常规疫苗株B1、Clone30、La Sota及V4疫苗株属于基因Ⅰ型和Ⅱ型,不能有效防控基因Ⅶ型毒株。因此,应迫切研发与当前流行株基因型一致的新型疫苗。基于此,本研究对一株NDVHB株进行了全基因组测序,以此为基础建立了HB株的反向遗传操作平台,并对其F蛋白进行改造,旨在为研发基因Ⅶ型NDV弱毒疫苗提供科学依据。从河北省某发病鸡场的临床样本中检测到一株新城疫病毒,命名为HB,采用RT-PCR方法对HB株的全基因组序列进行分段扩增,并对其基因序列进行结构特性分析及同源进化分析。结果表明HB株基因组全长为15192 bp,基因组3’端存在长为55 nt的引导序列,5’端存在长为114 nt的尾随序列,主要编码的6种结构蛋白,包括基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）、核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、以及RNA依赖性RNA聚合酶蛋白（L）,基因组排列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。全基因组遗传进化分析表明,HB株属于Class Ⅱ中的基因Ⅶ型毒株,与鸭源新城疫毒株BP01、Fujian/FP/02、MMd/CH/LGD/1/2005核苷酸的同源性最高（99.1%～99.2%）,进化树上处于同一分支;与中国广泛使用的V4,Mukteswar和La Sota等疫苗株核苷酸的同源性较低（82.9%～85.6%）,进化树上处于不同分支。基于F基因的系统进化树显示,HB株属于基因Ⅶd亚型,是目前我国流行毒株中的优势亚型毒株。通过与其它毒株的序列进行比对,发现在F蛋白的信号肽,七肽重复区和跨膜结构域中出现了 4、16和2个氨基酸突变,在HN蛋白的功能结构域和中和表位分别出现1和5个氨基酸突变,这些关键位点的突变与病毒的吸附性及免疫逃避有关。应用反向遗传操作技术将HB株全长cDNA分为外部基因质粒（M、F及HN）和内部基因质粒（NP、P及L）两部分构建,通过同义突变将L蛋白的3100位点处的碱基A突变为T作为遗传标记,用以与野毒进行区分;利用融合PCR技术将F蛋白的112～117裂解位点的氨基酸序列突变为弱毒株La Sota裂解位点序列,同时构建了三个辅助质粒PCI-NP,PCI-P,PCI-L,将内部基因质粒、外部基因质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞进行病毒拯救,并通过细胞病变、遗传标记检测、基因测序及间接免疫荧光等试验技术对拯救病毒进行鉴定,结果表明,rHB株能在BHK-21细胞上引起典型的细胞病变（CPE）,引入的遗传标记在传代过程中可以稳定遗传,F蛋白裂解位点处氨基酸序列突变成功,病毒拯救成功。对拯救病毒的生长特性进行分析,表明rHB株与HB株在BHK-21细胞上具有相似的生长特性。NDV HB株感染性克隆的成功构建可为进一步研究NDV的致病机制和研发新型基因工程疫苗提供技术平台。
曹永忠,阮宝阳,张小荣,胡海,陈银,吴艳涛[2]（2017）在《不同耐热性新城疫病毒株全基因组比较研究》文中进行了进一步梳理耐热新城疫病毒分子生物学特性研究对于新城疫的防控具有重要意义。从GenBank中检索获得所有已测序的新城疫病毒耐热株全基因组序列和不耐热LaSota株全基因组序列,分别从基因组核酸、结构蛋白氨基酸水平以及囊膜蛋白二级结构、功能位点变化等方面进行生物信息学比较。结果表明:耐热株全基因组序列GC含量略高于不耐热株,基因组中GC分布不均衡,靠近基因组3’端存在GC含量较高区域。耐热株结构蛋白氨基酸组成存在极性氨基酸、杂环族氨基酸以及脯氨酸偏高的现象。耐热株F蛋白理论pI值和不稳定指数均小于不耐热株,二级结构中螺旋区域扩大,折叠区域变小,而HN蛋白理论pI值小于但不稳定指数大于不耐热株,二级结构中螺旋与折叠区域均扩大,且比不耐热株多1个α螺旋。
刘倩[3]（2017）在《新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建》文中进行了进一步梳理新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是严重危害养禽业的烈性传染病——新城疫（Newcastle disease,ND）的病原。由于V4和1-2等耐热ND弱毒疫苗的贮存和运输不需要依赖冷链,在热带、亚热带国家和地区已经得到广泛应用。我国上世纪90年代引进了 NDV耐热毒株V4,但由于知识产权等的限制,至今未大规模应用于生产。本研究从保存的40多株NDV中筛选到1个耐热强毒株（HR09株）;测定了该毒株的全基因组序列,并分析了其分子生物学特性;建立了该毒株的反向遗传操作系统,并对其F基因进行突变,得到NDV耐热弱毒株。本研究为进一步揭示NDV耐热毒株的耐热机制和创制耐热ND弱毒疫苗奠定了基础。1新城疫病毒耐热株HR09鉴定及全基因组序列测定将本室保存的40多个NDV分离株与V4、LaSota等参考毒株共同进行耐热性试验。以56℃耐热处理30 min时仍具有血凝性作为筛选标准,获得1个耐热毒株——HR09株。HR09株经蚀斑纯化后进行生物学特性鉴定,显示该毒株的MDT为57.6 h,ICPI为1.8,IVPI为1.56,符合NDV强毒株特征。设计10对引物,对HR09株全基因组序列进行扩增、测定和生物信息学分析,结果显示,该毒株基因组全长为15192 nt,推导的F蛋白裂解位点氨基酸序列为112RRQKRF117,HN蛋白长度为571个氨基酸残基,符合NDV强毒株特征。HR09株基因组GC含量为46.27%,与耐热的V4株、1-2株全基因组的核苷酸序列同源性为86.7%和85.4%,6个结构蛋白编码基因的核苷酸序列同源性介于83.1%～95.6%之间、推导的氨基酸序列同源性介于81.6%～98.0%之间。基于F基因全长所构建的进化树显示,HR09株属于基因ⅷ型毒株。2新城疫病毒耐热株HR09反向遗传操作系统的构建设计了多对引物,构建了 HR09株基因组的全长cDNA克隆以及含有该毒株NP、P和L基因的3个真核表达质粒,共转染BSR-T7/5细胞,拯救出病毒NDV/rHR09。对获救病毒的耐热性进行测定,显示其经56℃处理60 min时仍具有血凝活性,说明NDV/rHR09株与亲本株的耐热性相似。NDV/rHR09株的MDT值为60 h,ICPI值为1.625,仍为NDV强毒株。3新城疫病毒耐热弱毒株rAHR09的构建设计两对引物,经Overlap PCR的方法将NDV/rHR09毒株F基因裂解位点的112、115和117位碱性氨基酸突变成弱毒株特征的非碱性氨基酸,构建了转录载体prNDV/HR09,将转录载体与NP、P和L基因的真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞,拯救出病毒NDV/rAHR09。经56。C、45min处理,NDV/rAHR09株仍具有血凝性,MDT值>120h,ICPI值为0.057。结果表明,NDV/rAHR09株具有耐热性,且毒力已明显致弱,可以作为耐热ND弱毒疫苗的候选毒株。
杨峻,王红琳,温国元,罗青平,汪宏才,艾地云,张蓉蓉,罗玲,张腾飞,邵华斌[4]（2014）在《新城疫活疫苗（V4/HB92克隆株）对鹌鹑、鸽临床试验》文中提出应用兽药GMP车间生产的3批新城疫活疫苗（V4/HB92克隆株）中试产品分别在安陆和云梦对7 500只鹌鹑和4 500只鸽进行了临床效力试验。安全试验结果表明,3批疫苗用10倍剂量分别对30日龄的鹌鹑和鸽滴鼻,观察10 d,无任何毒副反应。免疫效力试验分为滴鼻和饮水2种方法,3批疫苗滴鼻免疫3 000只鹌鹑,免疫后2周抗体开始上升,ND-HI达3.9 log2,抗体持续16周;饮水免疫的3 000只鹌鹑,2周抗体为3.1 log2,抗体持续8周。三批疫苗滴鼻免疫1 500只鸽,免疫2周ND-HI抗体达4.1log2,抗体持续8周;饮水免疫的1 500只鸽,免疫后2周抗体为3.8 log2,持续8周抗体仍然为4.1 log2。试验攻毒保护力测定结果与ND-HI抗体水平呈正相关。
