一、根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析（论文文献综述）
李世琦[1]（2021）在《巨球百合细胞壁转化酶基因及其启动子功能初探》文中研究说明百合作为重要的球根植物,具有悠久的栽培历史,其在食用药用和观赏方面都有着广泛的用途,因此也被称为“球根花卉之王”。随着现代社会人们对美好生活的不断向往,百合鲜切花的需求量逐年递增,目前已经是国内继月季和菊花之后的第三大鲜切花材料。但是百合鳞茎的快速繁殖问题一直没有能得到有效的解决,对百合的大规模产业化种植和商业化应用有很大的影响。蔗糖作为植物生长发育中必不可少的营养物质,在百合小鳞茎发生发育过程中起着至关重要的作用。实验选用野百合（Lilium brownii）优异变种材料巨球百合（Lilium brownii var.giganteum）作为研究对象,通过对巨球百合三代转录组数据进行生物信息学分析、形态学观察以及分子实验等方法,旨在研究巨球百合淀粉-蔗糖代谢路径中的关键基因即细胞壁转化酶基因,克隆该基因及其上游启动子,并进行初步的功能验证,进而为小鳞茎的增殖发生与淀粉蔗糖代谢途径之间的相关性研究提供参考。本实验的主要结果如下:（1）LbgCWIN1基因克隆及序列分析根据转录组数据及共表达分析,并结合多个高等植物细胞壁转化酶基因开展进化树分析,结果表明巨球百合CWIN基因与抗逆基因RPP13以及与细胞膜物质转运相关的基因PATl5的表达模式具有直接的联系。筛选得到了巨球百合细胞壁转化酶基因的c DNA序列,在不同蔗糖浓度处理下巨球百合小鳞茎中的CWIN基因存在着明显的差异表达。设计引物并克隆到了长度为2928 bp基因组DNA序列,并命名为LbgCWIN1（登录号MN794186）,通过Protparam、TMHMM、SWISS-MODEL等生信软件进行分析,表明该基因编码的蛋白共574个氨基酸,并预测了蛋白的的二维、三维结构,同时,根据亚细胞定位的实验结果确定了巨球百合细胞壁转化酶的工作位点在细胞壁上。（2）LbgCWIN1基因启动子的克隆及功能验证使用染色体步移法对LbgCWIN1基因的启动子进行克隆,两次克隆共获得了2718 bp DNA序列,并通过Place、Plant Care等启动子在线预测软件,分析得到在该启动子序列中存在多个响应元件,其中包括脱落酸（ABA）响应元件ABRE、ABRE4,光响应元件ACE、AE-box、ATC-motif、Box 4、ERE和逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、Myb-binding site等等。设计启动子5’端缺失载体,获得了4个缺失启动子载体CWIN1-p1（2527 bp）、CWIN1-p2（1606 bp）、CWIN1-p3（904 bp）和CWIN1-p4（459 bp）。通过农杆菌注射烟草叶片的方法进行瞬时转化,获得了不同5’端缺失启动子载体在烟草叶片的GUS染色和GUS活性情况,发现LbgCWIN1基因启动子的核心结构区域存在于-459 bp以内,在其上游区域可能还存在一些增强子和沉默子序列。（3）LbgCWIN1基因过表达载体构建及异源转化通过拟南芥种子点播法观察发芽情况筛选出拟南芥潮霉素抗性筛选的抗生素使用浓度为40 mg/L。使用无缝克隆的方法将LbgCWIN1基因CDS序列与过表达载体p CAMBIA 1301进行连接构建重组质粒,随后通过农杆菌浸花法将过表达载体稳定转化拟南芥,在潮霉素抗性筛选、PCR阳性检测和q RT-PCR等方法筛选得到了稳定遗传LbgCWIN1基因过表达载体的T3代拟南芥株系,发现该基因的过量表达能够使得拟南芥的部分果荚长度增长,对于拟南芥的种子产量研究具有一定的指导意义。
贾旭慧[2]（2021）在《黄花苜蓿MfNAC87和MfNAC63基因的功能分析》文中指出黄花苜蓿（Medicago falcata）具有抗旱、抗寒、耐盐碱等优良特征,是抗性育种的重要种质资源。NAC蛋白是存在于植物中的一类转录因子,其既参与植物生长、果实成熟以及叶片衰老等各种生理过程,又在逆境应答过程中发挥着重要的作用。本研究克隆获得了黄花苜蓿Mf NAC87基因1290 bp ORF序列,该基因编码蛋白质的分子量为48.32 KDa,等电点为5.83。构建了表达载体p CAMBIA1300（35S-Mf NAC87-s GFP）,并在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片表皮细胞中瞬时表达,发现Mf NAC87定位于细胞核内。酵母转化实验显示Mf NAC87具有转录激活活性,且转录激活结构域位于蛋白C端。分别获得过表达Mf NAC87和Mf NAC63的T3代转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）纯合株系,对转基因株系进行胁迫处理,发现在干旱和盐胁迫以及ABA处理条件下过表达Mf NAC87基因抑制了转基因拟南芥植株的生长,过表达Mf NAC63基因促进了转基因拟南芥植株的生长。低温胁迫条件下,过表达Mf NAC87基因可促进转基因拟南芥植株的生长,而过表达Mf NAC63基因抑制了转基因拟南芥植株的生长。利用Genome Walker技术分别获得了Mf NAC87、Mf NAC63上游1404 bp、1439 bp启动子序列信息,预测分析显示Mf NAC87基因启动子含有受光照、低温、赤霉素、茉莉酸甲酯调控的顺式作用元件,Mf NAC63基因启动子含有受光照、赤霉素、脱落酸、生长素调控的顺式作用元件。进一步利用PCR扩增获得Mf NAC63启动子区,并构建p ORER1-pro.Mf NAC63::GUS表达载体,获得了转基因拟南芥,GUS化学组织染色表明Mf NAC63启动子驱动基因的表达受到ABA、IAA和GA3的调节。
邱炳玲[3]（2021）在《三七茉莉酸响应WRKY转录因子的分离与分析》文中指出三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]又名田三七,具有活血化瘀、消肿定痛、止血补血、提高机体免疫力等功效,药用价值高。近年来根腐病、黑斑病、圆斑病等真菌病害严重影响了三七的品质及三七产业的可持续发展,其中主要由茄腐镰刀菌导致的三七根腐病最为严重。本课题组在前期研究中发现茉莉酸信号是三七响应茄腐镰刀菌的重要信号途径,并且从三七中分离得到一系列茉莉酸响应的抗病相关基因（PnDEFL1、PnSN1、PnPR10-3、PnChI1、PnGlu1、PnPGIP）。WRKY转录因子在调控植物防御病原菌侵染的转录重编程过程中发挥重要作用,是植物防御反应过程中的重要表达基因,近年来得到了广泛的研究关注,但对三七WRKY转录因子的研究却鲜见报道,且WRKY转录因子在三七体内是否参与调控对病原菌的防卫反应尚不清楚,因此,本项目从三七中分离协同茉莉酸信号参与茄腐镰刀菌防卫反应的WRKY基因;分析其在正常生长的三七中、信号分子处理后以及茄腐镰刀菌侵染过程中的表达谱;并选择了响应茉莉酸且表达水平较高的三七PnWRKY9基因,对其进行结构和亚细胞定位分析、功能验证以及对三七防御素基因PnDEFL1的转录调控特性研究。本论文的开展将有助于进一步了解三七WRKY转录因子协同茉莉酸信号参与对茄腐镰刀菌的防卫反应机制,深入认识三七与根腐病菌的分子互作机制。本文的研究内容和研究结果总结如下:1、通过转录组测序技术获得三七WRKY基因家族序列,并克隆得到30个具有完整ORF框的三七WRKY基因,将其命名为PnWRKY1-PnWRKY30。对这些基因进行保守结构分析、系统发育树分析、茉莉酸甲酯信号分子处理后茄腐镰刀菌侵染过程的表达谱分析。结果表明三七WRKY基因家族具有完整的保守结构域,在进化过程中高度同源。PnWRKY5/6/9/11/15/21/22/25/28/30等10个WRKY基因响应茉莉酸甲酯处理,并在茄腐镰刀菌侵染过程中转录水平上升。2、选取响应表达水平较高的PnWRKY9基因进行深入的功能研究。序列分析发现该基因含有一个WRKY结构域和一个CTYQGCX23HTH锌指结构域;构建PnWRKY9与GFP的融合表达载体,将其转化至根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105感受态细胞中,在洋葱表皮细胞中瞬时表达,激光共聚焦显微镜下观察PnWRKY9蛋白的定位位置,结果表明PnWRKY9蛋白定位在细胞核中。构建了p CAMBIA2300s-PnWRKY9植物超表达载体转化至WT烟草中稳定表达,获得PnWRKY9转基因烟草,并进行抗性分析,结果表明PnWRKY9转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性明显提高。随后又构建了PnWRKY9的RNAi表达载体将其转化至三七叶片中瞬时表达,并接种茄腐镰刀菌,结果显示RNAi载体表达的三七叶片增强了对茄腐镰刀菌的敏感性。功能验证分析表明,PnWRKY9是三七应对茄腐镰刀菌侵染的正调控因子。3、为验证PnWRKY9是调控三七抗性相关基因的转录因子,克隆了三七防御素基因PnDEFL1的启动子PPnDEFL1。该启动子含有一个W-box,进而采用凝胶阻滞（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）、酵母单杂交（yeast one hybrid,Y1H）分析PnWRKY9对PPnDEFL1的结合以及转录激活。构建了PnWRKY9的原核表达载体,通过异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导外源蛋白表达,并用Ni-NTA柱亲和层析法纯化出PnWRKY9重组蛋白,用于EMSA实验,结果显示PnWRKY9蛋白能与含有W-box的PPnDEFL1片段特异性结合;构建了PnWRKY9猎物载体和PPnDEFL1启动子诱饵载体,共同转化至酵母感受态细胞中用于YIH实验,结果表明,PnWRKY9转录因子具有转录激活特性;同时还构建了启动子与GUS基因表达融合载体,分别转化至过表达PnWRKY9的转基因烟草和WT烟草中表达,并测定转基因烟草的GUS活性,结果表明,PPnDEFL1与PnWRKY9共表达烟草的GUS活性明显强于PPnDEFL1单表达转基因烟草的GUS活性。可见PnWRKY9转录因子能转录激活PnDEFL1基因的启动子,正调控PnDEFL1的表达水平。三七WRKY是协同茉莉酸信号途径参与对茄腐镰刀菌防卫反应的重要转录因子基因,其中有10个基因响应茉莉酸甲酯的处理,并在茄腐镰刀菌侵染过程中转录水平上升。PnWRKY9是细胞核定位蛋白,特异结合根腐病抗病基因PnDEFL1的启动子序列,并正调控PnDEFL1的转录水平。PnWRKY9响应茉莉酸信号,正调节防御素基因的表达,在三七对茄腐镰刀菌防卫反应中起重要的调控作用。