商雨[5]（2012）在《新城疫病毒TS09-C株全长cDNA克隆的构建及荧光定量RT-PCR检测方法的建立》文中认为新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）为副粘病毒科副粘病毒属成员,其引起的新城疫（Newcastle Disease, ND）是一种高传染性高破坏性的疾病,被国际兽医局认定为两种A类禽病之一。当前,新城疫的防控以免疫预防为主,以NDV V4耐热株为代表的耐热活疫苗具有耐热、冷链要求低、使用方便、毒力低、免疫效果好和可同居感染等优点,在我国及其他发展中国家有着广阔的应用前景。现已有的NDV耐热毒株有V4、1-2、HB92、B95和TS09等,其中TS09株是我课题组经过对V4株的鸡胚耐热选育、纯化获得的。如能够采用反向遗传操作技术将NDV耐热毒株改造为耐热载体,插入其他禽类疫病的主要免疫源性基因,研发出禽类主要疫病的多联（多价）耐热活疫苗,将对禽病的防控带来深远的影响。但是,关于NDV耐热毒株反向遗传操作系统的成功构建至今仍未见报道。因此,本研究以TS09耐热株为研究对象,开展了NDV耐热毒株反向遗传操作系统的构建工作。一、新城疫病毒耐热株的细胞适应培养现有的反向遗传操作系统大多是在细胞上建立的,而TS09株为鸡胚适应株,不能在细胞上高效增殖。首先开展了TS09株的BHK细胞适应性培养及纯化工作。细胞培养条件的优化结果表明,0.2μg/mL的TPCK胰酶浓度为最大无毒浓度。连续17代传代培养及3次极限稀释法纯化,获得了一株新的、纯化的、适应BHK细胞的NDV耐热株,命名为TS09-C株。TS09-C株的生物学特性测定结果表明：TS09-C株的EID50值由原有的108.6/mL下降至1057/mL,但TCID50值由原有的103.3/mL上升至1079/mL,表明TS09-C株为细胞适应毒,且保持了亲本株的弱毒和耐热的特性,成功选育了新城疫耐热株细胞适应毒株。此外,序列分析结果表明：TS09、TS09-C和V4株仍保持着较近的遗传进化关系。二、TS09-C株的全基因组序列测定与分析设计了10对PCR引物对TS09-C株的全基因组进行了序列测定与分析。测序结果经序列拼接后获得TS09-C全基因组序列,全长15186nt。序列分析表明TS09-C和Ⅰ-2、I-2progenitor、Ulster-67共处在Ⅰ型分支上,编码6个结构蛋白（NP、P、M、F、HN和L）和两个非结构蛋白（V和W）；通过比对TS09-C株和V4株各基因的氨基酸同源性,发现M基因的同源性最低,为92.3%；F和HN的同源性较高,均大于99%。HN蛋白糖基化位点分析表明,TS09-C株HN蛋白仅含有4个糖基化位点,缺失119位和508位糖基化位点。采用生物信息学技术对TS09-C株的耐热机理进行了初步探讨。比较包括TS09-C株在内的4株耐热株和非耐热株氨基酸序列时,共发现23个耐热株特有的氨基酸差异,其中大部分为保守性突变,非保守性突变仅发现在P和W蛋白上。蛋白质二级结构比较分析表明耐热株和非耐热株的二级结构上的差异主要在HN蛋白的α螺旋区。这些耐热株特有位点（或结构）的发现为我们进一步研究其耐热提供了思路。三、TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建参考已经获得的TS09-C株全基因组序列,并进行酶切位点分析,设计出了TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建策略。共设计了8对引物用于全长cDNA克隆的构建。通过高保真RT-PCR,扩增出了8个片段（A、B、C、D、E、F、G1和G2）,G1和G2通过融合PCR形成G片段。在A片段的上游引入了T7RNA聚合酶的启动子,G片段通过融合PCR在其下游引入了T7RNA聚合酶的终止子和丁型肝炎病毒核酶序列。通过酶切连接的方法构建出三个中间质粒：pBR-ABC, pBR-DE和pBR-FG。再通过酶切连接的方法将ABC和DE插入pBR-FG中形成pBR-TS09-C全长质粒。经测序分析,与TS09-C株全基因组序列相比,全长质粒上有6处突变,其中4处同义突变,仅两处突变引起了氨基酸的改变,分析表明：这两处氨基酸突变在NDV其他毒株中也同样存在,不会影响到后续病毒的拯救恢复。四、新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用为给后续的新城疫研究提供快捷的定量检测方法,本研究建立了新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法。经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对,在其F基因上找到一个相对保守序列,根据保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针。以新城疫Ⅰ系疫苗株（Mukteswar株）作为标准品,通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性实验,建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法。该方法能检测最低初始病毒浓度为1022ELD50/mL,且在108.2-102.2ELD50/mL范围内Ct值与病毒的浓度的对数值（1gELD50/mL）呈很好的线性关系,R2达到0.9975；该方法与禽流感病毒、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应；批间和批内重复性良好；临床样品检测中荧光RT-PCR与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98.5%、50%和98.4%。因此,荧光RT-PCR检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法,为新城疫病毒的研究提供了技术平台。综上所述,本论文主要完成了新城疫病毒耐热株细胞适应培养、TS09-C株全基因组的测序与分析和TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建等研究,为新城疫耐热株反向遗传操作系统的建立打下了良好的工作基础。新城疫荧光RT-PCR检测方法的建立为后续的新城疫研究提供了技术平台。
王戬[6]（2012）在《三株不同禽源新城疫病毒的全基因组序列测定与分析》文中研究说明新城疫是由新城疫病毒引起的主要侵害禽类的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病是全球范围内最严重的禽类传染病之一,严重威胁养禽业的发展。其病原新城疫病毒是有囊膜的单股负链RNA病毒。病毒基因组全长15Kb,包含六个串联排列的基因,依次为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,分别编码核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L）。本研究根据GenBank上已公布的新城疫病毒的全基因组序列设计10对引物,分别以安徽凤阳新城疫病毒鸡源分离株WFooC、鸭源分离株WFooD及鹅源分离株WFooG的基因组RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出各目的片段,与pMD18-T载体连接后转化到感受态细胞DH5a,挑取PCR鉴定正确的阳性克隆送公司测序。