张玉琦[4]（2021）在《BpCYP49、BpCYP71基因在白桦脂醇合成中的功能鉴定》文中研究说明白桦（Betula platyphylla var.mandshurica）树皮中含有白桦脂醇、白桦脂酸、齐墩果酸等三萜类活性物质,它们具有抗肿瘤、抗炎、抗艾滋病毒（HIV）及抗疟疾等药理活性。纯天然白桦活性产物含量低,化学合成成本高,制约其在生产实践中的应用。细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase,CYP450）是参与植物代谢的最大酶家族,在三萜骨架结构多样化及功能化修饰中具有关键作用。本研究拟克隆白桦BpCYP450基因,明确BpCYP450基因与三萜合成关键基因的表达特征,将5个BpCYP450基因在烟草和酿酒酵母细胞中表达,以期探明它们在三萜合成的功能。研究结果如下:1.以白桦苗cDNA为模板,克隆获得5个白桦BpCYP450基因cDNA全长,暂命名为 BpCYP26、BpCYP49、BpCYP71、BpCYP161 和 BpCYP194,生物信息、学分析表明,5个基因的开放读码框（open reading frame,ORF）长度分别为1617bp、1557bp、1488bp、1581bp 及 1572bp。BpCYP26、BpCYP49、BpCYP71、BpCYP161 和BpCYP 194蛋白分别与欧洲栓皮栎（QuercussuberL.）CYP72A219、杨梅（Myricarubra）CYP71A1、杨梅（Myricarubra）CYP94C1、阔叶栎（Quercuslobata）CYP82D47 和胡桃（JuglansregiaL.）CYP89A2 蛋白相似性最高,分别为 78%,76%,87%,73%和 80%。5个基因均为CYP450家族中的新成员,被正式命名为CYP72A864、CYP71AN67、CYP94C168、CYP82D320 和 CYP89A290。2.利用实时定量PCR技术,分析BpCYP450和白桦三萜途径关键基因组织特异性及激素、机械损伤处理后表达模式。结果表明,BpCYP49、BpCYP161在茎中表达较高。BpCYP194与BpSE、BpDS有类似的表达模式,均在叶中较高表达;BpCYP26、BpCYP71与BpSS、BpW和BpY基因表达有类似趋势,根中表达较高,BpCYP450和白桦三萜途径关键基因对不同激素的诱导响应模式不同。MeJA主要诱导BpY、BpCYP26、BpSS、BpCYP49、BpDS、BpCYP71、BpW 和 BpCYP194 基因表达。SA 主要诱导 BpCYP26、BpCYP49、BpCYP71、BpCYP161 及 BpDS、BpW、BpY、BpSS 基因表达,GA3主要诱导BpCYP49、Bp CYP71、BpY、BpW基因表达,ABA主要诱导BpCYP26、BpCYP49、BpCPYP71、BpCY194、BpY及BpSE基因表达,机械损伤主要诱导BpCYP49、BpCYP71与BpY、BpDS基因表达。以上结果表明,5个BpCYP450基因与部分三萜合成关键基因对激素诱导存在协同作用。通过PlantCare数据库预测BpCYP450的结合位点和功能,结果发现,5个CYP450基因启动子序列上含基本转录元件TATA-box和CAAT-box,分别调节转录的起始及增强转录效率。5个BpCYP450启动子均具有ABA响应元件ABRE,BpCYP26、BpCYP49及BpCYP71启动子具有MeJA响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif。同时,BpCYP71启动子还具有GA响应元件TATC-box和SA响应元件TCA-element,表明5个BpCYP450基因的表达受激素和胁迫的诱导。3.为进一步验证5个BpCYP450基因在三萜物质合成中的功能,利用瞬时侵染方法将白桦5个BpCYP450基因分别与白桦三萜合成途径基因BpW和BpY在本氏烟草中共表达。在BpW基因过表达时,BpCYP71基因表现催化白桦脂醇和白桦脂酸的生物合成的功能,其中瞬时转化的烟草中白桦脂醇、白桦脂酸含量最高分别可达4.15mg/g、0.6mg/g。在BpCYP450与BpY基因共表达的本氏烟草中,BpCYP26和BpCYP71基因表现具有催化齐墩果酸的功能,且BpCYP71基因具有促进白桦脂醇、齐墩果酸合成的双重功能,其中瞬时转化的烟草中齐墩果酸含量最高可达1.08mg/g。BpCYP450基因均可以显着提高总三萜的含量,在加入Bp W+BpCYP450的所有共表达烟草中,总三萜含量以BpW+BpCYP71基因组合最高,含量为25.07 mg/g,是野生型的5.01倍。在加入BpY+BpCYP450的所有共表达烟草中,总三萜含量以BpY+BpCYP26基因组合最高,含量为21.09 mg/g,为野生型的4.22倍。在转基因烟草和白桦细胞中,再次验证BpCYP26、BpCYP49和BpCYP71基因在齐墩果酸、白桦脂醇的生物合成中发挥重要功能。4.成功的构建了分别含有5个BpCYP450基因的重组酵母,五种重组酵母菌中的总三萜含量均有所提高,并在602-BpW-BpCYP49,602-BpW-BpCYP71检测到白桦脂醇的合成,含量为分别为16.38 mg/L和0.41 mg/L（摇瓶中）。602-BpW-BpCYP71菌株总三萜含量最高,602-BpW-BpCYP49,602-BpW-BpCYP161,602-BpW-BpCYP194 分别具有较好的耐盐性、耐碱及抗寒性。综上结果表明本研究中鉴定了来自白桦的BpCYP71具有催化白桦脂醇、白桦脂酸和齐墩果酸的多重功能,BpCYP26和BpCYP49分别表现出较高效的催化齐墩果酸和白桦脂酸的功能。同时获得了具有合成白桦脂醇及白桦脂酸的工程酵母菌株。该研究为合成生物学合成抗肿瘤白桦三萜化合物奠定了重要基础。
于磊[5]（2021）在《水曲柳DELLA家族基因应答低温胁迫及参与被动休眠调控研究》文中提出水曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr.）属于木犀科梣属落叶乔木,是我国北方珍贵的阔叶树种,具有丰富的抗寒等抗性基因资源,同时胁迫下又会采取被动休眠的方式应对,有文献报道作为赤霉素调控通路的重要节点和负调控因子的DELLA蛋白在耐低温胁迫和诱导休眠中起到关键作用,其在水曲柳耐低温及生长的适应性选择调控研究从未报道。本研究克隆得到DELLA家族FmRGA 1/FmGAI基因及启动子序列,通过生物信息学分析、基因表达模式、转基因以及酵母双杂交等方法对其功能进行研究,解析DELLA在低温胁迫响应中的作用,阐明了DELLA基因能够提高植株抗寒耐受能力,进一步依据DELLA参与赤霉素调控生长的机制,针对水曲柳组培苗移栽后发生休眠导致的幼苗枯死、烂根等移栽障碍建立了赤霉素打破水曲柳离体再生过程中被动休眠有效解决方案,解析了赤霉素通路关键基因DELLA的表达对休眠的调控,为水曲柳组培微繁工厂化育苗技术的推广提供了坚实的保障,为我国水曲柳耐寒研究和遗传改良提供理论基础,主要研究结果如下:1、基于水曲柳转录组数据库筛选,克隆得到水曲柳DELLA家族两个成员:FmRGA1（KX905159.1）全长 1803bp,编码 600 个氨基酸;FmGAI（KX905158.1）全长 1710bp,编码569个氨基酸。保守结构域分析表明FmDELLA蛋白属于DELLA家族。同源序列比对结果显示FmRGA1蛋白与大岩桐、芝麻、烟草的进化地位更加接近,FmGAI蛋白与芝麻、本生烟、马铃薯亲缘关系更近。DELLA基因的表达模式分析结果显示,FmDELLA基因可以短时间内迅速响应低温和NaCl非生物胁迫且对于ABA、GA3、IAA、MeJA、SA和BR等6种激素信号诱导表达模式各不相同,但都具有响应。解析FmDELLA基因的时空表达模式分析得出,FmDELLA基因在水曲柳茎、叶、芽等特定的部位表达并且参与了水曲柳生长周期的调控。亚细胞定位实验结果表明FmDELLA蛋白定位在细胞核。2、FmDELLA基因过表达烟草表现出耐低温和矮化表型。从形态学差异、生理生化指标以及转录表达三个层面分析DELLA转基因烟草在低温胁迫下的功能,实验结果显示FmDELLA基因在0-4℃处理15d时长势明显优于野生型仍然保持着健康的状态,茎叶粗壮、叶片嫩绿,仍然缓慢生长;FmDELLA过表达株系体内MDA、相对电导率和细胞内ROS积累显着低于WT,抗氧化物酶系统（SOD、CAT和POD）、叶绿素、可溶性糖和脯氨酸含量显着高于WT;qRT-PCR分析显示在低温处理下转基因烟草体内多个生理相关基因、冷信号转导通路基因、次生代谢调控基因、开花基因以及激素调控通路基因均上调表达,说明FmDELLA基因过表达增加了下游靶基因的转录,进而影响烟草植株在低温胁迫中的适应性。3、通过染色体步移技术克隆得到FmRGA1基因上游启动子1669bp,FmGAI基因上游启动子1206bp。DELLA基因启动子具有CAAT-box和TATA-box核心元件,8种光诱导元件,7种激素应答元件以及低温、干早等多种非生物胁迫响应元件以及种子、根、茎等多个组织部位表达顺式作用元件。FmDELLA启动子连接GUS报告基因瞬时转化水曲柳,转基因植株GUS染色结果显示,FmDELLA基因启动子在水曲柳茎、叶柄和愈伤等位置活性较高。构建过表达载体瞬时转化水曲柳进行低温处理,对多个信号转导通路基因定量分析结果显示低温抑制赤霉素基因的表达,促进DELLA基因的累积,综上结果表明DELLA启动子具备转录起始功能,响应激素、低温等调控通路,参与多种生物途径,调控生物学过程,增强植物对外界环境的适应能力,增加植株的抗寒性。4、构建FmDELLA过表达/干扰载体瞬时转化水曲柳,经0-4℃低温处理12h后通过qPCR检测冷信号调控相关通路基因的表达水平,FmDELLA基因过表达结果表明水曲柳通过赤霉素和CBF冷信号途径增强耐低温能力。通过酵母双杂交确定DELLA蛋白与GA3、GID1、JAZ、MYBL2、XERICO、ABI5、PIF3、ICE1 等蛋白存在互作,进一步说明DELLA蛋白功能依赖于赤霉素信号途径,参与茉莉酸、脱落酸,转录因子、光和温度等信号途径,调控植物的抗逆功能。