用DNASTAR软件对测序结果进行拼接,得到了WF00C、WF00D及WF00G的全基因组序列,并从全基因组序列同源性、基因组结构、np基因末端的核苷酸序列、各基因遗传进化情况、各基因核苷酸及氨基酸序列同源性、Leader序列和Trailer序列同源性等方面对WF00C、 WF00D、WF00G及其它NDV参考毒株进行比较分析。结果表明,WF00C、WF00D及WF00G的全基因组序列全长均为15192nt,与ZJ1、NA-1等毒株的基因组长度相同,比传统毒株LaSota、B1、Clone30等的基因组长6个核苷酸。WF00D、WF00C、WFooG的亲缘关系很近,尤以WF00D和WFooG的亲缘关系最近。WF00D、WF00C、WFooG在基因型分类上均归属于基因Ⅶ型,与同属于基因Ⅶ型的国内当前流行株ZJ1、NA-1、SF02、 FMW等亲缘关系近,而与基因Ⅱ型的传统疫苗株或弱毒株LaSota、B1、Clone30和基因Ⅸ型的国内标准强毒株F48E8亲缘关系远。NDV流行株与传统疫苗株之间已发生较大差异。NDV基因组结构在遗传进化上高度保守。基因组的演化是在整体水平上进行的,l基因在病毒演化过程中保守性高,而p基因的保守性较差。NDV各毒株的3’端调控区同源性较高,而5’端调控区同源性较低。WF00C、WF00D及WF00G的各基因核苷酸的碱基突变多为C-T之间或者是A-G之间的转换,引起的大部分为同义突变。本研究测定了WF00D、WF00C、WF00G的全基因组序列并在分子水平上研究了它们的遗传变异情况、进化关系、分类地位及毒力差异的原因,为研究NDV的种间传播的分子机制,揭示NDV的演化规律奠定基础；为NDV的分子流行病学调查提供可靠的生物信息学依据；同时还为运用反向遗传技术研究NDV的分子生物学特性做准备。
周辰瑜[7]（2012）在《H6亚型禽流感病毒病原学监测和快速检测方法的研究》文中进行了进一步梳理H6亚型禽流感病毒（AIV）属于低致病性A型流感病毒,水禽和野鸟是H6亚型禽流感病毒的主要宿主。H6亚型禽流感病毒可以感染哺乳动物,如鼠和水貂,甚至还有报道称在健康的青年体内检测到了H6亚型AIV的抗体。低致病性AIV通过基因重排等为H5N1等高致病性禽流感病毒提供基因,从而可能引起流感的流行。从2009年至2011年活禽市场采集样品中分离H6亚型禽流感病毒。用血凝抑制试验初步筛选,PCR方法进行进一步的确认检测,对NA基因进行序列测定。结果表明,2009年到2011年间的样品中共分离到7株H6亚型禽流感病毒,分别为1株H6N1,两株H6N2,一株H6N5,两株H6N6,一株H6N8。对分离到的7株鸭源H6亚型禽流感病毒的八个基因片段进行序列测定。完成7株H6亚型AIV的全基因测序后,将序列鉴定结果与GENBANK上的序列进行比对分析。结果表明,7株H6亚型AIV的八个基因片段均属于欧亚谱系,基因来源结构比较复杂。在HA1和HA2剪切位点,7株分离株的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,仅含一个碱性氨基酸,都符合典型低致病性禽流感病毒特征序列。建立了检测H6亚型禽流感病毒（AIV）逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法,对反应条件和反应体系进行优化。结果表明该方法的特异性良好,对其他呼吸道病原体均无扩增反应。该方法灵敏度高,最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01pg,该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测方法。并且建立了H6亚型禽流感病毒（AIV） SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏度高出1000倍。对其他呼吸道病原体无扩增；检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5h。比较对H6亚型AIV建立的四种快速检测方法RT-PCR、巢式RT-PCR、实时荧光定量PCR和RT-LAMP四种方法的灵敏性。结果表明：四种方法中,实时荧光定量PCR的敏感性最高,其次为RT-LAMP和巢式RT-PCR,普通PCR敏感性最低。基层检验时可以根据需要和条件选择适合的检测方法,多种快速检测方法结合可以更好地确定诊断。
商雨,邵华斌,王红琳,杨峻,胡薛英,程国富,温国元[8]（2011）在《新城疫病毒TS09耐热株HN基因的序列测定与分析》文中研究指明新城疫病毒TS09耐热株是由V4株经耐热选育得到的新毒株。对其血凝素-神经氨酸酶（Hemag-glutinin-Neuraminidase,HN）基因进行序列测定分析。选取GenBank中国内外具有代表性的序列与其进行同源性和系统进化分析。结果表明,氨基酸序列同源性比较中,TS09耐热株与V4株的氨基酸的同源性为96.8%;在核苷酸系统进化树中,V4株位于基因Ⅰ型的分支上,TS09耐热株位于基因Ⅱ型的分支上;耐热株中HN基因中GC含量为47.58%,比不耐热株GC含量高;但比较耐热株和不耐热株HN蛋白的α螺旋,耐热株比不耐热株的HN蛋白在跨膜区和胞外区均多出一个长的α螺旋。同源性和系统进化分析表明TS09耐热株与V4株有很近的亲缘关系;耐热株和不耐热株HN蛋白的GC含量、α-螺旋有很大的差别,这可能与耐热性有一定的关系。
王旋[9]（2009）在《不同禽源新城疫强毒株部分基因的克隆与序列分析及新城疫假型病毒的构建》文中认为新城疫又称亚洲鸡瘟,是由新城疫病毒（NDV）所引起的严重危害养禽业的主要疫病之一。在OIE被列为A类疫病,在我国被列为一类疫病。NDV属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属,是一种具有囊膜、单链负股RNA病毒。NDV属二类病原微生物,易发生变异,其宿主范围广泛,新致病型不断出现。本研究拟通过克隆三种不同禽源NDV部分基因（F、HN、NP、M）进行序列分析,在分子水平上探讨WF00C、 WF00D、WF00G株的分类地位、毒力、特点及进化关系,近而为解释NDV的演化提供依据。采用假病毒系统构建具有新城疫病毒囊膜糖蛋白一次性感染能力的假病毒,为NDV囊膜蛋白基因的功能及细胞融合活性的研究奠定基础。1.不同禽源新城疫强毒株F、HN基因的克隆与序列分析分别对鸡源、鸭源、鹅源NDV强毒分离株（WF00C、WF00D、WF00G）的F基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行分析。结果表明,各分离株F基因均含1个完整的开放阅读框（ORF）,全长为1662bp,编码553个氨基酸,有6个潜在的糖基化位点,裂解位点区的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒株特征相符,具有第101位的K（赖氨酸）和121位的V（缬氨酸）,符合基因Ⅶ型NDV特征；WFooC株有13个半胱氨酸（Cys）残基,WF00D株和WF00G株各有12个Cys残基；在限制性内切酶（RE）位点（nt334-1682）的分布上,三个毒株均存在多数鹅源分离株特有的973nt和1249nt Rsa Ⅰ位点；WFooD株与WFooC株、WFooG株以及Genebank下载的15株各基因型代表株的F基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源率为84.7～99.3%,推导的氨基酸序列同源率为88.4～98.9%；各分离株HN基因均含1个完整的（?）ORF, ORF全长为1716bp,编码571个氨基酸。WF00D洙与WF00C株、WF00G株以及Genebank下载的15株各基因型代表株的HN基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源率为84.0～100.0%,推导的氨基酸序列同源率为88.1～100.0%；三个分离株间的同源性高,均有5个潜在的糖基化位点,13个半胱氨酸残基,且位置均相同。其中鸭、鹅源HN基因序列完全相同,其与ZJ1、SF02和NA1等鹅源毒株之间差异较小而与Lasota、F48E9等毒株之间差异明显。根据NDV系统发育进化树、酶切位点分析以及基因分型结果,证明它们的基因型均为Ⅶd亚型。2.不同禽源新城疫强毒株NP、 P、（?）（?）基因的克隆与生物学特性分析根据GeneBank登录的新城疫病毒P基因序列,设计一对引物,运用RT-PCR技术分别对鸡源、鸭源、鹅源NDV强毒分离株（WF00C、WF00D、WF00G）的P基因进行扩增,将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体后,进行酶切、PCR和测序验证,并对其核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析、系统进化树分析及三个不同禽源分离毒株氨基酸序的比较。结果表明,各分离株NP、P、M基因均含1个完整的开放阅读框（ORF）, ORF总长分别为1470bp、1188bp、1095bp,分别编码489、395、364个氨基酸。鸭源毒株与GenBank下载的各参考毒株的NP、P、M基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源率为85.2～99.4%、81.5～99.7%、84.1～99.7%,推导的氨基酸序列同源率为90.6～99.4%、80.1-99.7%、86.1～99.7%；三个不同禽源分离株间的同源性较高,其与近年分离的ZJ1、SF02和NA1等鹅源毒株和PX2/03、Duck/1/05、FP1/02等鸭源毒株之间差异较小,系统进化树分析表明,同属于基因Ⅶ型新城疫病毒；与Lasota、F48E9等经典毒株之间差异明显,说明该毒株相对于经典的禽源NDV在NP、P、M基因上均亦有较大的变异。各氨基酸序列的比对情况与核苷酸序列比对差异较小。通过比较不同禽源毒株在NP、P、M基因的变异情况,显示出高度的一致性,同时揭示了不同禽源间NDV病毒互感变异的存在,且各个基因的变异是同步的。其中P基因在NDV Ⅶd亚型中存在特征性氨基酸序列。3.新城疫病毒假型病毒体系的构建及生物活性分析根据已获得的鸡源F、HN的基因核苷酸序列设计一对含Flag标签蛋白编码序列PCR引物,其5’端分别引入EcoRI/SalI酶切位点,以T克隆重组质粒pMDC-F、 pMDC-HN为模板,PCR扩增NDV F、HN基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组真核表达质粒pcDNA-JF-Flag、pcDNA-JHN-Flag。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的HIV-1基因组重组质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染HEK293T细胞,收获NDV假病毒上清,感染293T细胞,进行虫荧光素酶（Luciferase）报告基因活性检测。结果表明,分离、克隆的NDVF、H基因序列全长分别为1662bp和1716bp,与模板pMD-F、pMD-HN基因序列100%同源；NDV假型病毒感染HEK293T细胞与相应的对照相比Luciferase活性值显着增高。成功构建了含Flag标签序列的NDV囊膜糖蛋白基因的真核表达质粒,制备出了NDV-F/HN假型病毒。
陈珍,施少华,程龙飞,傅光华,陈红梅,万春和,林芳,林建生,黄瑜[10]（2009）在《鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析》文中研究指明根据GenBank登录的鸡新城疫病毒NP基因序列设计引物,利用RT-PCR对F48E9强毒株NP基因进行扩增,将扩增产物经纯化后连入pMD18-T载体,通过PCR和酶切鉴定出阳性重组质粒,经测序后获得F48E9 NP基因序列。经分析发现该基因的ORF总长为1 470 bp,编码489 aa,NP蛋白有4个高度保守的Cys位点,分别位于第55、78、139、213位,且在401～440位和461～481位区域变异较大。将F48E9株与19株参考毒株的相应序列进行比较得到核苷酸序列同源性为87.9%～92.3%,氨基酸序列同源性较高,为92.2%～98.0%,遗传进化分析表明F48E9株相对独立,与参考毒株的遗传距离较远。
二、新城疫病毒HB92株NP基因序列测定和分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新城疫病毒HB92株NP基因序列测定和分析（论文提纲范文）
（1）基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 基因组特征 |
| 1.1.2 编码蛋白及其功能 |
| 1.1.3 病毒分类及理化性质 |
| 1.1.4 分子流行病学 |
| 1.2 新城疫疫苗研究概况 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 弱毒疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3 反向遗传学 |
| 1.3.1 RNA病毒的反向遗传学研究 |
| 1.3.2 反向遗传学在新城疫病毒上的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 多克隆抗体 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 主要设备及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的检测 |
| 2.2.2 病毒全基因组序列的测定 |
| 2.2.3 辅助质粒的构建 |
| 2.2.4 POK12载体的改造 |
| 2.2.5 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 2.2.6 内部基因的构建 |
| 2.2.7 外部基因的构建 |
| 2.2.8 BSR-T7/5细胞的培养 |
| 2.2.9 病毒的拯救 |
| 2.2.10 拯救病毒的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR鉴定 |
| 3.2 全基因组扩增 |
| 3.3 全基因组序列分析 |
| 3.3.1 HB株基因组特征 |
| 3.3.2 编码区序列分析 |
| 3.3.3 非编码区序列分析 |
| 3.3.4 F蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3.5 HN蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3.6 遗传进化分析 |
| 3.4 辅助质粒的构建 |
| 3.5 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 3.5.1 POK12载体的改造结果 |
| 3.5.2 内部基因和外部基因扩增 |
| 3.6 F蛋白的改造结果 |
| 3.7 拯救病毒的鉴定 |
| 3.7.1 鸡胚病变 |
| 3.7.2 遗传标记检测 |
| 3.7.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.7.4 拯救病毒在细胞上的病变 |
| 3.7.5 拯救病毒的TCID50 |
| 3.7.6 拯救病毒的生长特性分析 |