5、研究水曲柳种子和芽在休眠/解除休眠关键时期内源激素的变化得出,赤霉素、细胞分裂素和脱落酸均直接参与并调控该生物学进程,分析水曲柳种子成苗过程中GA和ABA通路关键基因的表达结果显示:FmDELLA基因的表达与XERICO、PP2C及DOG1/DOG2基因呈现相同的趋势,说明FmDELLA基因依赖GA途径并通过ABA参与休眠及生长的调控,在胚发育初期和成苗后期,FmDELLA基因的表达量显着降低,说明FmDELLA基因参与水曲柳种子休眠/解除过程中的生长调控。6、进一步解析组培微繁过程中出现的休眠现象与FmDELLA基因表达的关系,结果表明FmDELLA基因的表达在组培苗休眠时期显着高于生长时期。其中FmDELLA基因表达量在培养90d（第一次继代培养后）时达到峰值,RGA1/GAI基因表达量是对照的23.51/12.86倍,此时组培苗出现被动休眠,植株明显出现老化现象,也说明FmDELLA基因参与水曲柳休眠调控。在研究和提出水曲柳组培苗壮苗、生根、炼苗移栽技术和组培苗一步法生根与移栽简化技术前提下,基于组培微繁及移栽后出现被动休眠的现象,建立解除水曲柳组培苗移栽过程中非生理性休眠技术。7、分析在移栽休眠/解除过程中FmDELLA基因表达量的变化,结果显示FmDELLA基因在移栽培养45d时出现表达高峰,此时在休眠芽组织中RGA1/GAI基因表达量是对照的19.29/10.08倍,经GA处理后,FmDELLA基因表达量显着下降,在萌发芽中RGA1/GAI基因表达量是对照的2.34/3.19倍,分别下降了 87.87%和68.35%。说明FmDELLA基因与被动休眠密切相关,且所建立的打破休眠技术是通过调控FmDELLA基因的表达从而实现。综上,水曲柳适应胁迫的机制可能是积累FmDELLA基因产物延缓植物生长,适应和抵御外界环境的变化,通过FmDELLA调控生长与抗逆之间的平衡。
殷金瑶[6]（2020）在《橡胶树白粉菌启动子WY172的克隆、功能鉴定及其对HpaXm的调控分析》文中研究表明受体细胞中外源基因的表达是植物基因工程中的关键问题,启动子是基因表达的重要调控序列之一,是基因表达调控的关键点。本研究中,通过生物信息学分析得到了一个来自橡胶树白粉菌（Oidium heveae B.A.Steinm.）的疑似内源启动子,命名为WY172。通过瞬时表达、GUS染色实验、GUS活性分析等对该启动子功能进行验证,引入外源功能基因HpaXm,通过稳定表达、微过敏、烟草花叶病毒（TMV）接种、实时荧光定量PCR、GUS活性检测等实验对WY172驱动HpaXm基因的表达效果进行探究,并通过诱导元件分析、诱导实验和GUS染色等对WY172的启动子类型进行了分析;采取对WY172启动子上游2K序列进行渐变缺失突变、诱导元件分析和启动子活性分析等方法进行分析,探究WY172是否具有多元化诱导的可能性。主要结果如下:1.获得了重组表达载体pBI121-GFP（转空载体）、pBI121-ACT1（阳性对照）、pBI121-WY172,证明WY172具有启动子功能,可以驱动报告基因GUS的表达,并且在单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中均能发挥启动子作用。2.构建了pBI121-WY172-HpaXm及带有35S的pBI121-HpaXm（阳性对照）植物表达载体,转化获得相应的转基因烟草。微过敏和TMV接种实验证明WY172能够有效地驱动外源功能基因HpaXm的表达,其转基因植物的过敏性反应和抗病性强于阳性对照。同时,这个结果也预示TMV可能诱导WY172的表达,WY172可能是诱导性启动子。3.生物信息学分析,WY172具有生长素响应元件,同时具有光响应元件和两个未知功能的顺式作用元件。诱导实验及qRT-PCR等证明,生长素能够很好诱导WY172的表达,说明WY172可能是一种IAA诱导型启动子。4.克隆了橡胶树白粉菌启动子WY172上游2K序列上4个不同长度缺失片段,GUS染色及酶活性测定结果均显示所有缺失突变片段都具有调控基因表达的启动子活性,且启动活性均强于35S启动子,其中WY172Q3调控GUS基因表达的活性最高。同时发现,WY172启动子上游2K序列具有茉莉酸甲酯响应、赤霉素响应、低温响应等丰富的顺式作用元件。综上所述,本研究得到了橡胶树白粉菌内源启动子WY172,它在单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中均能高效表达,并且可能受IAA和TMV的双重诱导,可能具有广泛宿主范围和很高应用潜力。
金小煜[7]（2020）在《全基因组水平紫花苜蓿铜转运（COPT/Ctr）基因家族的鉴定及功能分析》文中进行了进一步梳理在全球范围内,土壤重金属污染成为限制作物产量及品质的主要因素之一。面对土壤污染的不利现状,植物在生长发育过程中演化出多种不同抵御机制。其中,铜转运（Copper transporter）蛋白在重金属离子吸收、转运、分配等过程中发挥重要作用。紫花苜蓿具有较好的铜富集性和耐受性,体内可以产生复杂的耐受解毒机制,可作为铜污染土壤的植物修复材料。然而,COPT/Ctr在多年生紫花苜蓿研究中未见报道,它们能否在响应铜离子胁迫方面起到关键作用仍不清楚。本研究以蒺藜苜蓿、拟南芥、水稻、大豆中的COPT蛋白序列为参考序列鉴定到12个紫花苜蓿COPT蛋白,进一步分析了该家族系统进化关系、基因结构、蛋白网络互作、表达模式以及跨膜结构（3D模型）,进而鉴定研究紫花苜蓿中的功能COPT/Ctr家族成员,以期为培育紫花苜蓿耐性品种,提高抗逆能力奠定基础。本研究取得以下的结果:1.在紫花苜蓿全基因组数据库内筛选获得12个紫花苜蓿COPT/Ctr转运体家族成员序列,按照蛋白ID号大小依次命名并将其进行亚族分类。COPT/Ctr理化性质预测表明,MsCOPT蛋白长度,分子量,等电点,脂肪族指数等的范围跨度比较大,且MsCOPT蛋白属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测COPT/Ctr转运蛋白均位于细胞膜上。多序列比对发现MsCOPT蛋白具有三个跨膜结构域（TMD1、TMD2和TMD3）。2.系统进化分析结果显示COPT/Ctr转运体分为A（9个）和B（3个）两个亚族,A亚族又进一步可划分为A1、A2和A3亚组。序列分析发现TMD2中含有保守的MxxxM基序,TMD3中含有保守的GxxxG基序,但Met-motif和CxC基序并非在所有COPT/Ctr序列中都保守。3.基因结构分析结果表明,MsCOPT基因内含子数目在09之间不等,同一亚族之间基因结构较为相似,在不同亚族之间差异较大。MEME分析结果显示几乎所有成员中都含有Motif 1和Motif 2。除此之外,各亚族还有一些家族特征基序。4.组织表达模式分析表明MsCOPT基因表达模式具有组织表达特异性,其中MsCOPT2/5/8为根瘤特异性,MsCOPT7/9/11/12为根特异性。5.酵母异源表达分析表明,两个根特异性表达MsCOPT7和MsCOPT11基因具有优先选择铜离子的能力,可能是紫花苜蓿在响应铜离子胁迫过程中发挥关键作用的基因。6.PMsCOPT7启动子区共识别到32种顺式作用元件,除了一些基础作用元件之外,包含了较多的逆境应答、激素响应、生长发育等相关顺式作用元件。通过浸花法转化拟南芥表明PMsCOPT7为根特异性启动子。COPT/Ctr蛋白作为植物中最重要的转运重金属离子的家族之一,参与花粉发育、体内贮存铜的输出和植物组织中铜的再分配等过程,尤其是一些根特异性COPTs在植物遭遇重金属胁迫时首当其冲。本文集中探讨了紫花苜蓿铜转运基因在酿酒酵母中的转运功能以及分析了MsCOPT基因的表达模式,为深入理解紫花苜蓿COPTs功能,即COPTs在紫花苜蓿转运铜离子调节过程中发挥的功能提供了科学基础,同时也可为挖掘紫花苜蓿铜转运功能基因及培育耐铜品种提供候选基因。
任春涛[8]（2019）在《MdERF2基因启动子的克隆及其转录活性分析》文中研究指明苹果是典型的呼吸跃变型果实,在其生长发育过程中,乙烯起了至关重要的作用。ERF家族转录因子属于乙烯信号通路中直接对靶基因起作用的关键因子,而MdERF2基因是乙烯调控苹果果实发育与品质的重要的转录因子,但目前对于乙烯调控MdERF2的机理及效果仍然不能确定,本文分析了MdERF2基因启动子序列特性,并利用含β-葡萄糖苷酸酶（GUS）和绿色荧光蛋白（GFP）的瞬时表达载体,双重研究和验证了乙烯及其抑制剂1-MCP对MdERF2基因启动子的调控模式,主要结果如下:采用PCR技术扩增MdERF2基因启动子,序列分析表明,扩增获得的启动子全长为1348 bp。利用Plant CARE和PLACE数据库分析基因启动子中所含有的顺式作用元件,发现具有TATA框和CAAT框等基础元件,还具有GARE-motif、CCAAT-box、Box4、GT1-motif和MBS等其它元件。构建pRI-ProMdERF2-GUS启动子瞬时表达载体,采用农杆菌介导法瞬时转化番茄果实和叶片来验证启动子的活性。结果表明:由Pro MdERF2驱动的GUS基因,在1-MCP、乙烯利以及空白的三种处理下,番茄果实和叶片均呈现蓝色,蓝色较阳性对照浅,但三种处理条件下的蓝色差别不明显,表明Pro MdERF2具有转录激活活性,活性不如Ca MV35S启动子。构建pRI-ProMdERF2-GFP瞬时表达载体,利用PEG诱导法瞬时转染烟草原生质体来验证Pro MdERF2的活性。结果表明:由Pro MdERF2驱动的GFP基因,在1-MCP、乙烯利以及空白的三种处理下,烟草原生质体均具有荧光信号,但三种处理条件下的荧光信号差别不明显,也表明Pro MdERF2具有转录激活活性,具备启动子的基本功能。