| 3.7.7 F蛋白裂解位点测序结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HB株全基因组序列分析 |
| 4.2 NDV弱毒株感染性克隆的构建 |
| 4.3 F蛋白裂解位点的改造 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）不同耐热性新城疫病毒株全基因组比较研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 NDV耐热株、不耐热株全基因组序列 |
| 1.2 基因组核酸序列分析与比较 |
| 1.3 结构蛋白氨基酸序列比较分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 耐热株与不耐热株全基因组核酸序列比较 |
| 2.2 耐热株与不耐热株结构蛋白氨基酸序列比较 |
| 3 讨论 |
（3）新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒耐热株HR09鉴定及其全基因组序列测定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 细胞及鸡胚 |
| 1.1.3 主要实验试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 耐热性测定 |
| 1.2.2 病毒纯化 |
| 1.2.3 HR09株全基因组序列测定及分析 |
| 1.2.3.1 引物设计与合成 |
| 1.2.3.2 病毒RNA的提取及RT-PCR |
| 1.2.3.3 目的片段的克隆与鉴定 |
| 1.2.3.4 5'RACE和3'RACE |
| 1.2.3.5 序列测定与分析 |
| 1.2.4 生物学特性的研究 |
| 1.2.4.1 1CPI的测定 |
| 1.2.4.2 IVPI的测定 |
| 1.2.4.3 MDT的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 耐热性测定 |
| 1.3.2 病毒纯化 |
| 1.3.3 HR09株生物学特性 |
| 1.3.4 HR09株全基因组序列测定 |
| 1.3.5 HR09株全基因组序列分析 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第二章 HR09耐热株反向遗传操作系统的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 细胞及鸡胚 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 HR09全基因组cDNA各片段的克隆与测序 |
| 2.2.3 HR09全基因组cDNA转录载体的构建 |
| 2.2.3.1 HR09全基因组各片段重组质粒的提取 |
| 2.2.3.2 HR09基因组5'端及3'端的连接 |
| 2.2.3.3 中间质粒TM (2296nt-13048nt)的构建 |
| 2.2.3.4 含HR09株全基因组cDNA的转录载体的构建 |
| 2.2.3.5 HR09株全基因组cDNA的转录载体的鉴定 |
| 2.2.4 辅助质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.4.1 辅助质粒pCI-NP、pCI-P的构建 |
| 2.2.4.2 辅助质粒pCI-L的构建 |
| 2.2.4.4 辅助质粒的鉴定 |
| 2.2.5 病毒的拯救和鉴定 |
| 2.2.5.1 细胞和转染用质粒的准备 |
| 2.2.5.2 共转染 |
| 2.2.5.3 获救病毒的鉴定 |
| 2.2.6 获救病毒的耐热测定 |
| 2.2.7 MDT和ICPI的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HR09全长基因组cDNA各片段的扩增结果 |
| 2.3.2 HR09全基因组cDNA转录载体的鉴定 |
| 2.3.3 辅助质粒的构建和鉴定结果 |
| 2.3.4 获救病毒的鉴定 |
| 2.3.5 获救病毒耐热性测定结果 |
| 2.3.6 获救病毒MDT和ICPI测定结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 HR09耐热株致弱拯救研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 细胞及鸡胚 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 片段Rr1和片段Rr2的克隆与测序 |
| 3.2.3 prNDV/HR09全基因组cDNA转录载体的构建 |
| 3.2.3.1 片段Rr1和片段Rr2重组质粒的提取 |
| 3.2.3.2 重组质粒T-Rr12的构建 |
| 3.2.4 病毒的拯救和鉴定 |
| 3.2.4.1 细胞和转染用质粒的准备 |
| 3.2.4.2 共转染 |
| 3.2.4.3 鉴定 |
| 3.2.5 获救病毒的耐热试验 |
| 3.2.6 获救病毒的生物学特性的测定 |
| 3.2.7 获救病毒的感染性试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 片段Rr1和片段Rr2的扩增结果 |
| 3.3.2 片段Rr12的扩增结果 |
| 3.3.3 获救病毒的鉴定 |
| 3.3.4 获救病毒的耐热试验结果 |
| 3.3.5 获救病毒的生物学试验结果 |
| 3.3.6 获救病毒的细胞感染性试验结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）新城疫活疫苗（V4/HB92克隆株）对鹌鹑、鸽临床试验（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验疫苗 |
| 1.2 试验鹌鹑 |
| 1.3 试验鸽 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 疫苗的安全性试验 |
| 1.4.2 鹌鹑的免疫效力试验 |
| 1.4.3 鸽的免疫效力试验 |
| 1.4.4 免疫攻毒保护力试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 疫苗的安全性试验 |
| 2.2 鹌鹑的免疫效力试验 |
| 2.2.1 滴鼻免疫效力试验 |
| 2.2.2 饮水免疫效力试验 |
| 2.3 鸽的免疫效力试验 |
| 2.3.1 滴鼻免疫效力试验 |
| 2.3.2 饮水免疫效力试验 |
| 2.4 免疫攻毒保护力试验 |
| 3 小结与讨论 |
（5）新城疫病毒TS09-C株全长cDNA克隆的构建及荧光定量RT-PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 略缩词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 新城疫研究现状 |
| 1.1 基因组 |
| 1.2 病毒蛋白研究现状 |
| 1.2.1 核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP) |
| 1.2.2 磷蛋白(Phosphoprotein,P) |
| 1.2.3 基质蛋白(Matrixprotein,M) |
| 1.2.4 融合蛋白(Fusionprotein,F) |
| 1.2.5 血凝素-神经氨酸酶蛋白(Haemagglutinin-neuraminidase,HN) |