苏佩佩[9]（2019）在《小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究》文中研究表明小麦（Triticum aestivum L.）是世界第二大粮食作物,小麦籽粒作为人类重要的主食之一,是全球超过35%的人类每日所需蛋白质和热量的主要来源。植物组织特异性表达基因和启动子研究一方面有助于预测基因的功能,深入了解植物生长发育过程中基因的表达调控规律,另一方面启动子更是植物基因工程研究的重要工具。但单子叶植物特别是小麦中组织特异性基因和启动子的研究远远落后于其他禾本科作物,比如水稻。本文对小麦组织特异性基因及启动子进行了筛选和分析,利用组织特异性启动子构建了雄性不育系,并尝试利用小麦组织特异性启动子创建小麦无损伤可视化筛选方法;另外还在水稻中分离鉴定了小麦花粉特异性表达基因Ta PSG076的同源基因Os PSG076的启动子,构建了用于Os PSG076基因功能验证的植物表达载体并得到了转基因水稻株系。主要研究结果如下:（1）分析了NCBI公共数据库中小麦胚芽鞘、根、叶、雌蕊、雄蕊、胚、和胚乳七个组织中基因表达的芯片数据,共发现了604个探针代表的基因表现出组织特异性特征。进一步将其中的330个基因进行了小麦染色体定位,发现具有相同组织特异性的基因往往成簇分布在染色体上,并且有些基因的序列被定位在不同的染色体上呈现多拷贝现象。（2）为了验证芯片数据分析结果的可靠性,利用RT-sq PCR和RT-q PCR方法证实了其中36个候选基因表达的组织特异性,实验结果与芯片数据表现出高度一致性。在此基础上,构建了p Col1::GUS,p Root2::GUS和p Leaf1::GUS的植物表达载体,通过农杆菌介导的转化技术,瞬时侵染小麦胚芽鞘,证明Ta Col1启动子可以驱动gus基因在小麦胚芽鞘中瞬时表达。同样采用农杆菌转化技术,获得了p Root2::GUS和p Leaf1::GUS的转基因拟南芥植株。经GUS组织化学检测,证明Ta Root2启动子在拟南芥中表现为根特异性调控模式,而Ta Leaf1启动子在拟南芥叶片中优势表达。（3）利用候选的小麦根特异性启动子Ta Root7和已报道的1Dx5胚乳特异性启动子,分别构建p Root7::Ds Red和1Dx5::Ds Red表达载体,利用基因枪转化,获得了转基因小麦株系,并建立了小麦无损伤可视化筛选方法。（4）利用本实验室克隆鉴定的小麦花粉特异性启动子Ta PSG076构建了Ta PSG076::Barnase（p14B）表达载体,利用基因枪转化,获得了转基因小麦株系,用以创制小麦雄性不育系。（5）基于本实验室分离鉴定的小麦花粉特异性启动子Ta PSG076,分离鉴定了水稻中的同源基因Os PSG076的上游启动子,构建了987 bp该启动子序列的表达载体Os PSG076::GUSplus,利用农杆菌介导的转化技术进行水稻的遗传转化,获得了转基因水稻株系。经过GUS组织化学染色发现,Os PSG076启动子在水稻的花粉中特异表达,且表达强度很高,证实Os PSG076启动子是水稻花粉特异性启动子。（6）构建了Os PSG076基因的过表达（OE）、RNA干扰（RNAi）、基因编辑（CRISPR/Cas9）植物表达载体并获得了水稻转基因株系。综上所述,本文通过高通量分析鉴定了小麦中七个组织的特异性基因,这些结果有助于了解相关未知基因的功能,为小麦组织特异性启动子的挖掘提供了新的资源。对其中三个启动子进行了功能验证,并进行了小麦组织特异性启动子的应用研究。此外,还分离鉴定了一个水稻花粉特异性基因启动子Os PSG076,并获得了可对Os PSG076基因进行功能验证的水稻转基因材料。这些结果证实了本文中组织特异性启动子筛选方法的可行性,及组织特异性启动子的潜在应用价值。
陈亚东[10]（2019）在《用于棉花抗黄萎病育种的根系特异性启动子的克隆与应用》文中进行了进一步梳理棉花是我国重要的经济作物,大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病一直严重影响着棉花的产量与品质。由于棉花抗黄萎病种质资源的匮乏,传统育种和栽培技术的改进并不能有效对棉花黄萎病进行预防和控制。因此通过现代基因工程技术选育抗病新品种是提高棉花黄萎病抗性的最有效方式。根特异性启动子可以使外源基因仅在受体植物的根部特异表达,从而减少外源基因在受体植物中非特异性表达所造成的浪费以及杜绝外源基因多部位表达对受体植物正常生长的干扰,但现阶段对于棉花根特异性启动子的研究还较为少见。本研究根据已报道的根特异性基因设计引物,利用PCR扩增技术从棉花中克隆获得了四个启动子MIC-3、WRK Y54、TIP-2和PRP-2。启动子序列分析结果表明,四种启动子中都含有ROOTMOTIFTA POX1、OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE等根特异性表达元件,推测四种启动子为根特异性启动子,其均能够驱动外源基因在植物根部特异性表达。本研究以双元表达载体pCOMBIA1301为模板,通过酶切-连接的方式将pCOMBIA1301载体中的组成型启动子CaMV35S替换为四种棉花根特异性启动子,从而获得了棉花根特异性启动子驱动G US基因表达的重组表达载体,分别命名为MIC-3::GUS、WRKY54::GUS、TIP-2::GUS和PRP-2::GUS,通过根癌农杆菌介导法将重组表达载体转化拟南芥。对转基因植株进行GUU S组织化学染色,结果表明GUS报告基因主要在转基因植株的根部特异性表达,说明MI C-3、WRKY54、TIP-2和PRP-2四种启动子具有较强的根特异表达性。BTD-S为本实验室研究设计的人工合成抗菌肽基因,其对棉花黄萎病具有显着的抗病功能。本研究以重组表达载体MIC-3::GUS为模板,通过酶切-连接的方式将MIC-3::GUS表达载体中的GUS报告基因替换为人工合成抗菌肽基因BTD-S,从而获得了 MIC-3启动子驱动人工抗菌肽基因BTD-S的重组表达载体,命名为MIC-3::BTD-S,通过根癌农杆菌介导法将其转化拟南芥。对转基因植株中的BTD-S抗菌肽基因表达水平进行定量RT-PCR分析,结果表明BTD-S抗菌肽基因主要在转基因植株的根部表达,其根部表达量明显高于叶片等部位,说明MIC-3启动子能够驱动BTD-S抗菌肽基因在植物根部的特异性表达。对转基因植株进行离体抑菌效果鉴定,其结果表明转基因植株根部蛋白粗提取液能够有效抑制大丽轮枝菌菌丝及孢子的生长,说明MIC-3启动子能够驱动BTD-S抗菌肽基因在植物根部产生棉花黄萎病抗性。
二、根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析（论文提纲范文）
（1）巨球百合细胞壁转化酶基因及其启动子功能初探（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 淀粉-蔗糖代谢酶相关研究 |
| 1.1.1 蔗糖代谢及其在植物发育中的作用 |
| 1.1.2 细胞壁转化酶及其在植物中的作用 |
| 1.1.3 细胞壁转化酶基因启动子与上游调控因子的相关研究 |
| 1.2 启动子概述 |
| 1.2.1 启动子结构 |
| 1.2.1.1 核心结构区 |
| 1.2.1.2 上游调控区 |
| 1.2.2 启动子的分类 |
| 1.2.2.1 组成型启动子 |
| 1.2.2.2 组织特异性启动子 |
| 1.2.2.3 诱导性启动子 |
| 1.3 启动子的功能分析方法 |
| 1.3.1 生物信息学分析 |
| 1.3.2 缺失体分析 |
| 1.3.3 瞬时表达分析 |
| 1.3.4 稳定表达分析 |
| 1.3.5 常用报告基因 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 基于转录组数据的关键细胞壁转化酶基因筛选及表达分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 LbgCWIN1 基因进化树分析 |
| 2.2.2 巨球百合二三代结合转录组共表达分析 |
| 2.2.2.1 数据来源 |
| 2.2.2.2 模块分析 |
| 2.2.2.3 基因共表达网络分析 |
| 2.2.3 LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.2.3.1 巨球百合不同组织LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.2.3.2 不同蔗糖浓度巨球百合LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 LbgCWIN1 基因进化树分析 |
| 2.3.2 巨球百合三代转录组共表达分析 |
| 2.3.3 LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.3.3.1 巨球百合不同组织LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.3.3.2 不同蔗糖浓度处理下LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 LbgCWIN1 基因克隆与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 LbgCWIN1 基因全长克隆 |
| 3.2.1.1 巨球百合基因组DNA提取(试剂盒法) |
| 3.2.1.2 目的片段获取 |
| 3.2.1.3 目的片段切胶回收 |
| 3.2.1.4 目的片段连接克隆载体 |
| 3.2.1.5 重组载体转化大肠杆菌 |
| 3.2.1.6 序列测定与分析 |
| 3.2.2 LbgCWIN1 基因亚细胞定位 |
| 3.2.2.1 亚细胞定位载体构建 |
| 3.2.2.2 质粒提取(试剂盒法) |
| 3.2.2.3 冻融法转化农杆菌 |
| 3.2.2.4 农杆菌注射烟草及染色方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 LbgCWIN1 基因克隆 |
| 3.3.2 LbgCWIN1 基因序列分析 |
| 3.3.3 LbgCWIN1 基因亚细胞定位 |
| 3.3.3.1 亚细胞定位载体构建 |
| 3.3.3.2 亚细胞定位载体转化农杆菌 |
| 3.3.3.3 亚细胞定位载体转化烟草 |
| 3.4 讨论 |
| 4 LbgCWIN1 基因启动子克隆及功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 染色体步移法克隆LbgCWIN1 基因启动子 |
| 4.2.2 LbgCWIN1 基因启动子元件分析 |
| 4.2.3 LbgCWIN1 基因启动子5’端缺失载体构建 |
| 4.2.3.1 LbgCWIN1 基因启动子5’端缺失片段获取 |
| 4.2.3.2 重组载体构建 |
| 4.2.4 启动子5’端缺失载体功能验证 |
| 4.2.4.1 启动子5’端缺失载体 |
| 4.2.4.2 瞬时转化烟草GUS染色 |
| 4.2.4.3 瞬时转化烟草GUS活性检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 LbgCWIN1 基因启动子克隆 |
| 4.3.2 LbgCWIN1 基因启动子元件分析 |
| 4.3.3 LbgCWIN1 基因启动子缺失载体构建 |
| 4.3.3.1 LbgCWIN1 基因启动子5’端缺失片段获取 |
| 4.3.3.2 重组载体构建 |
| 4.3.4 启动子5’端缺失载体功能验证 |
| 4.3.4.1 启动子5’端缺失载体转化农杆菌 |
| 4.3.4.2 启动子5’端缺失载体转化烟草 |
| 4.3.4.3 瞬时转化烟草GUS染色 |
| 4.3.4.4 瞬时转化烟草GUS活性检测 |
| 4.4 讨论 |
| 5 LbgCWIN1 基因过表达与异源验证 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 菌株与载体 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 LbgCWIN1 基因过表达载体构建 |
| 5.2.2 野生型拟南芥潮霉素抗性筛选 |
| 5.2.3 浸花法转化拟南芥 |
| 5.2.4 转基因拟南芥筛选 |
| 5.2.4.1 T1 代转基因拟南芥抗性筛选 |
| 5.2.4.2 T2 代转基因拟南芥抗性筛选 |
| 5.2.4.3 T3 代转基因拟南芥抗性筛选 |
| 5.2.5 转基因拟南芥功能验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 LbgCWIN1 基因过表达载体构建 |
| 5.3.2 拟南芥潮霉素抗性筛选 |
| 5.3.3 LbgCWIN1 基因过表达载体转化拟南芥 |
| 5.3.4 转基因拟南芥后代筛选 |
| 5.3.4.1 T1 代筛选 |
| 5.3.4.2 T2 代筛选 |
| 5.3.4.3 T3 代筛选 |
| 5.3.5 转基因拟南芥功能验证 |
| 5.4 讨论 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（2）黄花苜蓿MfNAC87和MfNAC63基因的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 一 引言 |
| 1.1 黄花苜蓿的研究概况 |
| 1.1.1 黄花苜蓿的分布及植物学特征 |
| 1.1.2 黄花苜蓿适应非生物胁迫的研究 |
| 1.2 NAC家族转录因子的研究概况 |
| 1.2.1 NAC转录因子的结构特征 |
| 1.2.2 NAC转录因子的生物学功能 |
| 1.3 启动子的研究概况 |
| 1.3.1 组成型启动子 |
| 1.3.2 组织特异性启动子 |
| 1.3.3 诱导型启动子 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 二 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 植株材料 |
| 2.1.4 生化试剂及引物序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 MfNAC87 基因ORF的克隆 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.2.3 MfNAC87 亚细胞定位分析 |
| 2.2.4 MfNAC87 的转录激活功能验证 |
| 2.2.5 MfNAC87 过表达载体的构建 |
| 2.2.6 转MfNAC87、MfNAC63 基因拟南芥的筛选及鉴定 |
| 2.2.7 转MfNAC87、MfNAC63 基因拟南芥对非生物胁迫的耐受性分析 |
| 2.2.8 MfNAC87、MfNAC63 启动区序列信息的获得 |
| 2.2.9 MfNAC63 基因启动子区克隆及其驱动基因的表达分析 |
| 三 结果与分析 |
| 3.1 MfNAC87 基因克隆 |
| 3.1.1 PCR扩增 |
| 3.1.2 序列分析 |
| 3.2 生物信息学分析 |
| 3.2.1 同源性对比分析 |
| 3.2.2 MfNAC87 亚细胞定位的预测 |
| 3.2.3 MfNAC87 蛋白的三级结构预测 |
| 3.3 MfNAC87 亚细胞定位分析 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 转化农杆菌GV3101 的鉴定 |
| 3.3.3 MfNAC87 亚细胞定位观察结果 |
| 3.4 MfNAC87 的转录激活功能验证 |
| 3.4.1 载体构建 |
| 3.4.2 转化酵母菌AH109 的验证 |
| 3.4.3 转录激活分析 |
| 3.5 MfNAC87、MfNAC63 基因转化拟南芥 |
| 3.5.1 重组质粒p PZP221(35S-MfNAC87-NOS)的构建 |
| 3.5.2 转化农杆菌的鉴定 |
| 3.5.3 转MfNAC87、MfNAC63 基因拟南芥的筛选及鉴定 |
| 3.6 转MfNAC87、MfNAC63 基因拟南芥的表型分析 |
| 3.7 MfNAC87、MfNAC63 的启动区序列信息的获得与分析 |
| 3.8 MfNAC63 启动子克隆及其驱动基因的表达分析 |
| 3.8.1 PCR扩增 |
| 3.8.2 表达载体pORER1-pro._(MfNAC63)::GUS的构建 |
| 3.8.3 转化农杆菌的鉴定 |
| 3.8.4 转基因拟南芥的筛选及鉴定 |
| 3.8.5 转基因拟南芥的GUS组织化学染色检测 |
| 四 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）三七茉莉酸响应WRKY转录因子的分离与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物防御机制概述 |
| 1.2 WRKY转录因子 |
| 1.2.1 WRKY转录因子的结构特点 |
| 1.2.2 WRKY转录因子基因的表达模式 |
| 1.2.3 WRKY调控植物的生长发育及防卫反应 |
| 1.3 茉莉酸信号途径 |
| 1.3.1 茉莉酸信号途径概述 |
| 1.3.2 茉莉酸信号途径调控植物的生长发育以及对非生物和生物胁迫的反应 |
| 1.4 WRKY转录因子与激素信号共同调节植物的防御反应 |
| 1.5 三七根腐病的危害及研究现状 |
| 1.5.1 三七根腐病的危害 |
| 1.5.2 三七根腐病的研究现状 |
| 1.6 本课题的研究目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 三七WRKY转录因子基因家族的克隆及表达特性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物材料及处理 |
| 2.3.2 RNA的提取 |
| 2.3.3 转录组测序 |
| 2.3.4 三七cDNA的合成 |
| 2.3.5 三七WRKY基因的克隆 |
| 2.3.6 生物信息学分析 |
| 2.3.7 qRT-PCR |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 三七WRKY基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.4.2 三七WRKY基因协同JA途径参与对茄腐镰刀菌的防卫反应 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 三七PnWRKY9基因的功能及转录调控机制分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PnWRKY9蛋白序列分析 |
| 3.3.2 亚细胞定位分析 |
| 3.3.2.1 PnWRKY9的ORF扩增 |
| 3.3.2.2 构建PnWRKY9-GFP融合表达载体 |
| 3.3.2.3 融合表达载体在洋葱表皮细胞中的定位分析 |
| 3.3.3 PnWRKY9转基因烟草的产生及分析 |
| 3.3.3.1 植物超表达载体的构建 |
| 3.3.3.2 超表达载体转化农杆菌LBA4404感受态并浸染烟草 |
| 3.3.3.3 转基因烟草的产生及筛选 |
| 3.3.3.4 PnWRKY9转基因烟草分析 |
| 3.3.4 RNAi |
| 3.3.4.1 RNAi载体的构建 |
| 3.3.4.2 RNAi载体在三七叶片中的瞬时表达及分析 |
| 3.3.5 PPnDEFL1启动子的克隆及分析 |
| 3.3.6 原核表达及凝胶阻滞分析 |
| 3.3.6.1 构建pET-32a-PnWRK9表达载体 |
| 3.3.6.2 外源蛋白的诱导及纯化 |
| 3.3.6.3 EMSA实验 |
| 3.3.7 酵母单杂交 |
| 3.3.7.1 启动子诱饵载体构建 |
| 3.3.7.2 猎物载体的构建 |
| 3.3.7.3 诱饵载体和猎物载体转化酵母感受态 |
| 3.3.7.4 .验证反式激活特性 |
| 3.3.8 PnWRKY9与PPnDEFL1启动子的互作分析 |
| 3.3.8.1 构建pBI121-PPnDEFL1重组载体 |
| 3.3.8.2 启动子转化PnWRKY9转基因烟草 |
| 3.3.8.3 共表达转基因烟草的获得及分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 PnWRKY9蛋白序列分析 |
| 3.4.2 PnWRKY9蛋白是细胞核定位蛋白 |
| 3.4.3 PnWRKY9转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性增强 |
| 3.4.4 PnWRKY9RNAi片段表达的三七增强了对茄腐镰刀菌的敏感性 |
| 3.4.5 三七防御素基因的启动子克隆及顺式作用元件分析 |
| 3.4.6 PnWRKY9蛋白能专一性结合W-box |
| 3.4.7 PnWRKY9激活PnDEFL1的转录 |