| 1.2.6 大聚合酶蛋白(Large-protein,L) |
| 1.3 新城疫病毒培养特性 |
| 1.4 新城疫病毒耐热特性研究 |
| 2 新城疫病毒反向遗传技术研究进展 |
| 2.1 反向遗传技术应用于病毒蛋白功能的研究 |
| 2.2 新城疫病毒反向遗传技术在肿瘤治疗中的应用 |
| 2.3 反向遗传技术制备基因工程疫苗 |
| 3 荧光定量技术研究进展 |
| 3.1 染料法荧光定量技术 |
| 3.2 探针法荧光定量技术 |
| 3.2.1 TaqMan探针法 |
| 3.2.2 分子信标技术 |
| 3.2.3 杂交探针法 |
| 3.2.4 复合探针法 |
| 4 目的和意义 |
| 第二章 新城疫病毒耐热株的细胞适应培养 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞及试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 红细胞的制备 |
| 1.5 BHK细胞培养 |
| 1.6 TPCK-胰酶浓度的优化 |
| 1.7 NDV TS09株在BHK细胞上的传代 |
| 1.8 NDV毒株的生物学特性测定 |
| 1.8.1 血凝活性效价(HA)测定 |
| 1.8.2 鸡胚平均致死时间(MDT)测定 |
| 1.8.3 脑内致病指数(ICPI) |
| 1.8.4 半数细胞感染剂量(TCID50)和半数鸡胚感染剂量(EID50) |
| 1.9 NDV毒株F、HN基因的扩增与测序 |
| 1.10 NDV毒株F、HN基因的序列分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 胰蛋白酶最适浓度的优化 |
| 2.2 TS09株在BHK细胞中的传代培养 |
| 2.3 TS09-C株F、HN基因的序列测定与分析 |
| 2.4 NDV毒株F基因的同源性分析 |
| 2.5 NDV毒株的遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 NDV TS09-C株全基因组序列的测定与分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 酶和试剂 |
| 1.3 引物设计和合成 |
| 1.4 基因组全长的分段扩增和测序 |
| 1.5 NDV TS09-C株全基因组序列的分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 序列分析 |
| 2.2.1 全基因组基因结构特点分析 |
| 2.2.2 同源性分析 |
| 2.2.3 系统进化分析 |
| 2.2.4 HN蛋白糖基化位点分析 |
| 2.3 耐热分析 |
| 2.3.1 氨基酸差异性分析 |
| 2.3.2 二级结构分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 引物设计 |
| 3.2 序列分析 |
| 3.3 耐热分析 |
| 第四章 NDV TS09-C株全长cDNA克隆的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 酶和试剂 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 NDV TS09-C株全长cDNA克隆构建策略 |
| 1.3.1 pBR-ABC质粒的构建方案 |
| 1.3.2 pBR-DE和pBR-FG质粒的构建方案 |
| 1.3.3 全长质粒pBR-TS09-C的构建方案 |
| 1.4 病毒RNA的提取、反转录及PCR |
| 1.5 引物自延伸反应 |
| 1.6 融合PCR |
| 1.7 酶切反应 |
| 1.8 连接反应 |
| 1.9 DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.10 转化实验 |
| 1.11 测序分析 |
| 1.12 质粒稳定性测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的片段的扩增 |
| 2.2 构建各质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 测序分析 |
| 2.4 质粒稳定性试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 全长cDNA克隆的构建思路 |
| 3.2 PCR扩增以及产物的连接 |
| 3.3 质粒的酶切鉴定及测序 |
| 第五章 新城疫荧光定量检测的建立 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒和样品 |
| 1.2 试剂和主要仪器 |
| 1.3 引物及探针的设计合成 |
| 1.4 病毒、细菌核酸提取 |
| 1.5 荧光RT-PCR方法的建立 |
| 1.6 标准品的制备 |
| 1.7 灵敏性试验及标准曲线的绘制 |
| 1.8 临床应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 荧光反应条件的优化 |
| 2.2 灵敏性实验 |
| 2.3 特异性实验 |
| 2.4 重复性实验 |
| 2.5 临床样品检测结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 硕士期间发表文情况 |
（6）三株不同禽源新城疫病毒的全基因组序列测定与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 新城疫概述 |
| 2 新城疫病毒(NDV)的分子生物学 |
| 2.1 新城疫病毒(NDV)的基本结构与特征 |
| 2.2 新城疫病毒的基因组 |
| 2.3 NDV基因组编码蛋白的特性 |
| 2.3.1 核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP) |
| 2.3.2 磷蛋白(phospho protein,P)和非结构蛋白 |
| 2.3.3 基质蛋白(matrix protein,M) |
| 2.3.4 融合蛋白(fusion protein,F) |
| 2.3.5 血凝素—神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN) |
| 2.3.6 大分子蛋白(large protein,L) |
| 2.4 NDV致病性的分子基础 |
| 3 NDV的演化 |
| 3.1 NDV感染宿主范围的演化 |
| 3.2 NDV毒力的演化 |
| 3.3 NDV遗传特性的演化 |
| 4 NDV的基因分型与分子流行病学 |
| 第二章 研究内容 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 病毒及SPF鸡胚 |
| 1.1.2 菌种及载体质粒 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 病毒的增殖 |
| 1.2.2 病毒效价测定 |
| 1.2.3 病毒RNA的提取 |
| 1.2.4 NDV WF_(00)C、WF_(00)D及WF_(00)G株的全基因组克隆 |
| 1.2.5 WF_(00)C、WF_(00)D及WF_(00)G株全基因组序列的拼接与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 WF_(00)C、WF_(00)D及WF_(00)G株全基因组各片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2 阳性克隆的PCR鉴定 |