| 3.4.8 PPnDEFL1与PnWRKY9在烟草中共表达 |
| 3.4.9 共表达转基因烟草的GUS活性显着增强 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 PnWRKY9蛋白的特殊结构和亚细胞定位决定其特定的功能 |
| 3.5.2 反向遗传学技术验证了PnWRKY9正调控对茄腐镰刀菌的防卫反应 |
| 3.5.3 PnWRKY9通过W-box与顺势作用元件结合发挥转录激活作用 |
| 3.5.4 PnWRKY9结合PPnDEFL1启动子序列,正调控PnDEFL1的表达从而参与对茄腐镰刀菌的防卫反应 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 主要材料来源 |
| 附录B PnDEFL1基因序列 |
| 附录C PPnDEFL1启动子序列 |
| 附录D 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）BpCYP49、BpCYP71基因在白桦脂醇合成中的功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 萜类化合物及代谢途径 |
| 1.2.2 细胞色素P450研究进展 |
| 1.2.3 细胞色素P450在植物三萜骨架修饰中的家族分布 |
| 1.2.4 细胞色素P450对激素诱导的响应 |
| 2 BpCYP450基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 BpCYP450基因克隆 |
| 2.2.2 BpCYP450基因生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 BpCYP450基因与三萜合成关键基因表达特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 BpCYP450基因与三萜合酶基因组织特异性表达分析 |
| 3.2.2 BpCYP450基因与三萜合酶基因在激素诱导下的表达模式 |
| 3.2.3 BpCYP450基因启动子序列分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 BpCYP450在烟草中对三萜合成的影响及亚细胞定位 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 pNC-Green-SubC-BpCYP450过表达载体构建及农杆菌转化 |
| 4.2.2 pNC-Cam1304-35S-BpCYP450过表达载体构建及农杆菌转化 |
| 4.2.3 不同BpCYP450过表达对本氏烟草中总三萜及组分含量的影响 |
| 4.2.4 洋葱表皮中的亚细胞定位 |
| 4.2.5 BpCYP450基因遗传转化与转基因烟草的鉴定 |
| 4.2.6 BpCYP450转基因烟草对三萜合成的影响 |
| 4.2.7 不同BpCYP450过表达对白桦悬浮细胞组分含量的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 5个BpCYP450基因在酿酒酵母中的表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料与试剂 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BpCYP450在酿酒酵母的过表达及三萜产物分析 |
| 5.2.2 重组酵母抗逆性分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学 硕士学位论文修改情况确认表 |
（5）水曲柳DELLA家族基因应答低温胁迫及参与被动休眠调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物响应低温胁迫的应答 |
| 1.3 林木休眠调控研究简介 |
| 1.4 高等植物中DELLA蛋白研究进展 |
| 1.4.1 DELLA蛋白的结构和修饰 |
| 1.4.2 DELLA蛋白参与多种激素信号转导 |
| 1.4.3 DELLA蛋白在非生物胁迫下的研究 |
| 1.4.4 DELLA蛋白在植物生长发育中的研究 |
| 1.5 水曲柳无性繁殖技术研究现状 |
| 1.6 研究的目的意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 FmDELLA家族基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 水曲柳DELLA家族基因鉴定 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA的合成 |
| 2.2.4 水曲柳DELLA基因编码区的克隆 |
| 2.2.5 目的基因与pEAZY-T5载体连接与转化 |
| 2.2.6 DELLA蛋白生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 FmDELLA基因的克隆 |
| 2.3.2 蛋白结构分析 |
| 2.3.3 DELLA的系统进化分析 |
| 2.3.4 DELLA蛋白生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 FmDELLA基因的表达特征及抗寒功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 水曲柳DELLA基因的非生物胁迫与激素诱导表达分析 |
| 3.2.2 水曲柳DELLA基因的时空表达分析 |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR反应 |
| 3.2.4 DELLA蛋白亚细胞定位 |
| 3.2.5 表达载体的构建 |
| 3.2.6 三亲杂交法制备农杆菌 |
| 3.2.7 农杆菌介导的本氏烟草遗传转化 |
| 3.2.8 转基因本氏烟草鉴定及扩繁 |
| 3.2.9 转基因烟草耐低温分析 |
| 3.2.10 转基因烟草生理生化测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 FmDELLA基因的表达模式分析 |
| 3.3.2 FmDELLA蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.3 FmDELLA基因植物表达载体构建 |
| 3.3.4 FmDELLA转基因烟草植株的鉴定及表型分析 |
| 3.3.5 FmDELLA过表达烟草植株的抗寒分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 FmDELLA启动子克隆及抗寒功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 水曲柳基因组DNA提取 |
| 4.2.2 水曲柳DELLA基因的启动子克隆 |
| 4.2.3 启动子元件预测 |
| 4.2.4 启动子活性及表达分析 |
| 4.2.5 启动子和基因共转化抗寒功能分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 FmDELLA基因启动子的克隆 |
| 4.3.2 FmDELLA启动子生物信息学分析 |
| 4.3.3 FmDELLA启动子表达载体构建 |
| 4.3.4 FmDELLA启动子活性检测 |
| 4.3.5 FmDELLA启动子和基因共转化水曲柳的抗寒转录分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 FmDELLA应答低温调控及互作蛋白研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 过表达DELLA瞬时转化水曲柳 |
| 5.2.2 RNAi干扰载体的构建 |
| 5.2.3 酵母感受态的制备 |
| 5.2.4 诱饵载体转化酵母感受态 |
| 5.2.5 诱饵载体毒性与自激活检测 |
| 5.2.6 阳性克隆及验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 FmDELLA过表达载体构建及瞬时转化水曲柳 |
| 5.3.2 FmDELLA抑制表达载体构建 |
| 5.3.3 FmDELLA瞬时转化水曲柳的表达分析 |
| 5.3.4 在低温胁迫下转基因水曲柳冷调控相关基因的表达分析 |
| 5.3.5 FmDELLA与FmJAZs在低温调控中的表达研究 |
| 5.3.6 FmDELLA蛋白与低温相关通路蛋白的互作 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 DELLA介导GA在水曲柳休眠及生长的调控研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 植物内源激素提取和分析 |
| 6.2.2 水曲柳种子消毒及组培微繁 |
| 6.2.3 水曲柳组培苗生根培养 |
| 6.2.4 水曲柳组培苗移栽 |
| 6.2.5 外源喷施赤霉素解除水曲柳移栽苗顶芽休眠 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 水曲柳休眠关键时期内源激素含量变化与GA的作用分析 |
| 6.3.2 FmDELLA基因在水曲柳种子成苗过程中的表达模式 |
| 6.3.3 组培微繁中的休眠现象与DELLA基因的表达 |
| 6.3.4 水曲柳组培微繁苗木的壮苗生根与移栽技术 |
| 6.3.5 移栽苗的休眠现象与解除休眠技术的建立 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（6）橡胶树白粉菌启动子WY172的克隆、功能鉴定及其对HpaXm的调控分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 启动子结构 |
| 1.1.1 原核生物启动子结构 |
| 1.1.2 真核生物启动子结构 |
| 1.2 启动子分类 |
| 1.2.1 组成型启动子 |
| 1.2.2 组织特异型启动子 |
| 1.2.3 诱导型启动子 |
| 1.3 丝状真菌启动子研究进展 |
| 1.3.1 丝状真菌启动子简述 |
| 1.3.2 曲霉属的glaA启动子 |
| 1.3.3 构巢曲霉的gpdA启动子 |
| 1.4 启动子分析方法 |
| 1.4.1 生物信息学预测 |
| 1.4.2 酵母单杂分析 |
| 1.4.3 瞬时表达 |
| 1.4.4 稳定表达 |
| 1.5 HpaXm蛋白的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.6.1 研究的目的 |
| 1.6.2 研究的意义 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株、质粒 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172的功能验证 |
| 2.2.1 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的克隆 |
| 2.2.2 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的载体构建 |
| 2.2.3 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的活性检测 |
| 2.3 WY172 驱动外源功能基因HpaXm在烟草中的稳定表达 |
| 2.3.1 植物表达载体pBI121-172-HpaXm的构建 |
| 2.3.2 转基因烟草的获得 |
| 2.3.3 T1 代转基因烟草的微过敏反应测试和TMV抗性分析 |
| 2.4 WY172 启动子类型分析 |
| 2.4.1 WY172 转基因烟草的获得及GUS染色 |
| 2.4.2 WY172 诱导类型分析 |
| 2.4.3 GUS染色 |
| 2.5 渐变缺失突变分析WY172 不同长度片段表达活性 |
| 2.5.1 生物信息学分析 |
| 2.5.2 WY172 启动子不同长度片段的克隆 |
| 2.5.3 WY172 启动子不同长度片段瞬时表达载体的构建 |
| 2.5.4 三亲杂交法转化农杆菌菌株 |
| 2.5.5 GUS染色 |
| 2.5.6 GUS酶活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 橡胶树白粉菌疑似启动子WY172 的克隆及功能鉴定 |
| 3.1.1 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的载体构建 |
| 3.1.2 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的功能验证 |
| 3.2 WY172 驱动HpaXm基因在烟草中的稳定表达 |
| 3.2.1 植物表达载体pBI121-172-HpaXm的构建及转基因烟草的获得 |
| 3.2.2 T1 代转基因烟草m HR分析 |
| 3.2.3 T1 代转基因烟草TMV抗性分析 |
| 3.3 WY172 启动子类型分析 |
| 3.3.1 顺式作用元件分析 |
| 3.3.2 WY172 启动子类型分析 |
| 3.4 渐变缺失突变分析WY172 不同长度片段表达活性 |
| 3.4.1 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的生物信息学分析 |
| 3.4.2 WY172 启动子不同长度片段的克隆 |
| 3.4.3 WY172 启动子不同长度片段瞬时表达载体的构建 |
| 3.4.4 GUS染色 |
| 3.4.5 GUS酶活性测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 启动子的功能验证 |
| 4.2 启动子的类型分析 |
| 4.3 启动子上游序列的活性分析 |
| 5 结论 |
| 5.1 本研究主要结论 |
| 5.2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）全基因组水平紫花苜蓿铜转运（COPT/Ctr）基因家族的鉴定及功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 植物响应铜离子概述 |
| 2.1.1 铜离子特性 |
| 2.1.2 植物响应铜研究进展 |
| 2.1.3 紫花苜蓿响应铜离子生物学研究进展 |
| 2.2 COPT蛋白家族概述 |
| 2.2.1 COPT蛋白结构 |
| 2.2.2 植物COPT蛋白研究进展 |
| 2.2.3 植物COPT表达调控研究进展 |
| 2.3 本研究的目的意义和技术路线图 |
| 2.3.1 目的和意义 |
| 2.3.2 技术路线图 |
| 第三章 紫花苜蓿COPT基因家族的全基因组鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 序列检索 |
| 3.3 紫花苜蓿COPT基因鉴定 |
| 3.3.1 数据获取及序列鉴定 |
| 3.3.2 进化分类、命名及基因结构 |
| 3.3.3 多序列比对和蛋白保守MOTIF分析 |
| 3.3.4 网络结构及表达模式分析 |
| 3.3.5 COPT蛋白3D结构和理化性质分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 COPT基因家族鉴定与分类 |
| 3.4.2 COPT蛋白的3D结构及理化性质分析 |
| 3.4.3 MSCOPT蛋白序列保守性分析 |
| 3.4.4 MSCOPT蛋白网络互作关系分析 |
| 3.4.5 MSCOPT基因的组织表达模式分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 紫花苜蓿MSCOPT7和MSCOPT11 基因的克隆与功能分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌株、质粒和载体 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RNA提取及反转录 |
| 4.3.2 目的基因的克隆 |
| 4.3.3 目的片段的纯化 |
| 4.3.4 线性片段的获得 |
| 4.3.5 载体片段的胶回收 |
| 4.3.6 酵母表达载体的构建 |
| 4.3.7 酵母表达载体质粒抽提 |
| 4.3.8 酵母感受态细胞的制备与转化 |
| 4.3.9 全酵母转化体的诱导 |
| 4.3.10 酵母异源表达功能验证 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 紫花苜蓿COPT基因CDNA全长序列的获得 |
| 4.4.2 COPT基因的克隆及表达载体的构建 |
| 4.4.3 MSCOPT7和MSCOPT11 铜转运功能酵母异源表达分析 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 紫花苜蓿PMSCOPT7 启动子的克隆与功能分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与试剂 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 启动子序列分析方法 |
| 5.3.2 引物设计与启动子克隆 |
| 5.3.3 表达载体构建及农杆菌转化 |
| 5.3.4 PMSCOPT7启动子的遗传转化 |
| 5.3.5 转基因种子的处理方法 |
| 5.3.6 PMSCOPT7转基因拟南芥T0 代植株的检测 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 MSCOPT7基因组织表达分析 |
| 5.4.2 PMSCOPT7启动子序列的获得 |
| 5.4.3 PMSCOPT7启动子序列预测分析 |
| 5.4.4 PMSCOPT7启动子表达载体的构建与检测 |
| 5.4.5 PMSCOPT7启动子的转化 |
| 5.4.6 PMSCOPT7启动子转基因拟南芥的鉴定 |
| 5.4.7 PMSCOPT7启动子转基因拟南芥的GUS染色 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）MdERF2基因启动子的克隆及其转录活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 ERF转录因子的研究概况 |
| 1.1.1 ERF转录因子 |
| 1.1.2 ERF转录因子的功能 |
| 1.2 启动子的研究概况 |
| 1.2.1 启动子的结构与功能 |
| 1.2.2 启动子的类型 |
| 1.2.3 启动子的研究方法 |
| 1.2.4 ERF基因启动子研究进展 |
| 1.3 植物原生质体 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 苹果MdERF2启动子扩增与瞬时表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 酶及主要试剂 |
| 2.1.4 涉及仪器设备 |
| 2.1.5 培养基及溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 苹果基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 MdERF2 基因启动子的PCR扩增 |
| 2.2.3 MdERF2启动子结合转录因子预测 |
| 2.2.4 PCR产物的琼脂糖凝胶回收 |
| 2.2.5 启动子片段的酶切胶回收 |
| 2.2.6 pRI-ProMdERF2-GFP重组质粒的构建 |
| 2.2.7 重组质粒pRI-ProMdERF2-GUS构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 苹果基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 MdERF2 基因启动子的PCR扩增 |
| 2.3.3 启动子序列测序及序列分析 |