| 2.3 WF_(00)C、WF_(00)D及WF_(00)G株全基因组序列的拼接与分析 |
| 2.3.1 WF_(00)C、WF_(00)D及WF_(00)G株全基因组序列的拼接 |
| 2.3.2 全基因组序列同源性比较 |
| 2.3.3 基因组结构分析及比较 |
| 2.3.4 WF_(00)D与WF_(00)C、WF_(00)G及其它NDV毒株np基因末端的核苷酸序列比较 |
| 2.3.5 各基因的遗传进化分析 |
| 2.3.6 WF_(00)D与WF_(00)C、WF_(00)G及其它NDV毒株各基因核苷酸及推导氨基酸序列同源性比较 |
| 2.3.7 Leader序列和Trailer序列分析 |
| 2.3.8 WF_(00)C、WF_(00)D及WF_(00)G株各基因核苷酸差异分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 研究的主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（7）H6亚型禽流感病毒病原学监测和快速检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 第一章 ：文献综述 |
| 1 禽流感病毒的分子病原学研究进展 |
| 1.1 禽流感的流行概况和危害 |
| 1.2 禽流感病毒的概况 |
| 1.3 禽流感病毒的生物学特性 |
| 1.4 水禽和候鸟在禽流感传播中的作用 |
| 2 禽流感病毒的快速诊断方法研究进展 |
| 2.1 逆转录-聚合酶链式反应 |
| 2.2 逆转录-巢式聚合酶链式反应 |
| 2.3 逆转录-环介导等温核酸扩增技术 |
| 2.4 实时荧光定量RT-PCR |
| 3 本课题的研究意义 第二章 ：H6型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒分离结果 |
| 2.3 RT-PCR检测结果 |
| 2.4 毒株NA亚型的测定结果 |
| 2.5 H6型AIV病原性监测情况 |
| 2.6 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定和鸡胚半数致死量(ELD_(50))的测定结果 |
| 2.7 致病性实验结果 |
| 3 讨论 第三章 ：7株H6亚型禽流感病毒的全基因序列测定与序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 H6亚型AIV全基因RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 7株毒株的个基因片段克隆和序列测定结果 |
| 2.3 7株H6亚型AIV全基因组序列分析 |
| 3 讨论 第四章 ：H6亚型禽流感病毒快速检测方法的建立 |
| 1. H6亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 2. H6亚型禽流感病毒SYBR Green Ⅰ实时定量荧光PCR方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 第五章 ：H6亚型禽流感病毒四种核酸检测方法比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株和主要仪器试剂 |
| 1.2 病毒RNA的提取 |
| 1.3 质粒与核酸的梯度稀释 |
| 1.4 核酸浓度测定 |
| 1.5 引物的合成 |
| 1.6 四种检测方法的最佳扩增条件 |
| 1.7 四种核酸扩增方法的检出限测定 |
| 1.8 临床样品的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 质粒标准品敏感性检测结果与病毒RNA敏感性检测结果 |
| 2.2 临床样品检测结果 |
| 3 讨论 结论 参考文献 致谢 个人简历 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）新城疫病毒TS09耐热株HN基因的序列测定与分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒RNA提取及c DNA合成 |
| 1.5 PCR扩增及产物纯化 |
| 1.6 序列测定与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 NDV TS09耐热株HN基因的扩增 |
| 2.2 NDV TS09耐热株HN基因序列测定 |
| 2.3 NDV TS09耐热株HN基因的氨基酸同源性分析 |
| 2.4 基于HN基因的遗传进化分析 |
| 2.5 NDV TS09耐热株HN基因以及蛋白质α螺旋分析 |
| 3 讨论 |
（9）不同禽源新城疫强毒株部分基因的克隆与序列分析及新城疫假型病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文部分缩写的中英文对照 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒的分子生物学研究进展 |
| 1 囊膜糖蛋白基因(F、HN) |
| 2 基质蛋白基因(M) |
| 3 核衣壳蛋白基因(NP) |
| 4 磷蛋白基因(P) |
| 5 大蛋白基因(L) |
| 参考文献 |
| 第二章 假病毒的应用研究进展 |
| 1 假型病毒的特性 |
| 2 假型病毒的制备 |
| 3 假型病毒的应用 |
| 3.1 病毒与宿主细胞间的相互作用 |
| 3.2 中和抗体及抗原表位 |
| 3.3 基因治疗 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 不同禽源新城疫强毒株F、HN基因的克隆与序列分析 |
| 摘要： |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 菌种、载体质粒和试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 病毒增殖及病毒RNA提取 |
| 1.4.1 病毒增殖 |
| 1.4.2 病毒RNA提取 |
| 1.5 NDV F、HN基因的RT-PCR扩增 |
| 1.5.1 引物设计与合成 |
| 1.5.2 NDV基因cDNA的合成 |
| 1.5.3 F、HN基因的扩增 |
| 1.6 PCR产物的克隆与鉴定 |
| 1.7 序列测定 |
| 1.8 三种禽源F、HN基因系统发育进化树的构建 |
| 1.9 NDV各毒株F基因限制性内切酶位点分布比较 |
| 1.10 F、HN基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性比较 |
| 1.11 三种禽源F、HN蛋白基因核苷酸序列推导氨基酸序列的异同 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 F基因结果与分析 |
| 2.1.1 F基因RT-PCR扩增结果 |
| 2.1.2 扩增产物克隆与鉴定结果 |
| 2.1.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.4 鸡、鸭、鹅源NDV F基因(ORF)测序 |
| 2.1.5 系统发育进化树的构建 |
| 2.1.6 F基因上限制性内切酶(RE)位点分布结果 |
| 2.1.7 F蛋白可变区部分氨基酸序列的比较 |
| 2.1.8 F基因氨基酸、核苷酸序列同源性和致病力的比较 |
| 2.1.9 三种禽源F蛋白基因核苷酸序列推导氨基酸序列的异同 |
| 2.2 HN基因结果与分析 |