| 2.3.4 MdERF2基因启动子转录因子预测结果 |
| 2.3.5 pRI-ProMdERF2-GFP表达载体的构建 |
| 2.3.6 pRI-ProMdERF2-GUS表达载体的构建 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 番茄果实叶片组织中ProMdERF2 转录活性的GUS染色分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株及质粒 |
| 3.1.3 酶与试剂 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 |
| 3.1.5 溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒转化农杆菌 |
| 3.2.2 重组农杆菌菌液PCR鉴定 |
| 3.2.3 农杆菌侵染液注射番茄组织 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组载体转化农杆菌的PCR鉴定 |
| 3.3.2 GUS活性分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 烟草原生质体中ProMdERF2 转录活性的GFP标记分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株及质粒 |
| 4.1.3 酶与主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器和设备 |
| 4.1.5 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 烟草无菌苗的获得 |
| 4.2.2 愈伤组织诱导 |
| 4.2.3 愈伤组织增殖 |
| 4.2.4 烟草细胞的悬浮培养 |
| 4.2.5 原生质体的制备 |
| 4.2.6 原生质体的活力检测 |
| 4.2.7 转染原生质体 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 烟草愈伤组织的诱导 |
| 4.3.2 烟草愈伤组织的增殖及继代培养 |
| 4.3.3 烟草细胞悬浮培养 |
| 4.3.4 原生质体分离纯化 |
| 4.3.5 原生质体活力检测 |
| 4.3.6 烟草原生质体瞬时表达研究 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 启动子概述 |
| 1.2 植物启动子的研究现状 |
| 1.3 小麦遗传转化 |
| 1.4 杂种优势与雄性不育 |
| 1.5 本课题研究目的和研究内容 |
| 2 小麦组织特异性基因的全基因组分析与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 小麦组织特异性启动子的分离及在植物体中的遗传转化研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 利用组织特异性启动子构建的应用表达载体转化小麦的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 OsPSG076启动子在水稻中的转化研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 水稻OsPSG076基因分析及其表达载体的遗传转化 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 主要研究结果 |
| 7.2 本文的特色与创新点 |
| 7.3 课题展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的论文 |
| 附录2 主要符号与缩略词(按字母顺序) |
（10）用于棉花抗黄萎病育种的根系特异性启动子的克隆与应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物启动子概述 |
| 1.1.1 植物启动子的结构 |
| 1.1.1.1 核心启动子区 |
| 1.1.1.2 上游活性序列 |
| 1.1.2 植物启动子的类型 |
| 1.1.2.1 组成型启动子 |
| 1.1.2.2 组织特异性启动子 |
| 1.1.2.3 诱导型启动子 |
| 1.2 根特异性启动子研究进展 |
| 1.3 现代基因工程技术在棉花抗黄萎病育种中的必要性 |
| 1.4 抗菌肽概述 |
| 1.4.1 抗菌肽的种类 |
| 1.4.2 人工合成抗菌肽基因BTD-S对棉花黄萎病的抗性 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 棉花根特异性启动子的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 引物设计和启动子测序 |
| 2.1.4 实验所用到的软件工具 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 棉花基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 棉花根特异性启动子的克隆 |
| 2.2.3 启动子片段的回收 |
| 2.2.4 连接T载体 |
| 2.2.5 转化大肠杆菌 |
| 2.2.6 重组载体质粒的扩增及提取 |
| 2.2.7 启动子序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 根特异性启动子的获得 |
| 2.3.2 启动子序列的同源性比对 |
| 2.3.3 MIC-3(1204bp)启动子序列分析 |
| 2.3.4 TIP-2(802bp)启动子序列分析 |
| 2.3.5 PRP-2(1287bp)启动子序列分析 |
| 2.3.6 WRKY54(819bp)启动子序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 根特异性启动子的选择 |
| 2.4.2 根特异性启动子的克隆 |
| 第三章 GUS基因表达体系的构建及鉴定 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 工具酶及试验试剂 |
| 3.1.3 引物设计与合成 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 GUS基因表达载体的构建 |
| 3.2.2 冻融法转化农杆菌 |
| 3.2.3 农杆菌重组子的筛选 |
| 3.2.4 拟南芥的种植 |
| 3.2.5 浸花法转化拟南芥 |
| 3.2.6 GUS转基因植株的筛选 |
| 3.2.7 GUS转基因植株的组织化学染色 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GUS基因表达载体的获得 |
| 3.3.2 T_1代转基因拟南芥的分子鉴定 |
| 3.3.3 GUS转基因植株的组织化学染色观察 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 表达载体的构建方法 |
| 3.4.2 根特异性启动子的验证 |
| 第四章 BTD-S抗菌肽基因表达体系的构建及鉴定 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 工具酶和试验试剂 |
| 4.1.3 引物设计与基因序列合成 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 BTD-S抗菌肽基因表达载体的构建 |
| 4.2.2 冻融法转化农杆菌 |
| 4.2.3 农杆菌重组子的筛选 |
| 4.2.4 拟南芥的种植 |
| 4.2.5 浸花法转化拟南芥 |
| 4.2.6 BTD-S转基因植株的筛选 |
| 4.2.7 BTD-S抗菌肽基因的RT-PCR鉴定 |
| 4.2.7.1 转基因植株RNA的提取 |
| 4.2.7.2 cDNA的合成 |
| 4.2.7.3 RT-PCR |
| 4.2.8 转基因植株根系蛋白均浆液的提取 |
| 4.2.9 BTD-S转基因植株抑菌效果鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BTD-S抗菌肽基因表达载体的获得 |
| 4.3.2 T_1代转基因拟南芥的分子鉴定 |
| 4.3.3 BTD-S抗菌肽基因的组织表达活性 |
| 4.3.4 BTD-S转基因植株的离体抑菌效果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
四、根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析（论文参考文献）
- [1]巨球百合细胞壁转化酶基因及其启动子功能初探[D]. 李世琦. 浙江大学, 2021(01)
- [2]黄花苜蓿MfNAC87和MfNAC63基因的功能分析[D]. 贾旭慧. 内蒙古大学, 2021
- [3]三七茉莉酸响应WRKY转录因子的分离与分析[D]. 邱炳玲. 昆明理工大学, 2021(02)
- [4]BpCYP49、BpCYP71基因在白桦脂醇合成中的功能鉴定[D]. 张玉琦. 东北林业大学, 2021
- [5]水曲柳DELLA家族基因应答低温胁迫及参与被动休眠调控研究[D]. 于磊. 东北林业大学, 2021
- [6]橡胶树白粉菌启动子WY172的克隆、功能鉴定及其对HpaXm的调控分析[D]. 殷金瑶. 海南大学, 2020
- [7]全基因组水平紫花苜蓿铜转运（COPT/Ctr）基因家族的鉴定及功能分析[D]. 金小煜. 兰州大学, 2020(01)
- [8]MdERF2基因启动子的克隆及其转录活性分析[D]. 任春涛. 山东理工大学, 2019(02)
- [9]小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究[D]. 苏佩佩. 华中科技大学, 2019
- [10]用于棉花抗黄萎病育种的根系特异性启动子的克隆与应用[D]. 陈亚东. 浙江大学, 2019(01)