| 2.2.1 HN基因RT-PCR扩增结果 |
| 2.2.2 扩增产物克隆与鉴定结果 |
| 2.2.3 鸡、鸭、鹅源NDV HN基因(ORF)测序 |
| 2.2.4 鸡、鸭、鹅源NDV HN基因系统发育进化树的构建 |
| 2.2.6 二种禽源HN蛋白基因核苷酸序列推导氨基酸序列的异同 |
| 2.5 HN基因核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性的比较 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 不同禽源新城疫强毒株NP、P、M基因的克隆与序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 菌种、载体质粒和试剂及主要仪器 |
| 1.3 病毒增殖与纯化 |
| 1.4 病毒RNA提取 |
| 1.5 NDV NP、P及M基因的RT-PCR扩增 |
| 1.5.1 引物设计与合成 |
| 1.5.2 NP、P、M基因的RT-PCR扩增 |
| 1.5.3 NP、P、M基因PCR产物的克隆与鉴定 |
| 1.5.4 NP、P、M基因序列测定及系统发育进化树的构建 |
| 1.5.5 NP、P、M基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性比较 |
| 1.5.6 三种禽源NP、P、M基因核苷酸序列及推导氨基酸序列的异同 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NP基因结果与分析 |
| 2.1.1 NP基因RT-PCR结果 |
| 2.1.2 NP基因质粒酶切鉴定结果 |
| 2.1.3 鸡、鸭、鹅源NDV NP基因(ORF)测序 |
| 2.1.4 系统发育进化树的构建, |
| 2.1.5 NP基因氨基酸、核苷酸序列同源性和致病力的比较 |
| 2.1.6 三种禽源NP蛋白基因核昔酸序列推导氨基酸序列的异同 |
| 2.2 P基因结果与分析 |
| 2.2.1 P基因RT-PCR结果 |
| 2.2.2 扩增产物克隆、鉴定 |
| 2.2.3 鸡、鸭、鹅源NDV P基因(ORF)测序 |
| 2.2.4 P基因的系统发育树进化分析 |
| 2.2.5 核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性比较 |
| 2.2.6 三种禽源P蛋白基因核苷酸序列推导氨基酸序列的异同 |
| 2.3 M基因结果与分析 |
| 2.3.1 M基因RT-PCR扩增结果 |
| 2.3.2 扩增产物克隆、鉴定 |
| 2.3.3 鸡、鸭、鹅源NDV M基因(ORF)测序 |
| 2.3.4 M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性比较 |
| 2.3.5 M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列系统发育分析 |
| 2.3.6 三种禽源M蛋白基因核苷酸序列推导氨基酸序列的异同 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 新城疫病毒假型病毒体系的构建及生物活性分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR引物的设计 |
| 1.2.2 PCR分离NDV的F、HN基因 |
| 1.2.3 pcDNA-JF-Flag、pcDNA-JHN-F1ag重组真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.4 NDV假病毒的包装以及假病毒的收获 |
| 1.2.5 NDV假型病毒感染HEK 293T细胞与Luciferase活性检测 |
| 1.2.6 Western blot法检测HIV-1 p24蛋白在HEK 293T细胞中的表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR分离NDV F、HN基因 |
| 2.2 真核表达质粒pcDNA-JF-Flag、pcDNA-JHN-Flag的双酶切鉴定 |
| 2.3 Western blot法检测F、HN蛋白在HEK 293T细胞中的表达 |
| 2.4 NDV假病毒感染HEK 293T细胞后Luciferase活性检测 |
| 2.5 Westenr blot法检测HIV-lp24蛋白在HEK293T细胞中的表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 附录1 论文中所用的主要试剂及培养基的配制 |
| 附录2 论文中使用的重要实验技术 |
| 硕士期间发表和完成的论文 |
| 致谢 |
（10）鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株和菌株 |
| 1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒的增殖与RNA的提取 |
| 1.5 RT-PCR |
| 1.6 pMD18-NP重组质粒的构建与筛选 |
| 1.7 NDV F48E9 NP基因的测序结果与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NDV F48E9株NP基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 PCR产物的克隆与酶切鉴定 |
| 2.3 NDV F48E9株NP基因序列测定 |
| 2.4 F48E9株NP基因序列同源性比较 |
| 2.5 NP基因系统发育进化分析 |
| 3 讨论 |
四、新城疫病毒HB92株NP基因序列测定和分析（论文参考文献）
- [1]基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救[D]. 孟令宅. 河北农业大学, 2020(01)
- [2]不同耐热性新城疫病毒株全基因组比较研究[J]. 曹永忠,阮宝阳,张小荣,胡海,陈银,吴艳涛. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2017(04)
- [3]新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建[D]. 刘倩. 扬州大学, 2017(02)
- [4]新城疫活疫苗（V4/HB92克隆株）对鹌鹑、鸽临床试验[J]. 杨峻,王红琳,温国元,罗青平,汪宏才,艾地云,张蓉蓉,罗玲,张腾飞,邵华斌. 湖北农业科学, 2014(14)
- [5]新城疫病毒TS09-C株全长cDNA克隆的构建及荧光定量RT-PCR检测方法的建立[D]. 商雨. 华中农业大学, 2012(02)
- [6]三株不同禽源新城疫病毒的全基因组序列测定与分析[D]. 王戬. 南京农业大学, 2012(01)
- [7]H6亚型禽流感病毒病原学监测和快速检测方法的研究[D]. 周辰瑜. 广西大学, 2012(03)
- [8]新城疫病毒TS09耐热株HN基因的序列测定与分析[J]. 商雨,邵华斌,王红琳,杨峻,胡薛英,程国富,温国元. 湖北农业科学, 2011(12)
- [9]不同禽源新城疫强毒株部分基因的克隆与序列分析及新城疫假型病毒的构建[D]. 王旋. 南京农业大学, 2009(06)
- [10]鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析[J]. 陈珍,施少华,程龙飞,傅光华,陈红梅,万春和,林芳,林建生,黄瑜. 福建农业学报, 2009(05)